劉師文，李健雄，龔甜，張艷妮，施勇，肖芳，徐剛，周珺，劉曉慶，熊英

(江西省疾病預防控制中心疾病檢測所，江西 南昌 330029)

2001年荷蘭學者Vanden Hoogen等[1]從患急性下呼吸道感染的嬰幼兒鼻咽抽吸物樣本中分離到一種新的病毒，人偏肺病毒 (human metapneumovirus，HMPV)，隨后在世界各地都發(fā)現(xiàn)該病毒的流行[2]。進一步研究表明，HMPV可導致各年齡組呼吸道感染，輕度的臨床表現(xiàn)包括咳嗽，呼吸困難，喘息/喘鳴等，嚴重的癥狀包括支氣管炎和肺炎伴隨發(fā)熱，在幼兒、老人、免疫功能低下人群還可引起致命的并發(fā)癥[3]。

HMPV是屬于副黏液病毒科偏肺病毒屬的單股負鏈RNA病毒?；蚪M全長約13kb包含8個基因開放讀碼框架，其編碼順序為3`-N-P-M-FM2-SH-G-L-5`，編碼9種蛋白，其中M2基因編碼兩種蛋白分別為M2-1、M2-2。9種蛋白分別命名為：N核衣殼RNA結合蛋白、P核衣殼磷蛋白、M非糖基化基質蛋白、F融合蛋白、M2-1轉錄延伸因子、M2-2 RNA合成調節(jié)因子、SH小疏水表面蛋白、G主要黏附蛋白、L主要多聚酶亞單位。對多個基因進化分析顯示，hMPV分為A、B兩個不同的基因型，每型內(nèi)又可分為兩個不同的亞型即(A1、A2和 B1、B2)[4，5]。 F基因表達的融合蛋白是 HMPV主要抗原，是目前分型最常用的基因[6]。本研究對江西省2010-2016年采集的急性呼吸道感染患兒標本進行HPMV核酸檢測，并對陽性的樣本進行F基因測序和分析，以了解江西地區(qū)HMPV流行情況和基因特征。

1 材料與方法

1．1 標本來源 于2010年4月至20106年12月每周二定點采集江西省兒童醫(yī)院呼吸內(nèi)科門診和住院的急性呼吸道患兒的咽拭子或支氣管灌洗液，并收集病例相關資料和臨床信息。

1．2 主要試劑 病毒DNA和RNA提取試劑（QIAGEN），核酸擴增試劑盒（QIAGEN和Promaga Go-Taq Master Mix）。

1．3 樣本處理和核酸提取 方法參照文獻[7]。

1．4 HMPV 核酸檢測（P基因） 引物 F 5’-TYAA CATTGCWACAGCAGGACC-3’，引物 R 5’-CTTC WGATTCWCCRCTTGTGCT-3’。 RT 反 應 ：50℃30min，95℃ 15min；PCR 循環(huán)如下：94℃ 30s，54℃30s，72℃ 1min， 共 擴 增 35 個 循 環(huán) ，72℃ 延 伸10min。

1．5 HMPV F 基因擴增和測序 引物 Ff：5’-GTYA GCTTCAGTCAATTCAACAGAAG-3’，F(xiàn)r：5’-CCTG TGCTGACTTTGCATGGG-3’。反應條件：RT反應：50℃ 30min，95℃ 15min；PCR 循環(huán)如下：94℃ 15s，58℃ 30s，72℃ 1min， 共擴增 35 個循環(huán)，72℃延伸10min。擴增產(chǎn)物送上海生物工程有限公司測序。

1．6 分析方法 采用SPSS 18．0軟件對病例信息及檢測結果進行卡方檢驗，P＜0．05為差異具有統(tǒng)計學意義。采用DNAStar和MEGA6．0軟件F基因序列進行分析，以鄰位相連法(neighbor-Joining，NJ)構建系統(tǒng)發(fā)生樹。

2 結果

2．1 HMPV檢測結果 2010年 4月至 2016年 12月，共采集2438例急性呼吸道感染患兒呼吸道標本，其中有54例患兒樣本被檢出HMPV核酸陽性，陽性率為 2．21%。

