李晶，林珊，陳美光

(福建省福州兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建 福州 350005)

EB 病毒(EBV)、巨細(xì)胞病毒(CMV)、肺炎支原體(MP)、柯薩奇病毒(COX)、單純皰疹病毒（HSV)、風(fēng)疹病毒（RV）、乙型流感病毒、副流感病毒、腸道EV71病毒是兒童常見感染性疾病的病原體，患兒在受到病原體刺激后，體內(nèi)免疫系統(tǒng)被激活[1]，研究患兒免疫系統(tǒng)活化狀態(tài)特別是T細(xì)胞活化狀態(tài)對(duì)疾病的診療具有重要價(jià)值。本文采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分析該9種病原體感染急性期患兒T淋巴細(xì)胞部分活化指標(biāo)的變化，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 對(duì)象與方法

1．1 研究對(duì)象 收集2016年1月-2017年10月我院收治的9種病原體感染患兒共186例，男106例，女80例，年齡6月～13歲。其中EBV病毒感染(EB-VCAIgM且EBV-DNA陽性)患兒23例，巨細(xì)胞病毒感染 (CMV-IgM且CMV-DNA陽性)21例、肺炎支原體感染(MP-IgM且MP-DNA陽性)53例、柯薩奇病毒感染(COX A16-IgM陽性)13例，單純皰疹病毒感染（HSV-IgM陽性）25例，風(fēng)疹病毒感染（RV-IgM陽性）9例，乙型流感病毒感染（乙型流感病毒-IgM陽性）12例，副流感病毒感染（副流感病毒1、2、3型-IgM陽性）16例， 腸道 EV71感染（HEV71-IgM陽性）14例；混合感染患兒51例，其中13例EBV感染，25例CMV感染，43例MP感染。對(duì)照組[2]選取在福建省福州地區(qū)進(jìn)行健康體檢或術(shù)前查體（均為對(duì)免疫功能影響不大的疾?。┑慕】祪和?，均符合以下標(biāo)準(zhǔn)：外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)、肝腎功能、X線檢查均正常，無明顯的心、腦血管疾病，無先天性免疫缺陷性疾病和自身免疫性疾病，近期無感染性疾病，近期未使用過影響免疫系統(tǒng)的藥物，年齡為2個(gè)月～16歲共400例，其中男208例，女192例。均采集外周靜脈血2ml于肝素鈉抗凝管，顛倒混勻，不能及時(shí)檢測(cè)標(biāo)本置4℃冰箱保存，不超過24h。

1．2 病原學(xué)測(cè)定方法 應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)患兒血清中EB病毒抗衣殼抗體IgM（EB-VAC IgM）、MP-IgM、 巨細(xì)胞病毒 CMV-IgM抗體、單純皰疹病毒I型IgM抗體，風(fēng)疹病毒抗體IgM、COX-IgM或應(yīng)用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測(cè)兒童咽拭子 EBV-DNA、MP-DNA及CMV-DNA。應(yīng)用膠體金法檢測(cè)腸道病毒71型IgM抗體及柯薩奇病毒A16型IgM抗體，應(yīng)用間接免疫熒光法檢測(cè)呼吸道感染病原體甲型流感病毒IgM抗體，乙型流感病毒IgM抗體、副流感病毒1、2、3型IgM抗體。

1．3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法 ①儀器 美國BD公司的FACSCalibur型流式細(xì)胞儀。

②試劑采用美國BD公司的淋巴細(xì)胞亞群活化分析試劑，熒光標(biāo)記4色單克隆抗體，CD4-FITC/CD38-PE/CD3-PerCP/Anti-HLA-DR-APC，CD8-FITC/CD38-PE/CD3-PerCP/Anti-HLA-DRAPC、使用配套的溶血?jiǎng)?FACS Lysing Solution)，熒光校正微球 （CaliBRITEBeads） 分別為：Unlabeled Beads、APC Beads、FITC Beads、PE Beads、PerCP Beads。

③標(biāo)本制備：按照試劑使用說明書的要求，每份樣本分別加入20μl單抗試劑于流式細(xì)胞儀專用TruCONT管中，加入50μl EDTA抗凝全血，混勻在室溫暗處放置15min，加入450μl 10%FACS溶血素，混勻在室溫暗處放置15min，上機(jī)獲取標(biāo)本數(shù)據(jù)。

