章思思，張聞，周海濱，陳媛，周廣亮

(寧波瑞源生物科技有限公司，浙江 寧波330200)

降鈣素原（PCT）是一種無(wú)激素活性的糖蛋白，是降鈣素前肽物質(zhì)，正常情況下由甲狀腺C細(xì)胞產(chǎn)生，含量極低。當(dāng)嚴(yán)重細(xì)菌、真菌、寄生蟲感染以及膿毒癥和多臟器功能衰竭時(shí)，它在血漿中的水平升高[1-3]。自身免疫、過(guò)敏、局部有限的細(xì)菌感染、輕微的感染和慢性炎癥不會(huì)導(dǎo)致其升高或僅輕微升高。血中PCT的升高可能與細(xì)菌內(nèi)毒素脂多糖、細(xì)胞因子誘導(dǎo)體內(nèi)甲狀腺外組織產(chǎn)生大量PCT有關(guān)[4-6]。

PCT反映了全身炎癥反應(yīng)的活躍程度．目前已成為臨床全身性細(xì)菌感染診治過(guò)程中必不可少的項(xiàng)目之一，從產(chǎn)生和消除的動(dòng)力學(xué)過(guò)程來(lái)看，PCT也是最適合用作臨床診斷指標(biāo)的，用于監(jiān)測(cè)抗生素治療效果[7]。另外，PCT濃度變化對(duì)新生兒敗血癥、重癥肺炎、支氣管哮喘、術(shù)后感染等疾病的預(yù)警、鑒別診斷、病程監(jiān)控和預(yù)后都有指導(dǎo)意義[8，9]。

現(xiàn)在市場(chǎng)上應(yīng)用較多的PCT的檢測(cè)方法：酶聯(lián)免疫吸附法、化學(xué)發(fā)光法、膠體金試紙條法。然而，酶聯(lián)免疫吸附法所需檢測(cè)的時(shí)間較長(zhǎng)；化學(xué)發(fā)光法的成本較高；膠體金法不能對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行定量。因此，具有較強(qiáng)的特異性，而且操作簡(jiǎn)便、測(cè)試時(shí)間短、重復(fù)性好的熒光免疫層析定量法是體外診斷行業(yè)中的發(fā)展趨勢(shì)。本研究基于熒光免疫定量測(cè)試技術(shù)，干化學(xué)層析法，建立一種快速定量檢測(cè)PCT的方法，對(duì)其性能進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)價(jià)，并以降鈣素原檢測(cè)試劑盒 （VIDAS BRAHMS PCT酶聯(lián)熒光分析技術(shù)）做為參比試劑行了對(duì)比驗(yàn)證。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料

1．1．1 材料與樣本 收集2017年3月，寧波市第三醫(yī)院125例血清標(biāo)本。收集2017年8月，江西省人民醫(yī)院同一病人的血清、血漿和全血樣本各50例。PCT抗原、鼠抗人PCT單克隆抗體（hytest）；PCT多克隆抗體(Hytest)；羊抗兔IgG抗體(武漢艾美捷)；兔 IgG(杭州隆基)；硝酸纖維素膜（NC 膜）、吸水紙(上海良信)；PVC 底板(上海捷寧)；熒光粒子(Life Technologies Corporation)；Tris-HCL、NHS、 酪蛋白 (sigma)；BSA(Moregate Bio Tech)；EDC(TCI)；Tween20(AMRESCO)；MES(羅氏診斷產(chǎn)品)；阻斷劑(杭州曼尼)；疊氮鈉(西安慶峰醫(yī)藥化工)．臺(tái)式高速冷凍型微量離心機(jī)(大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器)；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) (寧波市先倡電子)；三維平面點(diǎn)膜噴金儀、微電腦自動(dòng)斬切機(jī)、壓殼機(jī)(上海金標(biāo))；電子天平(梅特勒-托利多)。

1．2 制備方法

1．2．1 熒光微球抗體標(biāo)記物的制備 取0．1ml的熒光粒子，清洗 3次(50mM MES清洗)后，加入 0．7mg的活化劑 EDC和0．7mgNHS，混勻，置于 37℃活化20min．離心，以質(zhì)量比(熒光粒子：抗體)8．33：1 的最終濃度加入鼠抗人PCT單克隆抗體，置于4℃，交聯(lián)12h。 再加入0．066g的BSA，置于37℃封閉 1h。封閉結(jié)束后，10℃下，15000r/min，離心 30min，用1ml緩沖液保存(50mM MES)，即為降鈣素原熒光標(biāo)記抗體．質(zhì)控?zé)晒鈽?biāo)記抗體的制備方式僅改變抗體為羊抗兔IgG。

