孔美蘭 金榕 王佳虹

摘要：文章以尋氏肌蛤為原料制備抗氧化肽，研究木瓜蛋白酶—復合蛋白酶雙酶法酶解尋氏肌蛤的工藝條件。以1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）自由基清除率為測定指標，通過單因素和正交試驗確定雙酶法制備抗氧化肽的最佳條件。結(jié)果顯示：pH6.0，酶比例1∶1，[E]/[S]8%，酶解溫度60℃，酶解時間6.5h為最佳酶解條件。驗證試驗表明，在此條件下，抗氧化肽對DPPH自由基清除率為68.70%。

關鍵詞：尋氏肌蛤；抗氧化肽；雙酶水解；正交設計試驗

中圖分類號：G642.0 文獻標志碼：A 文章編號：1674-9324（2019）29-0106-03

尋氏肌蛤，俗稱薄殼，是潮汕地區(qū)一種常見的低值海洋貝類動物。尋氏肌蛤具有繁殖力強、生長速度快、產(chǎn)量高、分布廣等特點[1]。尋氏肌蛤含有豐富的蛋白質(zhì)、抗氧化肽、鈣等營養(yǎng)成分，營養(yǎng)元素豐富多樣，是一種高蛋白、低脂肪的優(yōu)質(zhì)海產(chǎn)品。尋氏肌蛤在每年夏季大量集中上市，大部分用于鮮食，少量經(jīng)過粗加工成為薄殼米出售[2]。收獲時期，由于鮮食量有限，造成尋氏肌蛤大量積壓，價格降低，導致養(yǎng)殖戶增產(chǎn)不增收。

一、材料和方法

（一）材料和設備

尋氏肌蛤肉粉購于潮州市楓春市場，清洗、采肉，80℃熱風干燥后，粉碎過80目篩成尋氏肌蛤肉粉，于-20℃冷凍保存。1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）由美國Sigma公司提供，木瓜蛋白酶由國藥集團化學試劑有限公司提供，復合蛋白酶由上海金穗生物科技有限公司提供，其余化學試劑均為分析純。PB-10酸度計，賽多利斯儀器有限公司；H1650高速臺式離心機，長沙湘儀儀器有限公司；UV-756分光光度計，上海光譜儀器廠。

（二）實驗方法

1.制備尋氏肌蛤抗氧化肽的工藝流程。尋氏肌蛤→處理蒸熟→脫殼，取肉→粉碎→80目過篩→加水制成懸浮液→調(diào)pH→按不同溫度、pH值、酶比例、加酶量和水解時間進行酶解→95℃滅酶→冷卻，調(diào)pH→離心→上清液為抗氧化肽水解液→測定自由基清除率。

2.水解產(chǎn)物對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除能力的測定方法。稱取DPPH試劑250mg，用95%乙醇溶解，定容轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中，搖勻得質(zhì)量濃度為0.025%的DPPH溶液。將DPPH溶液在室溫條件下靜置10min備用。在空白組中加入2mL樣品待測液與2mL95%乙醇溶液，室溫避光放置30min，在波長517nm處調(diào)零；在對照組中加入2mLDPPH溶液與2mLpH6.5、0.05M磷酸緩沖溶液，室溫避光放置30min，測定在波長517nm處吸光度（Ao）；在實驗組中加入樣品待測液2mL和2mLDPPH，搖勻，室溫避光放置30min，測定波長517nm處吸光度（Ai）。每個樣品重復3次，求得清除率的平均值[3]。

DPPH/%=■×100

3.單因素試驗。（1）[E]/[S]對酶解反應的影響。[E]/[S]分別為2%、4%、6%、8%、10%，酶比例為1∶1，pH6.5，55℃水浴酶解3h，確定最佳酶與底物的質(zhì)量比。

（2）溫度對酶解反應的影響。在[E]/[S]為4%，酶比例為1∶1，pH6.5，水解3h，溫度分別為55℃、60℃、65℃、70℃、75℃，確定酶解反應的最佳溫度。（3）時間對酶解反應的影響。[E]/[S]為4%，酶比例為1∶1，酶解溫度55℃，pH6.5，分別酶解5h、5.5h、6.0h、6.5h、7h，確定最佳酶解時間。（4）pH對酶解反應的影響。將反應物pH分別調(diào)至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，[E]/[S]為4%，酶解溫度55℃，酶比例為1∶1，水解3h后測定自由基的清除率。（5）酶比例對酶解反應的影響。選定溫度為55℃，[E/S]為4%，pH值為6.5，反應時間3h，調(diào)節(jié)木瓜酶與復合酶的比例分別為4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、

