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寧波市北侖區(qū)人民醫(yī)院消化內(nèi)科 (浙江 寧波， 315800)

原發(fā)性肝癌是世界上主要的惡性腫瘤之一，其中男性肝癌死亡率排世界第二位，女性排第六位[1]。絕大數(shù)的原發(fā)性肝癌是肝細(xì)胞癌(HCC)，HCC起病隱匿，發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期，常常錯(cuò)過最佳的手術(shù)時(shí)機(jī)，因此化療是主要治療手段之一。化療藥物易出現(xiàn)耐藥，尋求針對肝細(xì)胞癌的高效抗腫瘤藥是研究熱點(diǎn)。越來越多研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白的乙?；{(diào)控與腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)。組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HATs)和組蛋白去乙酰酶(HDACs)共同調(diào)控組蛋白乙?；钠胶?，從而調(diào)控染色體的結(jié)構(gòu)和基因的轉(zhuǎn)錄[2]。有研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)HDAC能夠抑制腫瘤的生長、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[3]。HDAC6是IIb類HDAC主要成員之一，其不同于其他HDACs定位于細(xì)胞核，由于存在核輸出序列，HDAC6主要定位在細(xì)胞質(zhì)中[4]。研究報(bào)道HDAC6在惡性黑色素瘤和肺癌等腫瘤中的過表達(dá)[5,6]，因此，抑制HDAC6的表達(dá)已成為癌癥治療的一個(gè)有吸引力的靶點(diǎn)。本研究探討HDAC6抑制劑ACY1215對順鉑誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株及試劑 人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721細(xì)胞株來源于中國科學(xué)院上海生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究所；ACY1215(Rocilinostat)購于美國Selleck Chemicals公司；順鉑(cisplatin， DDP)購于碧云天生物技術(shù)研究所；RPMI-1640培養(yǎng)基購于美國HyClone公司；胎牛血清購于澳大利亞NQBB生物有限公司； CCK-8試劑盒購于日本同仁公司；細(xì)胞裂解液、上樣緩沖液及BCA試劑盒購于碧云天生物技術(shù)研究所；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購于武漢谷歌生物科技公司；蛋白印跡所有一抗：微管蛋白(α-tubulin)、乙?；⒐艿鞍?Acetyl-α-tubulin)、Bax、Bcl-2和Cyclin D1均購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞增殖率檢測 SMMC-7721細(xì)胞采用含有10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，使用0.25%胰蛋白酶消化傳代。收集處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，按5×103個(gè)/孔接種到96孔板，待細(xì)胞生長至融合度為60%時(shí)加入濃度分別為0、0.01、0.1、1、5、10、20 μmol/L ACY1215或0、0.5、1、2、4、8、16、32 μg/ml DDP刺激，24 h后吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入CCK-8試劑10 μl，放置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育1 h后檢測各孔 490 nm 波長的吸光度(OD)。設(shè)置陰性對照組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，計(jì)算不同藥物濃度下細(xì)胞的增殖率，公式：細(xì)胞增殖率=(OD藥物組/OD對照組)×100%。

1.2.2 誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡 收集處于對數(shù)生長期的SMMC-7721細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液接種于六孔板，并分為空白組、ACY1215組、DDP組以及DDP+ACY1215組。根據(jù)上一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別給予各組細(xì)胞適宜濃度的藥物，處理24 h后利用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.2.3 HDAC6 mRNA表達(dá)水平檢測 上述4組細(xì)胞經(jīng)藥物處理24 h，通過Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR。HDAC6引物序列：正鏈5’-GCCTCAATCACTGAGACCATCC-3’，反鏈5’-GGTGCCTTCTTGGTGACCAACT-3’。內(nèi)參基因GAPDH引物序列：正鏈5’-GAATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3’；反鏈5’-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3’。采用2-ΔΔCT方法計(jì)算HDAC6基因的相對表達(dá)量。