2．2 不同月份HMPV檢測結果 1-12月不同月份HMPV陽性率經(jīng)卡方檢驗，結果顯示差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=35．723，P=0．000188＜0．05），其中發(fā)病季節(jié)主要為冬春季，高發(fā)月份為12月、1月、2月、3月。見表1。

表1 不同月份HMPV核酸檢測情況

2．3 HMPV感染兒童年齡分布 從病例年齡分布看0～5歲病例共49例，占總病例數(shù)90．74%，不同年齡組之間HMPV陽性率經(jīng)卡方檢驗，差異無統(tǒng)計學意義（χ2=12．876，P=0．302＞0．05）。 見表 2。

表2 不同年齡組HMPV檢出情況

2．4 不同性別患兒HMPV檢測結果 不同性別HMPV 陽性率差異無統(tǒng)計學意義 （χ2=0．394，P=0．530＞0．05）。 見表 3。

2．5 江西地區(qū)HMPV基因型分型 對54份HMPV陽性樣本進行F基因擴增測序，最終成功獲得28株病毒的F基因序列，應用MEGA6．0和 DNA STAR軟件包進行序列分析，根據(jù)分析結果進行基因分型，其中21株為A2基因型，B1基因型3株，B2基因型4株，系統(tǒng)發(fā)生樹見圖1。

表3 不同性別組HMPV檢出情況

圖1 江西地區(qū)HMPV流行株F基因片段鄰位相鄰法系統(tǒng)發(fā)生樹（613-1064bp）。

3 討論

人類偏肺病毒可導致人類上呼吸道和下呼吸道感染，尤其是在小于5歲嬰幼兒、老人和免疫力低下者中引起細支氣管炎和肺炎[8]，在下呼吸道感染中，僅次于呼吸道合胞病毒[4]。該病毒自2001年首次被發(fā)現(xiàn)以來受到了國內(nèi)外廣泛關注。我國2003年朱汝南[9]等首先報道了國內(nèi)HMPV感染情況，之后，國內(nèi)其他等地相繼也有類似報道[10-12]，但目前還未見江西地區(qū)該病毒感染情況的研究報道。本研究對2010-2016年江西地區(qū)采集的2438例兒童急性呼吸道本進行了HMPV核酸檢測，檢出陽性54例，陽性率為2．21%，說明它確實是引起江西地區(qū)兒童急性呼吸道感染的重要病原之一。陽性病例在各個不同月份間人偏肺病毒檢出率差異具有統(tǒng)計學意義，主要流行月份在12月和1-3月，流行季節(jié)為冬春季，結果與金玉報道的相符[13]；本研究中，小于5歲總病例數(shù)90．74%；分析未發(fā)現(xiàn)該病毒在兩性別間的感染有顯著差異，結果與徐梅佳[14]的報道相符。

HMPV分為A、B兩個不同的基因型，每型內(nèi)又可分為兩個不同的亞型即(A1、A2和 B1、B2)，有研究表明，兩種hMPV基因型可在同一季節(jié)里共同流行，且以A基因型為多，hMPV基因型的流行模式在同一區(qū)域的不同年份可能不斷變化；朱汝南[9]報道2003年和2004年北京地區(qū)流行的hMPV分屬于兩種基因亞型（A2和B2），湖南地區(qū)hMPV樣本分屬于四種亞型（A1、A2、B1、B2），且以 B 基因型為多[15]。本研究共測序獲得28株人偏肺病毒的F基因序列，系統(tǒng)進化分析顯示，江西地區(qū)流行的人偏肺病毒有A2、B1、B2基因型，A2基因型毒株每年都有檢測到，我們推測A2基因型毒株為江西本土的優(yōu)勢流行株。不同基因型與臨床表現(xiàn)的關系我們還需進一步的研究。

綜上所述，本研究證實hMPV是引起江西地區(qū)兒童急性呼吸道感染的重要病原之一，掌握了江西地區(qū)的hMPV流行規(guī)律及基因分型特征，對提高江西地區(qū)人偏肺病毒的防控有重要意義。