黃賽林，阮子強(qiáng)，向璇

(廣東三九腦科醫(yī)院，廣東 廣州 510000)

新型隱球菌腦膜炎（CNM）是由新型隱球菌感染腦膜和（或）腦實(shí)質(zhì)所致[1]，屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)亞急性或慢性炎癥性疾病。常見(jiàn)首發(fā)癥狀以頭痛、頭暈、嘔吐和發(fā)熱為主，由于其顱內(nèi)感染時(shí)癥狀的不典型性及治療的不規(guī)范，誤診率及病死率仍較高[2]。近年來(lái)隨著廣譜抗生素、激素、免疫抑制劑的廣泛或不適當(dāng)應(yīng)用，免疫缺陷性疾病及器官移植患者的增加，該病呈增長(zhǎng)趨勢(shì)[3]。在流行病學(xué)上，新型隱球菌屬于一種機(jī)會(huì)性感染真菌，病原體多從呼吸道吸入，形成肺部病灶后經(jīng)血液循環(huán)播散于腦膜。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，隱球菌性腦膜炎發(fā)生率和死亡率在發(fā)達(dá)國(guó)家達(dá)到10%～30%，在發(fā)展中國(guó)家可達(dá)到50%～100%[3]。因此，臨床早期快速準(zhǔn)確地診斷對(duì)于隱球菌腦膜炎的鑒別和診斷很有必要。目前墨汁染色對(duì)新型隱球菌的實(shí)驗(yàn)診斷依然為一種有效的經(jīng)典診斷方法，但需較多標(biāo)本量離心處理后收集沉淀，制片墨汁負(fù)染后進(jìn)行鏡檢，因而標(biāo)本處理繁瑣、耗時(shí)，且結(jié)果判斷主觀性較大。真菌培養(yǎng)法為新型隱球菌檢測(cè)的基本方法，但敏感性低，耗時(shí)較長(zhǎng)。上世紀(jì)80年開(kāi)始乳膠凝集方法檢測(cè)血清和腦脊液中新型隱球菌莢膜多糖的定性或半定量的方法，但操作步驟繁瑣，結(jié)果判定主觀性也較大[4]。膠體金方法是繼乳膠凝集方法后建立的檢測(cè)新型隱球菌的方法，IMMY公司于2009年研發(fā)了膠體金方法試劑盒，其在常溫下性狀穩(wěn)定，技術(shù)要求低，操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)時(shí)間短，結(jié)果易判讀。國(guó)內(nèi)臨床檢測(cè)和流行病學(xué)研究多使用乳膠凝集方法進(jìn)行檢測(cè)，而近年來(lái)采用膠體金方法進(jìn)行檢測(cè)新型隱球菌感染診斷逐漸得到推廣[5]。為了客觀評(píng)價(jià)目前新型隱球菌檢測(cè)方法在臨床檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值，并探索降低假陽(yáng)性的方法，本研究以墨汁染色、隱球菌培養(yǎng)、膠體金方法進(jìn)行敏感度和特異性比較，并分析新型隱球菌診斷方法在腦膜炎鑒別診斷中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 根據(jù)病史、臨床癥狀、體征、實(shí)驗(yàn)室檢查和病原學(xué)檢查(墨汁涂片或培養(yǎng)陽(yáng)性)以及抗生素和抗結(jié)核藥物治療無(wú)效，改用抗真菌藥物治療有效，確診為隱球菌性腦膜炎47例（其中21例經(jīng)腦脊液真菌培養(yǎng)，39例經(jīng)墨汁染色確診的隱球菌性腦膜炎，其余8例是病例跟蹤及后期臨床動(dòng)態(tài)觀察確診）（診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)2010年中國(guó)真菌學(xué)雜志發(fā)表的《中國(guó)隱球菌診治專(zhuān)家共識(shí)》）。病例來(lái)自于2016年1月至2017年12月廣東三九腦科醫(yī)院神經(jīng)科住院患者，其中男34例，女13例，年齡20～70歲。所有腦脊液標(biāo)本均為第一次腰穿留取均在抗真菌藥物使用之前。對(duì)照組共60例（其中腦脊液常規(guī)生化正常非神經(jīng)系統(tǒng)感染20例、經(jīng)臨床確診為結(jié)核性腦膜炎的腦脊液20例、及化膿性腦膜炎為細(xì)菌感染且無(wú)真菌感染20例。