1．2．2 檢測(cè)緩沖液配置 粒子稀釋液：Tris-HCL pH8．5、0．75% 酪 蛋 白 、0．5%Tween20、0．9%NaCL、0．1%疊氮鈉．以降鈣素原熒光標(biāo)記抗體終濃度1/200，質(zhì)控?zé)晒鈽?biāo)記抗體終濃度1/1500，阻斷劑1/60的比例，其他以粒子稀釋液補(bǔ)充，配置檢測(cè)緩沖液。

1．2．3 檢測(cè)線及質(zhì)控線的制備 取抗PCT多克隆抗體終濃度分別為 3．0mg/ml，噴量 1．0μl/cm，劃膜儀平臺(tái)移動(dòng)速度100mm/s在硝酸纖維素膜上制備檢測(cè)線；取兔IgG終濃度為5mg/ml，用同樣方法制備質(zhì)控線，室溫干燥．檢測(cè)線與質(zhì)控線在NC膜上之間的距離約 4．0±0．1mm，線的寬度約 0．8～1．0mm；前后均勻；并置溫度 15～26℃；濕度≤30%；干燥24h以上。

1．2．4 組裝 在溫度15～30℃； 濕度≤25%條件下，將樣品墊、硝酸纖維素膜、吸水紙、PVC底板等物組裝，要求材料附著牢固，膜條切割應(yīng)寬為4．0±0．1mm，然后裝入塑料殼。

1．3 評(píng)價(jià)方法

1．3．1 準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)(回收實(shí)驗(yàn))參照《體外診斷試劑分析性能評(píng)估(準(zhǔn)確度-回收實(shí)驗(yàn))技術(shù)審查指導(dǎo)原則》[10]，以1/9的體積混合，制備待回收分析樣本和基礎(chǔ)樣本，對(duì)樣本進(jìn)行5次重復(fù)測(cè)定，取其均值計(jì)算回收率，回收率（%）=（回收樣本-基礎(chǔ)樣本）/加入濃度X100。其回收率應(yīng)在[85%，115%]，才滿足降鈣素原試劑盒的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

1．3．2 精密度評(píng)價(jià) 參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)EP15-A3文件[11]，連續(xù)測(cè)定高、低值樣本20次，計(jì)算變異系數(shù)，以此作為批內(nèi)精密度．每天檢測(cè)一批兩個(gè)濃度水平的樣本，每批重復(fù)2次，連測(cè)20d，通過(guò)統(tǒng)計(jì)計(jì)算日間精密度。

1．3．3 分析特異性(抗干擾)評(píng)價(jià) 取多份樣本，混成兩份不同濃度的混合樣本，在混合樣本中添加生理鹽水和不同濃度的干擾物，分別配制對(duì)照樣本和干擾樣本，干擾樣本配制成由生理至病理水平各種干擾物，各項(xiàng)目梯度值詳見2．3。每樣本重復(fù)測(cè)試5次，計(jì)算樣本和對(duì)照樣本的測(cè)值偏差。干擾物測(cè)值偏差＜20%視為無(wú)干擾。

1．3．4 線性范圍評(píng)價(jià) 用超過(guò)線性范圍高值濃度的抗原，按等比例稀釋至濃度0．1ng/ml以下，共5點(diǎn)(Xi)．對(duì)每一濃度的樣本各重復(fù)檢測(cè)5次，計(jì)算檢測(cè)結(jié)果平均值(Yi)，以(Xi)為自變量，(Yi)為因變量求出線性回歸方程，計(jì)算線性相關(guān)系數(shù)r，稀釋濃度(Xi)代入線性回歸方程，計(jì)算Yi的估計(jì)值及Yi與估計(jì)值的相對(duì)偏差或絕對(duì)偏差．降鈣素原檢測(cè)試劑盒行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)要求線性相關(guān)系數(shù)|r|應(yīng)不小于0．990。

1．3．5 檢測(cè)限 用0值抗原和低值抗原作為樣本進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)測(cè)定10次．計(jì)算信號(hào)T/C平均值(x)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，根據(jù)0值和低值濃度結(jié)果進(jìn)行兩點(diǎn)回歸擬合得出一次方程，將x+3SD代入方程計(jì)算得出對(duì)應(yīng)的濃度值即為最低檢測(cè)限．降鈣素原檢測(cè)試劑盒行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定：生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)提供試劑盒的檢出限不高于 0．2ng/ml。

1．3．6 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 在試劑第6個(gè)月、第12個(gè)月、第18個(gè)月、第21個(gè)月時(shí)，分別做回收、批內(nèi)CV、線性、檢測(cè)限試驗(yàn)，分析試驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果判定試劑盒的穩(wěn)定性。