1.2.4 凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測 各組細(xì)胞經(jīng)藥物干預(yù)24 h后吸棄培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌3次。六孔板每孔加入100 μl RIPA裂解液、1 μl PMSF、10 μl磷酸酶抑制劑，置于冰上裂解30 min后12 000 rpm離心15 min，上清即為細(xì)胞總蛋白溶液。采用BCA試劑盒測定各組細(xì)胞總蛋白濃度后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后90 mA恒流電轉(zhuǎn)印90 min，電轉(zhuǎn)后采用5%脫脂奶粉/PBS 溶液室溫封閉PVDF膜1 h，然后加入一抗4℃搖床過夜。次日洗膜，并加入相應(yīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育1 h，洗膜后加入化學(xué)發(fā)光試劑顯影、曝光并分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度藥物對SMMC-7721細(xì)胞增殖率的影響 與未加藥組相比，5 μmol/L ACY1215處理24 h后細(xì)胞活性為92.67%(t=-2.401,P= 0.074)，濃度升高至10 μmol/L后細(xì)胞活性為90.13%(t=-3.115,P= 0.036)，濃度升高至20 μmol/L時(shí)細(xì)胞活性降為78.86%(t=-5.718,P= 0.005)，故本實(shí)驗(yàn)選擇5 μmol/L ACY1215進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。不同濃度DDP分別處理細(xì)胞24 h后細(xì)胞活性呈濃度依賴性抑制，選擇2 μg/ml DDP進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。見圖1。

圖1 不同藥物濃度下SMMC-7721細(xì)胞的增殖率

2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變 將SMMC-7721細(xì)胞接種于六孔板中，分為空白(control)組、ACY1215(5 μmol/L)組、DDP(2 μg/ml)組以及DDP(2 μg/ml)+ ACY1215(5 μmol/L)組。藥物處理24 h后，空白組細(xì)胞呈梭形，緊密生長； ACY1215組細(xì)胞生長良好，緊密貼壁; DDP組可見大量漂浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞數(shù)明顯減少；DDP+ ACY1215聯(lián)合組相比DDP組，漂浮細(xì)胞進(jìn)一步增多，貼壁細(xì)胞數(shù)進(jìn)一步減少。見圖2。

圖2 ACY1215和DDP處理后細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變

2.3 藥物對SMMC-7721細(xì)胞HDAC6基因表達(dá)的影響 與DDP組相比，藥物處理24 h后，DDP+ACY1215組細(xì)胞HDAC6基因表達(dá)水平降低(t=6.256,P= 0.003)，表明ACY1215可抑制HDAC6的表達(dá)。見圖3。

圖3 藥物處理后細(xì)胞的HDAC6基因表達(dá)水平

2.4 藥物對SMMC-7721細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 DDP組細(xì)胞Ace-α-tub蛋白相對表達(dá)量較空白組明顯升高(t=-3.457，P= 0.026)，DDP+ACY1215組細(xì)胞Ace-α-tub蛋白相對表達(dá)水平進(jìn)一步升高(t=-2.877，P= 0.045)。與空白組相比，DDP組細(xì)胞促凋亡蛋白Bax表達(dá)明顯增加(t=-3.005,P= 0.04)，抑凋亡蛋白Bcl-2及增殖蛋白Cyclin D1明顯降低(t=2.824,P= 0.048；t=3.221,P= 0.032)；而與DDP組相比，DDP+ ACY1215組細(xì)胞Bax表達(dá)進(jìn)一步增加(t=-6.854,P= 0.002)，且Bcl-2和Cyclin D1表達(dá)進(jìn)一步降低(t=4.561,P= 0.01；t=2.772,P= 0.05)。見圖4。