1.2 儀器和試劑 隱球菌抗原檢測(cè)試劑盒（膠體金免疫層析法）為美國(guó)IMMY有限公司產(chǎn)品；印度墨汁染液由貝索公司提供。隱球菌真菌肉湯為廣州市迪景微生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 隱球菌抗原膠體金法 依據(jù)試劑產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，試管中加入1滴樣本稀釋液，腦脊液經(jīng)過(guò)離心（3000r/min）10min后取上清40μl加入試管， 插入試紙條，10min后讀取結(jié)果。出現(xiàn)一條質(zhì)控線為陰性，質(zhì)控線與檢測(cè)線同時(shí)出現(xiàn)為陽(yáng)性，只出現(xiàn)檢測(cè)線而無(wú)質(zhì)控線則檢測(cè)失敗。

1.3.2 隱球菌墨汁染色鏡檢 根據(jù)墨汁染色標(biāo)準(zhǔn)操作，墨汁染液選用印度墨汁，將3ml以上的腦脊液離心（3000r/min）10min，沉渣以 5：1 比例與墨汁混勻鏡檢，在黑色背景下可見(jiàn)到透亮的菌體和寬厚莢膜。

1.3.3 隱球菌培養(yǎng)和鑒定 依據(jù)第四版 《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》，培養(yǎng)腦脊液3～5ml接種到真菌肉湯，陽(yáng)性標(biāo)本接種沙堡弱葡萄糖瓊脂(SDA)培養(yǎng)基35℃培養(yǎng)2～5d分純后進(jìn)行菌種的鑒定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 隱球菌膠體金法、墨汁染色和隱球菌培養(yǎng)試驗(yàn)的靈敏度及特異性 47例最終被確診的隱球菌腦膜炎中，隱球菌膠體金法靈敏度100%，特異性98.33%；墨汁染色靈敏度65.95%，特異性98.33%；隱球菌培養(yǎng)靈敏度63.63%，特異性100%。

2.2 隱球菌膠體金法、墨汁染色和隱球菌培養(yǎng)試驗(yàn)在隱球菌組和對(duì)照組中的檢測(cè)結(jié)果 在隱球菌組中，隱球菌膠體金法陽(yáng)性47例、墨汁染色陽(yáng)性31例、隱球菌培養(yǎng)21例（其中共33例培養(yǎng)，陽(yáng)性21例結(jié)果均為新型隱球菌）；對(duì)照組中除化膿性腦膜炎腦脊液中，隱球菌膠體金法陽(yáng)性1例、墨汁染色陽(yáng)性1例，隱球菌膠體金法、墨汁染色、隱球菌培養(yǎng)其余均無(wú)陽(yáng)性結(jié)果。見(jiàn)表1。