④儀器校正 本研究上機(jī)前使用BD公司專用的熒光校正微球?qū)α魇郊?xì)胞儀進(jìn)行校正，包括光電倍增管電壓的調(diào)節(jié)、熒光補(bǔ)償?shù)恼{(diào)節(jié)，以及靈敏度的測(cè)試等，使流式細(xì)胞儀處于最佳的運(yùn)行狀態(tài)。

⑤結(jié)果分析應(yīng)用CellQUEST軟件測(cè)定淋巴細(xì)胞表面抗原 CD3+及活化指標(biāo) CD4+CD38+、CD4+Anti-HLA-DR+，CD8+CD38+、CD8+Anti-HLA-DR+的百分率和絕對(duì)計(jì)數(shù)并分析結(jié)果。

⑥質(zhì)量控制：數(shù)據(jù)均由同一技術(shù)人員在同一標(biāo)準(zhǔn)下進(jìn)行讀取，數(shù)據(jù)的取舍和分析則由本文2名作者共同完成。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，檢測(cè)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間均數(shù)差異比較采用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用方差分析，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

與正常兒童比較，CMV、MP、COX、RV、 腸道EV71及副流感病毒急性感染期CD3+細(xì)胞百分比顯著減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）。 其中腸道EV71 CD3+絕對(duì)計(jì)數(shù)減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）， 副流感病毒 CD3+絕對(duì)計(jì)數(shù)顯著減低 （P＜0．01），而 EBV CD3+絕對(duì)計(jì)數(shù)顯著增高（P＜0．01）。EBV、CMV、MP、COX、腸道 EV71 及混合感染急性期CD4+CD38+細(xì)胞百分比顯著減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01），其中 MP、COX、EV71 感染及混合感染 CD4+CD38+的絕對(duì)計(jì)數(shù)顯著減低 （P＜0．01）。EBV、CMV、風(fēng)疹病毒（RV）、乙型流感病毒及混合感染急性期CD4+HLA-DR+百分比和絕對(duì)計(jì)數(shù)均增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），單純皰疹病毒（HSV)感染時(shí)CD4+HLA-DR+絕對(duì)計(jì)數(shù)增高 （P＜0．05）； 而腸道 ev71 病毒感染時(shí) CD4+HLA-DR+百分比和絕對(duì)計(jì)數(shù)均顯著減低（P＜0．01），柯薩奇病毒(COX)感染時(shí)CD4+HLA-DR+絕對(duì)計(jì)數(shù)顯著減低（P＜0．01）。 CD8+CD38+百分比和絕對(duì)計(jì)數(shù)在 EB 病毒(EBv)、巨細(xì)胞病毒(CMV)、單純皰疹病毒（HSV)、風(fēng)疹病毒 （RV)、副流感病毒感染時(shí)均增高 （P＜0．05），尤其在 EB 病毒(EBv)、巨細(xì)胞病毒(CMV)感染時(shí)顯著增高（P＜0．01），CD8+CD38+百分比在柯薩奇病毒(COX)、乙型流感病毒感染時(shí)增高（P＜0．05），CD8+CD38+絕對(duì)計(jì)數(shù)在腸道ev71病毒感染時(shí)顯著減低（P＜0．01）。 CD8+HLA-DR+百分比和絕對(duì)計(jì)數(shù)在巨細(xì)胞病毒(CMV)、乙型流感病毒及副流感病毒感染時(shí)增高（P＜0．05），其百分比在風(fēng)疹病毒（RV）感染時(shí)增高 （P＜0．05），其絕對(duì)計(jì)數(shù)在EB病毒(EBv)、單純皰疹病毒（HSV）及混合感染時(shí)增高（P＜0．05）。9種病原體感染后患兒急性期淋巴細(xì)胞活化的表達(dá)，見表1。