1．3．7 鉤狀效應(yīng)試驗(yàn) 本試劑考慮因標(biāo)記或包被抗體量不足，抗原過(guò)剩導(dǎo)致的后帶效應(yīng)．參考臨床可能達(dá)到的陽(yáng)性高值，采用高濃度的降鈣素原純品進(jìn)行梯度稀釋， 濃度分別為(ng/ml)：50、100、200、300、400、500，每種濃度的抗原重復(fù)測(cè)試5次，以響應(yīng)值(T/C)作為判斷依據(jù)。

1．3．8 臨床標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果 根據(jù)CLSI EP9-A3文件[12]，同時(shí)采用本試劑盒與VIDAS-PCT兩種試劑分別隨機(jī)檢測(cè)125例血清樣本．用檢測(cè)結(jié)果比較，計(jì)算兩種方法檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性和陰陽(yáng)性符合率．來(lái)自同一個(gè)病人的血清、血漿和全血樣本各50例，比較同一病人3種不同樣本的檢測(cè)結(jié)果偏差。

1．3．9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 22．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，檢測(cè)結(jié)果間的比較采用T檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

本試劑盒應(yīng)用1株高特異性、高敏感性抗人PCT單克隆抗體和1株P(guān)CT多克隆抗體，以雙抗夾心法對(duì)樣本中的PCT進(jìn)行檢測(cè)．檢測(cè)緩沖液與樣本在檢測(cè)管中混合，緩沖液中的熒光標(biāo)記的PCT單克隆抗體Ⅰ與樣本中的PCT抗原結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，當(dāng)混合樣本被滴加到反應(yīng)板的樣品孔，經(jīng)由層析作用流向NC膜的另一端，被包被于膜上檢測(cè)區(qū)的PCT多克隆抗體Ⅱ所捕獲，同時(shí)檢測(cè)緩沖液中的熒光標(biāo)記的羊抗兔IgG被包被與膜上質(zhì)控區(qū)的兔IgG所捕獲．經(jīng)由干式熒光免疫分析儀處理檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)的熒光信號(hào)，計(jì)算轉(zhuǎn)換出樣本中PCT的濃度值。

2．1 回收實(shí)驗(yàn) 根據(jù)計(jì)算，兩個(gè)分析樣本的回收率分別為110%和98%，平均回收率為104%，兩個(gè)樣本回收率與平均回收率的差值均小于±15%．回收實(shí)驗(yàn)是評(píng)價(jià)試劑盒準(zhǔn)確度的一種方法，回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果好，可以認(rèn)為，試劑盒的準(zhǔn)確度符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)要求。見表1。

2．2 精密度實(shí)驗(yàn) 選擇兩個(gè)水平濃度的樣本，分別進(jìn)行批內(nèi)和日間CV實(shí)驗(yàn)。批內(nèi)CV為4．38%和5．71%，小于 10%；日間 CV 為 5．49%和 6．56%，小于15%。見表2。

表1 回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2．3 分析特異性實(shí)驗(yàn) 混合的兩份樣本濃度分別為0．5ng/ml和10ng/ml，在兩份樣本中加入不同濃度的干擾物，再測(cè)定PCT的濃度．加入不同量的血紅蛋白，使其終濃度為(g/l)：2、4、6、8、10，其他干擾判斷類似血紅蛋白．甘油三酯的濃度與血紅蛋白相同，游離膽紅素與結(jié)合膽紅素的干擾濃度分布(mg/ml)：4、8、12、16、20。 類風(fēng)濕因子濃度為(IU/ml)：40、80、120、160、200。肝素鈉濃度為(IU/ml)：2．5、5、7．5、10、12．5。 乙二胺四乙酸鈉鹽濃度為(mg/ml)：0．3、0．6、0．9、1．2、1．5。 枸 櫞 酸 鈉 濃 度 為 (mg/ml)：0．76、1．52、2．28、3．04、3．8。 樣本中含以上濃度的干擾物，測(cè)得的結(jié)果均在±20%內(nèi)，判斷上述干擾物對(duì)PCT檢測(cè)無(wú)影響。見表3。

2．4 線性實(shí)驗(yàn) 采用高濃度抗原為原液，以4．89倍的比例依次稀釋下來(lái)，用理論濃度與PCT實(shí)測(cè)濃度作圖， 顯示 PCT 濃度在 0．05～53．21ng/ml內(nèi)呈良好線性，斜率 K=0．9988，截距 B=0．0741，線性相關(guān)系數(shù)r=1．000，在行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)要求范圍內(nèi)．檢測(cè)平均值與估算值的相對(duì)偏差均＜±5%，絕對(duì)偏差均＜±0．5，說(shuō)明檢測(cè)值有很好的梯度關(guān)系，即樣本梯度稀釋下來(lái)，所檢測(cè)的信號(hào)梯度很好，進(jìn)一步說(shuō)明線性相關(guān)性好。見圖1。