表1 膠體金法、墨汁染色和培養(yǎng)試驗(yàn)在各組中的檢測(cè)結(jié)果

3 討論

新型隱球菌腦膜炎的患者，典型表現(xiàn)為重度的頭痛；頭痛可持續(xù)數(shù)周至數(shù)月，伴有精神狀態(tài)、性格的改變，發(fā)熱，嗜睡和昏迷。多數(shù)資料顯示隱球菌感染和使用廣譜抗生素、激素、免疫抑制藥的廣泛或不適當(dāng)有關(guān)，以及免疫缺陷性疾病及器官移植患者的幾率高[6]，但是我院首發(fā)癥狀按頭痛在神經(jīng)內(nèi)科就診患者病史中禽鳥(niǎo)類(lèi)接觸者占多，特別是鴿子飼養(yǎng)者，隱球菌主要在鴿糞和被鴿糞污染的土壤中大量存在[7]，并無(wú)其他系統(tǒng)疾病引發(fā)，但是因?yàn)閿?shù)據(jù)有限，無(wú)法進(jìn)行流行學(xué)統(tǒng)計(jì)。臨床癥狀與結(jié)核性腦膜炎不易鑒別，易誤診為結(jié)核性腦膜炎，對(duì)于陰性腦脊液檢查結(jié)果，臨床又高度懷疑隱球菌顱內(nèi)感染患者，不能輕易排除該病[8]。隱腦患者的腦脊液可呈典型的 “三高一低”腦膜炎表現(xiàn)，但無(wú)隱球菌性腦膜炎的特異性。診斷除了臨床表現(xiàn)外，目前臨床常用檢查方法主要包括腦脊液常規(guī)、生化等一般檢查、隱球菌莢膜多糖抗原檢測(cè)、腦脊液墨汁染色、真菌培養(yǎng)和影像學(xué)檢查等。墨汁染色是一種傳統(tǒng)的方法，可把隱球菌莢膜染成透明。印度墨汁染色的敏感性和特異性不一，常依賴于觀察者的經(jīng)驗(yàn)，在化膿性腦膜炎中有1例因莢膜抗原呈現(xiàn)假陽(yáng)性，裂解的白細(xì)胞被誤認(rèn)為真菌[9]。隱球菌培養(yǎng)和墨汁染色陽(yáng)性是隱球菌性腦膜炎的確診依據(jù)，但真菌培養(yǎng)和鑒定的周期較長(zhǎng)(3～7d)，且陽(yáng)性率較低(55%～80%)[10]。 本研究結(jié)果顯示隱球菌腦膜炎患者初次腰穿，膠體金法較上述2種“金標(biāo)準(zhǔn)”法更為敏感，可達(dá)100%，適應(yīng)于臨床排除診斷，對(duì)于初次腰穿腦脊液膠體金法陽(yáng)性，而腦脊液涂片、腦脊液真菌培養(yǎng)陰性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者，應(yīng)高度警惕隱球菌顱內(nèi)感染的可能，需多次腰穿查找病原體。表1示對(duì)照組中1例臨床確診為化膿性腦膜炎患者，膠體金法陽(yáng)性，多次腦脊液培養(yǎng)均未檢出隱球菌但是培養(yǎng)出細(xì)菌，提示膠體金法檢測(cè)新型隱球菌腦膜炎雖然有很好的敏感性，但也可能出現(xiàn)假陽(yáng)性。膠體金檢測(cè)方法腦脊液與抗原可能交叉反應(yīng)，易被誤診為新型隱球菌性腦膜炎，需結(jié)合其它檢測(cè)方法進(jìn)行診斷，原因尚須進(jìn)一步研究[11]。我們認(rèn)為，隱球菌莢膜多糖抗原的膠體金免疫層析法最大價(jià)值是對(duì)新型隱球菌腦膜炎的早期診斷提供思路、線索和依據(jù)。依據(jù)三種方法各自局限性，聯(lián)合三種方法檢測(cè)值得臨床推廣。

隱球菌莢膜多糖抗原的檢測(cè)，根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，具有高達(dá)90%以上的敏感度及特異度，已經(jīng)作為隱球菌性腦膜炎確診的依據(jù)[12，13]。跟蹤病例發(fā)現(xiàn)，大部分患者莢膜抗原轉(zhuǎn)陰長(zhǎng)達(dá)半年以上，部分患者長(zhǎng)期治療后抗原卻一直存在體內(nèi)。研究莢膜抗原檢測(cè)對(duì)疾病預(yù)后價(jià)值的評(píng)估以及抗原檢測(cè)轉(zhuǎn)陰或者滴度效價(jià)的變化后的停藥節(jié)點(diǎn)等問(wèn)題[14]，還有待于進(jìn)一步擴(kuò)大臨床病例進(jìn)行深入研究。