3 討論

大量的研究表明[3-6]，病原體感染與T細(xì)胞抗原識(shí)別(antigen recognition)和活化(activation)異常相關(guān)。T細(xì)胞的活化可以直接影響整個(gè)免疫應(yīng)答的性質(zhì)、效能和結(jié)果，在人體免疫反應(yīng)中具有核心作用。T細(xì)胞是識(shí)別和擊退入侵機(jī)體的病毒和細(xì)菌的白細(xì)胞，當(dāng)T細(xì)胞遭遇這些外來入侵者時(shí)，它們就會(huì)通過一個(gè)活化過程自身迅速增殖數(shù)千倍，在免疫系統(tǒng)應(yīng)答中扮演著重要角色[7]。

表1 9種病原體感染后患兒急性期淋巴細(xì)胞活化結(jié)果（

表1 9種病原體感染后患兒急性期淋巴細(xì)胞活化結(jié)果（

注：各疾病組與健康對(duì)照組相比 * 表示 P＜0．01；# 表示 P＜0．05。

CD3+百分比（%）絕對(duì)計(jì)數(shù)(個(gè)/μl)CD4+CD38+百分比（%）絕對(duì)計(jì)數(shù)(個(gè)/μl)CD4+HLA-DR+百分比（%）絕對(duì)計(jì)數(shù)(個(gè)/μl)CD8+CD38+百分比（%）絕對(duì)計(jì)數(shù)(個(gè)/μl)CD8+HLA-DR+百分比（%）絕對(duì)計(jì)數(shù)(個(gè)/μl)87．0±3．6 5536±424*62．0±14．0*3226±1472 63．8±11．7*2641±1406#51．0±9．5*1723±768 65．6±12．9 3087±1546 53．0±8．0*2429±1751 60．0±12．0*2492±1085 63．0±12．0#2590±1503 58．3±9．2*1887±912*64．0±13．0 3155±1407 67．4±7．4 3053±1428 20．2±14．0*1229±990 28．0±4．1*1717±1170 26．1±13．2*1037±833*21．8±11．9*494±271*31．7±16．9 1878±1146 31．9±9．4 1810±1122 29．0±9．0 1037±124 26．2±4．9 912±53 21．6±6．5*471±293*21．9±10．9*1116±926*31．3±12．5 1506±1088 2．9±1．4#318±411#3．5±2．7#300±384#2．5±2．2 124±194 2．3±1．9 51±37*3．1±2．3231±268#7．5±7．2#433±367*5．6±1．8*214±107*4．4±3．5 173±164 1．8±0．4*35±12*4．1±3．9*237±266*2．3±1．16 101±80 25．4±5．6*2071±1968*30．5±7．2*2115±2040*20．3±7．4 955±1118 33．6±15．7*722±363 21．8±7．9#1543±1242*29．8±8．1*2063±2080#33．2±24．2#1339±1081 36．6±18．0*1407±985#22．3±8．7 466±245*20．5±11．3 1279±1495#18．3±6．0 828±528 5．07±4．73 1166±1897#16．9±13．9*1439±1862*4．4±5．2 339±800 8．1±6．3 175±156 7．4±9．6 707±1170#16．1±15．2#1385±1907 19．5±22．4#815±980#19．8±22．0*818±977#5．4±3．3 101±59 8．1±10．2 671±1117*4．9±3．5 208±200組別 例數(shù)EB病毒(EBv)巨細(xì)胞病毒(CMV)肺炎支原體(MP)柯薩奇病毒(COX)單純皰疹病毒（HSV)風(fēng)疹病毒（RV）乙型流感病毒副流感病毒腸道ev71病毒混合感染對(duì)照組23 21 53 13 25 9 12 16 14 51 400

病原體感染對(duì)宿主免疫細(xì)胞應(yīng)答、免疫細(xì)胞間的相互作用、細(xì)胞因子與抗體應(yīng)答均有影響。病毒感染后可以在體內(nèi)長(zhǎng)期潛伏，在一定條件下可以活化并可轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞，而病毒感染后宿主細(xì)胞免疫功能對(duì)控制病毒感染和清除病毒起到關(guān)鍵作用。我們選擇了病原體感染急性期患兒，與正常對(duì)照組進(jìn)行比較，了解病原體感染患者的淋巴細(xì)胞活化變化情況，以探討病原體感染與宿主細(xì)胞免疫功能的相互關(guān)系[8-11]。