2．5 檢測(cè)限 分別對(duì)0值樣本和PCT低值樣本進(jìn)行 10次檢測(cè)，得到回歸方程 Y=7．4492X-0．0246，將0值樣本x+3SD的結(jié)果代入回歸方程，計(jì)算得到檢出限為0．02ng/ml．檢出限結(jié)果在降鈣素檢測(cè)試劑盒行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)。見表4。

表2 精密度評(píng)價(jià)結(jié)果

表3 不同干擾物對(duì)試劑的干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1 PCT線性范圍驗(yàn)證

表4 檢測(cè)限實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2．6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 試劑盒放置6個(gè)月、12個(gè)月、18個(gè)月和21個(gè)月后，進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果都滿足 1．3．1、1．3．2、1．3．4、1．3．5 的要求， 可以判斷試劑盒的有效期滿足18個(gè)月。見表5。

表5 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2．7鉤狀效應(yīng)試驗(yàn) 用0值校準(zhǔn)品稀釋高濃度的降鈣素原純品，得到待分析物濃度為(ng/ml)：50、100、200、300、400、500，測(cè)試樣本的響應(yīng)值。PCT 濃度從50ng/ml升到400ng/ml時(shí)，信號(hào)隨濃度增加而變大；而PCT 500ng/ml的信號(hào)反而低于400ng/ml濃度時(shí)的信號(hào)。由此可得：PCT濃度高達(dá)300ng/ml時(shí)未出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)。見表6。

2．8臨床樣本檢測(cè)結(jié)果 用本試劑盒和VIDASPCT兩種試劑同時(shí)對(duì)125例臨床標(biāo)本進(jìn)行定量分析，見圖2。對(duì)兩種試劑測(cè)得的結(jié)果進(jìn)行T檢驗(yàn)分析，兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05，無(wú)顯著差異)，其相關(guān)性好，相關(guān)系數(shù)r=0．9951，直線回歸方程為Y=1．0111X+0．2498。 同時(shí)對(duì) 125 份樣本進(jìn)行 Kappa一致性分析，Kappa 系數(shù)為 0．885＞0．75， 認(rèn)為兩系統(tǒng)高度一致，等效，見表7。

表6 鉤狀效應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2 臨床樣本相關(guān)性曲線

表7 Kappa一致性分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對(duì)于來(lái)自同一病人的血清、血漿和全血樣本各50份檢測(cè)后，進(jìn)行相關(guān)性分析．血清與血漿對(duì)比線性方程為：Y=0．9879X-0．0455 r=0．9938； 血清與全血對(duì)比線性方程為：Y=1．044X-0．098 r=0．9875；血漿與全血對(duì)比線性方程為：Y=1．0589X-0．0607 r=0．995．可以看出，本試劑對(duì)血清、血漿和全血樣本的檢測(cè)，一致性良好，結(jié)果沒有明顯差異，說(shuō)明試劑可同時(shí)用于以上3種樣本的檢測(cè)，方便臨床使用。

3 討論

PCT是一種由甲狀腺細(xì)胞合成的小蛋白，分子量13kDa由CALC-1 gene編碼，通過(guò)剪切pre-pro-calcitonin(141氨基酸單位的肽鏈)得到procalcitonin/pct．PCT是由116個(gè)氨基酸組成的肽鏈，包括N端氨基酸、活性降鈣素和降鈣蛋白三部分[13]．在 健 康 個(gè) 體 中 的 濃 度 非 常 低 ＜0．1ng/ml；PCT ＜0．25ng/ml不主張使用抗生素；＞0．25ng/ml主張使用；＞0．5ng/ml強(qiáng)烈主張使用[14，15]．因此可根據(jù) PCT濃度作出是否存在細(xì)菌性感染的初步診斷，并選擇是否使用抗生素，以減少抗生素的泛濫、減輕病患的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)及降低細(xì)菌耐藥性的發(fā)生機(jī)率。

本試劑盒中的每個(gè)PCT檢測(cè)卡均有一個(gè)內(nèi)部質(zhì)控的過(guò)程以確保使用時(shí)日常質(zhì)控的需求，該質(zhì)控程序在每個(gè)病人樣本測(cè)試即同時(shí)執(zhí)行．一旦檢測(cè)卡正確插入瑞易測(cè)干式熒光免疫分析儀中，儀器將完全識(shí)別．不正確的質(zhì)控信息將會(huì)在瑞易測(cè)干式熒光免疫分析儀上顯示出錯(cuò)誤信息，將需要進(jìn)行重新測(cè)試．本研究結(jié)果顯示應(yīng)用熒光免疫層析法檢測(cè)降鈣素原具有檢測(cè)限低、線性范圍廣、準(zhǔn)確度和精密度高、分析特異性高、穩(wěn)定性好、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，能滿足大小醫(yī)院的檢測(cè)需求。