白云雪 ，胡雪飛 ，萬(wàn)臘根 ，趙銳

(1．南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院；2．南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌 330006)

近20年來(lái)，由于器官移植、介入和手術(shù)的開(kāi)展，各種免疫抑制劑、廣譜抗生素、類(lèi)固醇類(lèi)激素的大量應(yīng)用，艾滋病、血液系統(tǒng)疾病、糖尿病等發(fā)病率的升高，臨床上深部真菌感染（deep fungal infection，DFI）的發(fā)病率明顯上升，在醫(yī)院感染中占重要地位[1，2]。國(guó)內(nèi)流行病學(xué)研究[3]顯示目前侵襲性念珠菌感染在危重病人中死亡率約為35%～80%，曲霉菌感染死亡率高達(dá)39%～100%。大量文獻(xiàn)表明，DFI的預(yù)后很大程度上取決于早期的診斷和治療，然而傳統(tǒng)的真菌培養(yǎng)、組織病理學(xué)等檢查取材困難、耗時(shí)長(zhǎng)、標(biāo)本易污染、陽(yáng)性率低、難以滿足現(xiàn)今臨床需求，因此真菌血清抗原檢測(cè)成為目前判斷早期感染的重要檢查手段[4，5]。本研究回顧性分析了2016年8月-2018年8月在我院擬診為DFI患者的相關(guān)指標(biāo)，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組，以評(píng)價(jià)G試驗(yàn)及GM試驗(yàn)對(duì)DFI的診斷價(jià)值。

1 材料與方法

1．1 研究對(duì)象 收集南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院2016年8月-2018年8月擬診為DFI并行G試驗(yàn)及GM試驗(yàn)的66位患者為觀察對(duì)象，排除兩試驗(yàn)均陰性及臨床資料不全者。診斷標(biāo)準(zhǔn)參照我國(guó)侵襲性肺部真菌感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)與治療原則 （草案），血液病/惡性腫瘤患者侵襲性真菌感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)與治療原則(草案)[6，7]，將患者分為確診組、臨床診斷組及擬診組。其中男性43例，年齡18～85歲，女性23例，年齡43～91歲，分別來(lái)自血液科（29例）、呼吸科（24 例）、ICU（4 例）、傳染科（3 例）、腎內(nèi)科（2例）、風(fēng)濕科、心內(nèi)科、神經(jīng)內(nèi)科、腫瘤科各1例。同時(shí)納入50例非DFI的患者為對(duì)照組，其中男33例，年齡 14～78 歲，女 17 例，年齡 15～70 歲，分別來(lái)自康復(fù)科，神經(jīng)外科等。采集所有患者全血或血清進(jìn)行檢測(cè)。

1．2 設(shè)備與儀器 ELx808IU微生物檢測(cè)儀 （美國(guó)BioTek公司），Microfuge 20R離心機(jī) （美國(guó)Beckman Coulter公司），智能恒溫儀。曲霉菌抗原檢測(cè)試劑盒（酶聯(lián)免疫法），真菌葡聚糖檢測(cè)試劑盒（動(dòng)態(tài)濁度法）。

1．3 方法

1．3．1 GM試驗(yàn) 全血標(biāo)本均于 2h內(nèi)離心。 取300μl血清與100μl樣本處理液混勻后于100℃水浴箱加熱3min，10000g離心10min后取上清液備檢。取50μl上清液與50μl結(jié)合物于37℃密封孵育90±5min。用800μL工作洗液洗板5次，加入200μl顯色液，室溫（+18～25℃）避光孵育 30±5min，后加入100μl終止液，混勻后30min于波長(zhǎng)450nm讀數(shù)。

1．3．2 G 試驗(yàn) 全血標(biāo)本于 2h內(nèi)離心，取 100μl血清加于900μl樣本處理液中，混勻后70℃保溫10min，立即放冰水冷卻備檢。取200μl待檢液加入鱟試劑中，溶解后取100μl至檢測(cè)儀檢測(cè)。

1．4 結(jié)果判讀 GM試驗(yàn)以≥0．5為陽(yáng)性界值；G試驗(yàn)以＞10pg/ml為陽(yáng)性界值。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 19．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，GM試驗(yàn)及G試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果用中位數(shù) （四分位數(shù)）[M(P25，P75)]表示，計(jì)量資料 Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)。分別計(jì)算敏感度、特異度、PPV、NPV、假陽(yáng)性率、假陰性率以分析診斷效能，并繪制受試者工作特征曲線 (ROC曲線)。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 合并基礎(chǔ)疾病 66例DFI患者中AML患者發(fā)病率最高，共11例（16．7%），其他惡性血液病20例（30．3%）；呼 吸 系 統(tǒng) 疾 病 21 例 （31．8%），其 中COPD患者發(fā)病率最高 （6例，9%）；2型糖尿病患者3例（4．5%）；其余患者為腎病、消化系統(tǒng)疾病、風(fēng)濕系統(tǒng)疾病等共 11 例（16．7）。

2．2 病原菌分析 根據(jù)試驗(yàn)組患者痰檢真菌培養(yǎng)及鑒定結(jié)果，共分離出白念珠菌16株（69．6%），熱帶念珠菌及光滑念珠菌各1株（8．6%），曲霉4株（17．4%），其中一位患者同時(shí)檢出曲霉及白念珠菌。

