尹浩月，鄧久鵬，馬麗娟，田宜文

（華北理工大學口腔修復科，河北唐山 063000）

1 引 言

由腫瘤、外傷、交通事故等造成的口腔頜面部骨組織缺損是臨床常見癥狀之一，如何修復大量骨缺損一直是臨床治療的難題[1-2]。為了更好地解決這一問題，制備出具有三維多孔支架作為骨組織替代品的骨組織工程技術受到廣泛的關注[3]。目前，應用于骨組織工程領域的材料主要包括金屬、陶瓷、高分子聚合物和復合材料[4]，雖然研究人員已經做了大量的實驗，但是目前為止尚未制備出一種可以完全替代人類骨骼的理想的骨移植材料[5]。聚乳酸（PLA）具有良好的機械和物理性能以及優(yōu)異的生物相容性，是目前被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準用于醫(yī)療用途的少數聚合物之一，廣泛應用于生物醫(yī)療領域[6]。本實驗采用冷凍干燥法，制備PLA多孔支架，為組織工程的研究提供實驗依據。

2 材料與方法

2.1 材料和儀器

聚乳酸（PLA，美國）；1，4-二氧六環(huán)（分析純，天津）；二氯甲烷（分析純，天津）；無水乙醇（分析純，天津）；L929細胞株（上海細胞庫提供）；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司，美國）；PBS緩沖液；噻唑藍（MTT，Sigema，美國）；二甲基亞砜（DMSO，Sigema，美國）；酶標儀（上海永創(chuàng)）；冷凍干燥機（比朗，上海）；掃描電子顯微鏡（S-4800，日本）；電子萬能試驗機（AGS-X，日本）。

2.2 方法及分組

2.2.1 實驗分組 將1，4-二氧六環(huán)與二氯甲烷按體積比隨機分為3組（n=5）：A組，95：5；B組，90：10；C組，85：15。

2.2.2 實驗方法 將0.5 g PLA在60℃真空干燥箱內充分干燥24 h后加入到4 mL有機溶劑（1，4-二氧六環(huán)/二氯甲烷，v/v）中，有機溶劑按體積比分為3組（n=5），見2.2.1。恒溫攪拌至透明溶液后，放入-20℃冰箱內冷凍1 h后，冷凍干燥24 h。將樣品放入無水乙醇中浸泡24 h，鼓風干燥箱內干燥24 h后，檢測樣品的表面形貌、孔隙率、壓縮強度及細胞毒性。

2.2.3 PLA多孔支架材料浸提液制備 浸提標本為本實驗所制備的支架材料，樣品經過紫外線照射72 h滅菌后，按重量與含有10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基體積比為0.1 g：1 mL比例浸潤，于37℃恒溫箱中靜置48 h，取出材料過濾除菌，獲取浸提液，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 評價方法

2.3.1 支架形貌觀察 采用掃描電鏡（S-4800，日本日立）對支架表面形貌進行觀察，孔徑大小及連通性。

2.3.2 孔隙率的檢測 采用重量法測量復合多孔支架的孔隙率，每組測試樣品3個，計算公式如下：

式中ε為支架孔隙率；WS為支架質量；W1為比重瓶裝滿乙醇后的總質量；W2為組織支架完全排出氣泡后充滿乙醇后的質量；W3為把支架從乙醇中取出后剩余物的總質量。

2.3.3 力學性能的檢測 采用萬能試驗機進行抗壓強度的測試。將樣品切割成直徑10 mm，高10 mm的圓柱體，按照GB-T 1041-1992的標準測試多孔支架的壓縮強度。加載速度為5 mm/min，每組試件為3個樣品。

2.3.4 MTT法檢測細胞毒性 取對數生長期的L929細胞制備成密度為1×104個/mL細胞懸液，接種于96孔板，每孔100μL，置于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后，吸去原培養(yǎng)基，PBS緩沖液洗滌2次。實驗組分別加入100μL浸提液，陰性對照組加入100μL完全培養(yǎng)基，陽性對照組加入0.64%苯酚溶液，實驗組和對照組分別設置5個副孔，繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)至1、3和5 d后，加入20μL MTT液，培養(yǎng)4 h后棄去原培養(yǎng)液，每孔加入150μL DMSO，低速搖床避光震蕩10 min，用酶標儀于570 nm波長測定吸光度（A）值，取平均值。

2.3.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件分析處理，用±s表示多組間比較，采用方差分析并進行兩兩比較。方差齊用LSD檢驗，方差不齊則用Dunnett'sT3檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 掃描電鏡觀察結果

圖1為放大200倍的掃描電鏡圖。由圖可知，采用真空冷凍干燥法可以制備出PLA多孔支架材料。PLA多孔支架材料具有大小不一的孔隙結構，孔徑大小在10～200μm之間，孔隙連通性良好。圖1（a）為A組掃描電鏡圖，孔主要為長圓形和圓形，孔徑大小不一，孔隙較密，但是有封閉孔隙存在；圖1（b）為B組掃描電鏡圖，圖中孔主要為長橢圓形；圖1（c）為C組掃描電鏡圖，圖中大孔的孔壁上面存在較多的小孔，孔壁粗糙。