圖4 藥物處理后細(xì)胞各蛋白表達(dá)水平的改變

3 討論

肝癌早期癥狀不明顯，發(fā)現(xiàn)時(shí)常常處于中晚期階段，手術(shù)切除療效欠佳，而且易出現(xiàn)術(shù)后復(fù)發(fā)，因此化療是治療肝癌的重要手段之一。由于傳統(tǒng)的化療藥物的不良作用及耐藥性問題，因此尋求高效低毒的治療方法是目前的熱點(diǎn)和難點(diǎn)之一。近年來，表觀遺傳學(xué)調(diào)控和腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系受到廣泛關(guān)注，表觀遺傳學(xué)修飾的失調(diào)與癌癥密切相關(guān)，例如腫瘤抑制基因的超甲基化或低乙?；?，可導(dǎo)致抑癌基因的異常表達(dá)[7]。正常生理情況下，組蛋白乙?；腿ヒ阴；胶鉅顟B(tài)受到組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(HATs)和組蛋白去乙?；?HDACs)共同調(diào)控，HATs可將乙酰輔酶A的乙?；D(zhuǎn)移到組蛋白賴氨酸殘基上，從而改變?nèi)旧w疏松結(jié)構(gòu)，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄，而HDACs具有相反作用[8]。 HDACs家族成員共有18個(gè)，分為四大類，I類包括HDAC1、2、3、8，II類包括HDAC4、5、6、7、9、10，III類包括SIRT1、2、3、4、5、6、7，IV類包括HDAC11[9]。大量研究發(fā)現(xiàn)，HDACs抑制劑具有抗腫瘤作用。在血液系統(tǒng)腫瘤中，已有HDAC抑制劑用于臨床。HDAC抑制劑伏立諾他(SAHA)和貝利司他(PXD-101)已經(jīng)被美國食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)用于治療淋巴瘤，帕比司他 (LBH589)被批準(zhǔn)用于治療多發(fā)性骨髓瘤[10]。有文獻(xiàn)報(bào)道，HDAC6在膀胱癌、惡性黑色素瘤和肺癌中過表達(dá)[4～6]。并且研究顯示，HDAC6抑制劑CAY10603能抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖[6]。

本研究為了探討新型選擇性HDAC6抑制劑ACY1215對肝癌細(xì)胞的作用，觀察ACY1215對順鉑誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721凋亡的影響。結(jié)果顯示，光鏡觀察到ACY1215聯(lián)合順鉑對細(xì)胞增殖的抑制作用明顯高于單用順鉑，而且ACY1215處理后能明顯抑制細(xì)胞HDAC6基因表達(dá)水平。通過檢測凋亡相關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn)，與順鉑組相比，ACY1215聯(lián)合順鉑能明顯下調(diào)Bcl-2和Cyclin D1，上調(diào)Bax。檢測微管蛋白，發(fā)現(xiàn)ACY1215可明顯提高乙?；?tubulin的水平。這些結(jié)果表明，ACY1215可增強(qiáng)順鉑誘導(dǎo)的SMMC-7721細(xì)胞的凋亡。有學(xué)者通過siRNA下調(diào)三種肝癌細(xì)胞系(HLF、PLC/PRF/5、Hep3B)中HDAC6的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)HDAC6表達(dá)下調(diào)后三種細(xì)胞的遷移和侵襲能力均降低[11]。在結(jié)腸癌的研究發(fā)現(xiàn)，HDAC6抑制劑ACY1215和抗腫瘤藥奧沙利鉑聯(lián)合使用可增加結(jié)腸癌細(xì)胞系(HCT116和HT29)凋亡細(xì)胞的數(shù)量，并增強(qiáng)對凋亡通路的影響[12]。在膠質(zhì)瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，HDAC6過表達(dá)可抵抗抗腫瘤藥替莫唑胺(TMZ)介導(dǎo)的細(xì)胞增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)，而下調(diào)HDAC6可抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并促使膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞對TMZ敏感[13]。

綜上所述，HDAC6抑制劑ACY1215可通過促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞系SMMC-7721細(xì)胞凋亡，揭示了HDAC6抑制劑與傳統(tǒng)的化療藥物聯(lián)合用于臨床的肝癌治療可能性，并對進(jìn)一步開發(fā)新的治療方案提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。