2．3 兩組患者 GM試驗(yàn)、G試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果比較DFI患者 GM 試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果為 0．62(0．40，1．28)，高于 對(duì) 照 組 0．29(0．20，0．42)，G 試 驗(yàn) 結(jié) 果 為 10．34(5．00，20．71)，高于對(duì)照組 5．00(5．00，5．00)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-5．9081，P=0；Z=-5．646，P=0）。

2．4 GM試驗(yàn)及G試驗(yàn)對(duì)DFI的診斷評(píng)價(jià) 按診斷標(biāo)準(zhǔn)[6，7]及結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)，以確診及臨床診斷患者為真陽(yáng)性，對(duì)照組為真陰性，計(jì)算GM試驗(yàn)敏感度 為 80．8%， 特異 度 為 82%，PPV為 70%，NPV89．1%，假陽(yáng)性率 18%，假陰性率 19．2%；G 試驗(yàn)敏感度為 42．3%， 特異度為 98%，PPV91．7%，NPV76．6%，假陽(yáng)性率 2%，假陰性率 57．7%；聯(lián)合診斷 敏 感 度 100%， 特 異 度 82%，PPV74．3%，NPV100%，假陽(yáng)性率18%，假陰性率0。

2．5 ROC曲線分析 以確診+臨床診斷為金標(biāo)準(zhǔn)做ROC 曲線，GM 試驗(yàn)診 DFI的 AUC 為 0．901，95%CI 0．833～0．968，最佳 Cut off值為 0．455，其敏感度為84．6%，特異度為72%；G試驗(yàn)診DPFI的AUC為 0．731，95%CI 0．599～0．863， 最佳 Cut off值為10．97855，其敏感度為 38．5%，特異度為 98%。 兩者聯(lián)合檢測(cè)的 AUC 為 0．95，95%CI 0．906～0．994。 見(jiàn)圖1。

圖1 GM試驗(yàn)、G試驗(yàn)及聯(lián)合檢測(cè)的ROC曲線

3 討論

深部真菌感染是指真菌侵入內(nèi)臟，血液等深部組織所致單一器官及多個(gè)組織的感染，起病隱匿、臨床表現(xiàn)無(wú)明顯特異性，導(dǎo)致漏診率高，預(yù)后兇險(xiǎn)[5，6]。半乳甘露聚糖是曲霉菌細(xì)胞壁的組成成分，真菌侵入深部組織后引發(fā)相關(guān)免疫反應(yīng)，后被巨噬細(xì)胞吞噬，釋放其入血。（1，3）-β-D葡聚糖廣泛存在于除毛霉菌，隱球菌以外的真菌細(xì)胞壁上，在細(xì)菌、病毒上均無(wú)表達(dá)，二者在感染早期即升高，并在病程全程均有含量變化[8]。根據(jù)診斷標(biāo)準(zhǔn)，DFI需依靠病理結(jié)果才能確診，但深部真菌感染患者多存在不同程度免疫缺陷，病理活檢難以施行，因此兩試驗(yàn)可作為真菌感染的重要的輔助診斷，并可監(jiān)測(cè)疾病預(yù)后及發(fā)展[9，10]。

近年來(lái)，DFI的發(fā)病率逐漸上升，本研究中AML患者發(fā)病率最高，這與國(guó)外相關(guān)薈萃[11]一致，原因可能與血液病患者的免疫缺陷、基礎(chǔ)疾病未完全控制、化療導(dǎo)致肝腎功能損害等有關(guān)。關(guān)于病原菌分布，雖然侵襲性曲霉菌感染的發(fā)病率逐年上升，但目前研究[3，12]表明念珠菌感染仍占較大比例，這與本文結(jié)果一致。根據(jù)結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)，試驗(yàn)組GM及G試驗(yàn)的結(jié)果均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明兩試驗(yàn)均對(duì)DFI有較大診斷價(jià)值。本研究GM試驗(yàn)的敏感度為80．8%，高于國(guó)內(nèi)薈萃分析[10]（65%），可能與使用 β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素、食物污染、食用某些葡萄糖酸鹽制劑等導(dǎo)致假陽(yáng)性有關(guān)。G試驗(yàn)敏感度為42．3%，低于目前研究[9]（74%），產(chǎn)生差異可能與樣本來(lái)源、試劑、儀器不同所致的假陽(yáng)性、假陰性有關(guān)[13]。本研究將兩種檢測(cè)方法聯(lián)合診斷，得出敏感度達(dá)100%，特異度82%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值及陰性預(yù)測(cè)值均較高，與馮潛[14]、張海濤[15]等人的研究基本一致，這表明兩試驗(yàn)同時(shí)檢測(cè)可彌補(bǔ)相互假陽(yáng)性及假陰性，其結(jié)果均陽(yáng)性高度提示DFI。本研究通過(guò)ROC曲線分析GM試驗(yàn)診斷DFI的AUC為0．821，最佳Cut off值為 0．495；G 試驗(yàn) AUC 為 0．764， 最佳 Cut off值為9．4125，與現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)基本一致。

綜上所述，真菌血清學(xué)試驗(yàn)（1，3）-β-D 葡聚糖（G）試驗(yàn)及半乳甘露聚糖（GM）試驗(yàn)對(duì)深部真菌感染有較大診斷價(jià)值，但兩試驗(yàn)均存在一定程度的假陽(yáng)性與假陰性，聯(lián)合診斷能提高診斷準(zhǔn)確性，減少漏診率。