圖2為放大500倍的掃描電鏡圖。圖2（a）為A組掃描電鏡圖，圖中孔徑較大，孔壁較粗糙，但存在封閉式的孔隙；圖2（b）為B組掃描電鏡圖，圖中孔徑主要有圓形和橢圓形，孔壁凹凸不平，孔壁內有小孔；圖2（c）為C組掃描電鏡圖，圖中孔徑較均勻，孔壁粗糙，孔壁內小孔數量較多。

圖1 PLA支架SEM 圖（×200）Fig 1 SEM images of PLA scaffolds（×200）

圖2 PLA支架SEM 圖（×500）Fig 2 SEM images of PLA scaffolds（×500）

3.2 孔隙率測定結果

表1為PLA多孔支架材料孔隙率的測定結果。由表1可以看出，采用冷凍干燥法制備出的PLA多孔支架材料的孔隙率在（68.97±0.12）%～（73.75±0.47）%之間，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表1 PLA支架孔隙率Table 1 Porosity of PLA scaffolds

3.3 抗壓強度測試結果

由表2可以看出，PLA多孔支架材料的平均抗壓強度在（2.90±0.53）～（4.11±0.05）MPa之間，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3.4 細胞毒性檢測結果

細胞毒性檢測顯示（見圖3），在觀察期間內陰性對照組與實驗組細胞增值良好，而陽性對照組細胞幾乎不增長，表明支架材料未顯示出任何毒性，符合體外細胞毒性實驗的要求。

表2 PLA支架的抗壓強度Table 2 Compressive strength of PLA scaffolds

圖3 MTT法檢測細胞增殖情況Fig 3 Cell proliferation detected by MTT method

4 討論

在組織工程中，支架材料主要作為骨修復中支持細胞生長和營養(yǎng)物質交換的初始結構，理想的支架材料除了具有生物相容性、可降解性和良好的力學性能，還應具有較高的孔隙率，孔隙介于100～800μm之間的孔隙率高達50%及以上，為細胞粘連和生長以及營養(yǎng)物質的交換提供了微觀環(huán)境，并且在松質骨的范圍內具有足夠的機械強度[7-8]。

聚乳酸（PLA）又名聚丙交酯，化學式為（C3H6O3）n是一種在生物體內可完全降解為二氧化碳和水的高分子材料，因其具有低密度，易加工，良好的機械性能及生物相容性，獨特的抗菌作用以及電活性特性，與人骨相似，再加之來源廣泛等優(yōu)點而備受青睞，被廣泛應用于生物組織工程醫(yī)學領域[9-10]。

本實驗以PLA為原料制備出的組織支架，應用掃描電鏡觀察具有三維孔隙結構。由圖2可以看出，大孔孔內壁粗糙不平不僅增加了比表面積，更有利于細胞的粘附及生長；微孔的存在賦予了支架良好的孔連通性，微孔形成的通道更有利于組織營養(yǎng)物質的運輸以及細胞代謝產物的交換。微孔的存在同樣可以影響支架應力的大小和分布，進而影響支架的承重能力?？紫堵蕶z測結果顯示（見表1），制備的PLA多孔復合支架材料孔隙率在（68.97±0.12）% ～（73.75±0.47）%，強度在（2.90±0.53）～（4.11±0.05）MPa，滿足天然松質骨機械強度的基本要求[11]。由表1可知，隨著孔隙率的升高，抗壓強度逐漸降低。這是由于孔隙的增加導致了支架材料實體體積的減小，進而減少了支架材料的承重面積，由此可見，孔隙率的增加直接影響了抗壓強度的大小，導致支架材料的抗壓強度降低，蔣學泉等[12]的研究也得出了類似的結果。林建華[13]和徐文峰[14]同樣采用冷凍干燥法制備聚乳酸支架材料，在體外細胞毒性實驗測定結果顯示支架材料具有良好的細胞相容性，符合支架材料安全無毒的基本要求。

當前，制備多孔支架材料的技術主要包括溶劑澆鑄/粒子瀝慮、相分離技術、冷凍干燥技術以及氣體發(fā)泡技術等[15]。冷凍干燥技術的原理是將聚合物溶液與水或有機溶液在低溫條件下冷凍結晶而得到聚合物相和溶劑固相，進而在真空條件下使溶劑固相升華去除溶劑得到多孔結構。本實驗所用的有機溶劑因低溫冷凍結晶溫度的不同而形成相分離，致使在低溫條件下溶劑結晶與聚合物形成固液相分離，然后在溶劑結晶點溫度以下真空去除溶劑，從而形成多孔結構。相比較于其它方法，冷凍干燥技術主要有以下優(yōu)點：在制備支架過程中最大限度的保留了材料原有的理化性能；致孔劑為有機溶劑而并非氯化鈉、冰粒子和糖球等顆粒狀物質，有效避免了致孔劑的殘留，減少了封閉孔隙的出現；制備工藝相對簡單，效率高等。根據有關報道顯示，采用冷凍干燥技術制備的支架材料對生物活性并不產生負面影響[16]，本研究的體外細胞毒性檢測結果也證明這一點。

本研究采用真空冷凍干燥技術成功制備出符合骨組織要求的PLA多孔支架材料。