本結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，除EB病毒感染CD3+絕對(duì)計(jì)數(shù)增高，HSV、混合感染無明顯改變外，其余多數(shù)病毒感染CD3+百分?jǐn)?shù)明顯下降。CD3+細(xì)胞是成熟T淋巴細(xì)胞的特異性標(biāo)志，反映了T淋巴細(xì)胞活化的比例[12]。病毒感染后機(jī)體產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答，既是清除感染病毒的重要保護(hù)措施，也可能伴隨對(duì)組織器官的免疫損傷。淋巴細(xì)胞活化是免疫應(yīng)答的重要過程[13]。CD3+淋巴細(xì)胞較對(duì)照組明顯下降，提示T淋巴細(xì)胞活化功能被抑制，可能導(dǎo)致機(jī)體免疫功能降低。

CD38+分子介導(dǎo)激活信號(hào)，參與T細(xì)胞的激活[14]。HLA-DR是MHC-1I類分子，具有高度多肽性，在調(diào)控抗原遞呈細(xì)胞激活T細(xì)胞活化程度和特異性中起重要作用，是T細(xì)胞活化晚期表達(dá)抗原[15]。檢測(cè)HLA-DR和CD38分子在T淋巴細(xì)胞表面的表達(dá)情況能反映細(xì)胞的活化狀態(tài)和程度，作為評(píng)價(jià)患者病情、診療效果和患者免疫功能恢復(fù)的指標(biāo)[16]。EBV、CMV、MP、COX、腸道 EV71 及混合感染急性期CD4+CD38+細(xì)胞百分比明顯降低，其中MP、COX、腸道 EV71及混合感染 CD4+CD38+絕對(duì)計(jì)也明顯降低，說明病毒感染使T細(xì)胞的活化受到抑制，同時(shí)機(jī)體的免疫應(yīng)答也受到一定抑制。而CMV、RV及乙型流感病毒感染時(shí)，CD4+HLADR+、CD8+CD38+、CD8+HLA-DR+百分?jǐn)?shù)與絕對(duì)計(jì)均明顯增高。EB、HSV感染時(shí)，CD4+HLA-DR+、CD8+CD38+、CD8+HLA-DR+絕對(duì)計(jì)數(shù)及 CD8+CD38+百分?jǐn)?shù)明顯增高。副流感病毒感染時(shí)CD8+CD38+、CD8+HLA-DR+百分?jǐn)?shù)與絕對(duì)計(jì)明顯增高，混 合 感 染 時(shí) CD4+HLA-DR+、CD8+CD38+、CD8+HLA-DR+絕對(duì)計(jì)數(shù)及CD4+HLA-DR+百分?jǐn)?shù)明顯增高。HLA-DR穩(wěn)定表達(dá)在淋巴細(xì)胞活化晚期，此時(shí)患者細(xì)胞免疫明顯被激活，使機(jī)體細(xì)胞免疫功能亢進(jìn)，細(xì)胞百分比及絕對(duì)計(jì)數(shù)升高顯示病毒感染后細(xì)胞免疫對(duì)控制病毒感染和清除病毒起到積極作用。然而引起兒童手足口病最為常見的腸道病毒 EV71 CD4+CD38+、CD4+HLA-DR+百分?jǐn)?shù)與絕對(duì)計(jì)數(shù)及CD8+CD38+絕對(duì)計(jì)數(shù)明顯降低，與國內(nèi)孫林春[17]報(bào)道結(jié)果有異，T細(xì)胞活化標(biāo)記的表達(dá)明顯降低，顯示T細(xì)胞的活化受到抑制，可能導(dǎo)致患兒處于免疫功能低下狀態(tài)。

本結(jié)果證明了，9種病原體感染后患兒體內(nèi)呈免疫活化和失衡狀態(tài)，病毒使機(jī)體免疫細(xì)胞異常激活或發(fā)生功能缺陷。不同病原感染后，患兒T細(xì)胞免疫改變各具特點(diǎn)，因其中幾種病原體感染在臨床癥狀上具有一定的相似性，檢測(cè)患兒活化T淋巴細(xì)胞亞群可作為一種鑒別和監(jiān)測(cè)手段，為臨床鑒別病原體感染和掌握患兒病情提供重要參考依據(jù)．