1∶4，確定最佳酶比例。

4.正交試驗。在單因素試驗基礎上，通過五因素、四水平正交試驗進一步優(yōu)化試驗條件，表1為試驗因素水平表。

二、結(jié)果與分析

（一）單因素試驗結(jié)果分析

1.酶用量對酶解反應的影響。當?shù)孜锍渥銜r，增加酶用量可提高底物與酶的有效接觸概率，進而使DPPH自由基清除率增加，因此酶用量在2%—6%時，自由基清除率隨酶用量增大而升高；由圖1可知酶用量為6%時清除率達到最高，此時提取效果最佳；當酶用量超過6%時自由基清除率下降，此時酶用量的增加促進新生產(chǎn)的抗氧化肽進一步降解，使得酶解產(chǎn)物抗氧化性下降。故最佳的酶用量是6%。

2.水解溫度對自由基清除率的影響。由圖2可知，在55℃—60℃范圍內(nèi)清除率與溫度成正相關，以60℃水解效果最佳。因為溫度會影響酶的活性，每種酶都有其最適溫度，當溫度小于60℃時，溫度升高會靠近最適溫度，DPPH自由基清除率增大；60℃—75℃范圍內(nèi)，清除率呈降低趨勢，此時溫度高于組合酶最適溫度，酶蛋白變性甚至失活，酶解產(chǎn)物抗氧化肽含量減少，DPPH自由基清除率減小。故最佳的水解溫度是60℃。

3.水解時間對自由基清除率的影響。由圖3可知，酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率隨酶解時間的變化趨勢是先增大后減小。在5—6.5h隨著提取時間的延長，自由基清除率顯著升高，時間大于6.5h后，自由基清除率迅速下降，這是因為在反應初期，抗氧化肽含量少，反應速率快；隨著酶解時間的增加，原先產(chǎn)生的抗氧化肽被進一步降解，使得抗氧化肽含量進一步下降。故該實驗最佳水解時間為6.5h。

4.pH對抗氧化肽提取的影響。由圖4可知，自由基清除率隨著pH的增大呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在pH6.5時清除率達到最高。這是因為木瓜蛋白酶和復合蛋白酶都屬于中性偏弱酸性酶，因此pH6.5時顯示最大活性。

5.酶比例對自由基清除率的影響。由圖5可知，自由基清除率隨著酶比例的改變呈現(xiàn)雙峰形變化趨勢，這可能是因為每種酶都有專一的酶切位點，兩種酶的專一性不同，能更多地切斷多肽鏈，因而可以提高水解度。從圖5可知，最佳酶比例為2∶1。

（二）正交試驗結(jié)果分析

正交試驗結(jié)果如表2所示。由表2可知，酶解溫度在尋氏肌蛤抗氧化肽提取中影響最大，其主次順序為A>C>D>B>E。根據(jù)正交試驗結(jié)果確定抗氧化肽最佳提取工藝條件組合為A2B2C3D3E3，即酶解溫度為60℃，pH6.0，酶用量為8%，提取時間6.5h，酶比例1∶1。

（三）驗證試驗

為了檢測正交試驗結(jié)果的可靠性，采用優(yōu)化條件A2B2C3D3E3進行驗證試驗，測得自由基清除率平均值為68.7%，并且3次試驗清除率均高于正交試驗的16個工藝條件，故試驗結(jié)果可靠。木瓜蛋白酶與復合蛋白酶雙酶法提取尋氏肌蛤中抗氧化肽最佳工藝條件為：溫度60℃，pH6.0，酶用量8%，木瓜酶與復合酶比例1∶1，提取時間6.5h。在此條件下，DPPH自由基平均清除率達到68.7%。

三、結(jié)論

通過單因素和正交優(yōu)化試驗，確定了雙酶法水解尋氏肌蛤蛋白制備抗氧化肽的最佳條件為：酶解溫度為60℃，pH6.0，酶用量為8%，酶比例1∶1，提取時間6.5h，這時自由基清除率最高，達到了68.7%。本研究制得的尋氏肌蛤雙酶水解產(chǎn)物具有較好的DPPH自由基清除能力，具有一定的開發(fā)價值。本研究為提取尋氏肌蛤中天然抗氧化肽提供了理論基礎。

參考文獻：

[1]張正道.尋氏肌蛤的人工增殖[J].福建水產(chǎn)，1986，（2）：27.

[2]蔡英亞.尋氏肌蛤的養(yǎng)殖和利用[J].水產(chǎn)與教育，1975，（1）：9-11.

[3]田友昊.扇貝裙邊中抗氧化肽和?；撬岬木C合提取工藝研究[D].青島：中國海洋大學，2015.