張 波,聶麥茜,2*,聶紅云,2,田曉婷,喬 琦

綠膿菌素促進銅綠假單胞菌NY3降解烴的作用機制

張 波1,聶麥茜1,2*,聶紅云1,2,田曉婷1,喬 琦1

(1.西安建筑科技大學環(huán)境與市政工程學院,陜西 西安 710055；2.西安建筑科技大學,陜西省膜分離重點實驗室,陜西 西安 710055)

綠膿菌素(Pyo)的分泌是銅綠假單胞菌NY3最為顯著的特征之一,前期實驗觀察到該菌降解烴時, Pyo分泌量常與烴的降解效率成正相關性,但其在污染物降解中的作用尚未受到關注,且機制不清楚.以共存戊二酸為高分泌Pyo的體系和試劑級Pyo標準物為基礎,研究了NY3菌降解烴時,Pyo對細胞內(nèi)氧化還原酶及其比酶活力和胞外電子傳遞速率等因素的影響作用.結(jié)果表明,戊二酸能夠明顯提高Pyo的分泌量,相較于無戊二酸體系提高了86.6%,且隨Pyo分泌量增加,NY3菌對十六烷去除率增加了16.29%;NY3菌分泌Pyo有利于提高其胞內(nèi)烷烴氧化酶的活力,在菌體生長至72h、Pyo投加量分別為200,300μL時,相較于未投加Pyo體系,烷烴氧化酶比活力分別提高了121.8%和346.5%.同時Pyo存在下將胞外電子傳遞速率提高了近7倍,從而增加其對十六烷的降解速率.NY3菌分泌Pyo能通過提高胞內(nèi)酶活性和胞外電子傳遞速率而促進NY3菌降解十六烷.

銅綠假單胞菌NY3；綠膿菌素(pyo)；烴類；烷烴氧化酶；戊二酸

烷烴是原油的主要成分,烷烴的降解是自然界普遍存在的現(xiàn)象.許多微生物,包括原核生物和真核生物,都能利用烷烴作為碳源和能源[1].目前已有研究利用菌糠強化微生物對石油烴污染進行修復[2],也有報道指出,有生物胞外分泌物可促進有機物的生物降解過程[3].銅綠假單胞菌NY3(NY3)不僅能高效降解烴類,且可代謝的烴種類多、碳鏈長度范圍廣[2].該菌突出的烴降解能力與其胞外分泌的多種活性小分子化合物密切相關[3].如胞外分泌的鼠李糖脂,能明顯提其對烴類的降解效率,且其促進機理也被廣泛論證[4-5].而作為NY3的另一特征分泌物-綠膿菌素(Pyo),其對烴的降解作用研究較少.目前關于Pyo的研究主要集中在醫(yī)學領域,研究表明,Pyo能自由穿透生物膜,參與氧化還原反應,產(chǎn)生活性氧[6];且可與細胞外的還原性輔酶Ⅰ(NADH)、還原型谷胱甘肽(GSH),同時產(chǎn)生氧自由基[[7-8],自由基對于有機物的降解有著非常重要的作用[9-10].也有人報道,在銅綠假單胞菌代謝葡萄糖的過程中,Pyo能夠改變自身細胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài),加速其對碳源的代謝過程[11].烴屬于有機物,亦屬于碳源,在銅綠假單胞菌對其降解過程中,會分同步泌Pyo,其分泌量與代謝條件、以及烴的降解速率密切相關.實驗室前期研究NY3菌代謝烴時發(fā)現(xiàn),NY3在快速代謝烴類時,會分泌大量的Pyo等吩嗪類物質(zhì);胞外液中的吩嗪類物質(zhì)(包括Pyo)可與胞外液中的NADH、GSH等反應,加速烴類的胞外降解速率.共存碳源戊二酸可加速NY3菌降解十六烷的過程,且可使胞外液中Pyo的分泌量增加[12].然而,尚不清楚胞外液中的Pyo在促進烴類在NY3菌的胞外降解過程中,對胞內(nèi)降解有何作用,其作用機理也有待揭示.目前僅有報道中提及以烷烴為碳源時烷烴降解酶之一的醛去氫酶相較于葡萄糖、琥珀酸或丙二酸為碳源時更加有活性[13].本文基于前期的研究結(jié)果,選擇戊二酸為NY3菌高分泌Pyo的共代謝碳源,同時借助純品Pyo,研究其對烴類降解關鍵酶與降解體系電子傳遞速率的影響,以期揭示Pyo在NY3菌代謝烴過程中作用機制.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種來源 銅綠假單胞菌NY3,經(jīng)實驗室分離并鑒定[14].

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基 無機鹽培養(yǎng)基的制備方法參照前期文獻[15],其組成主要包括(每升含量): 1.0gNH4NO3,25mL 磷酸鹽緩沖液,1mL微量元素,0.5mL 1mol/L MgSO4?7H2O,0.1mL 1mol/L CaCl2?2H2O.將無機鹽pH值調(diào)至7.5,并于121℃滅菌30min后,備用.

種子液培養(yǎng)基制備:牛肉膏3.0g,蛋白胨10.0g, NaCl 5.0g,調(diào)pH=7.5,溶解于1000mL蒸餾水中, 121℃,滅菌30min后,備用.

1.2 實驗方法

1.2.1 種子液制備 無菌操作條件下,NY3接種于100mL種子液培養(yǎng)基,在恒溫振蕩器中150r/min, 30℃培養(yǎng)24h,OD600nm調(diào)至1.6±0.05,備用.

1.2.2 戊二酸對NY3分泌Pyo的影響 從文獻[16]結(jié)果看,戊二酸可促進銅綠假單胞菌分泌Pyo.取18mL無機鹽培養(yǎng)基于50mL錐形瓶中,外加30μL十六烷,接種10%(/),加戊二酸,濃度達到0.1mol/L,以十六烷為唯一碳源的培養(yǎng)體系為對照.150r/min, 30℃恒溫培養(yǎng)16h,測培養(yǎng)液pH值、OD600nm,并用正己烷萃取其中剩余的十六烷.以正十二烷為內(nèi)標[17],用氣相色譜測定十六烷量,并計算降解率.同時各用10mL氯仿萃取5mL降解液,收集氯仿相,用5mL 0.2mol/L HCl反萃取氯仿相,測HCl相OD378nm值,按照純品Pyo的標準曲線計算培養(yǎng)液中Pyo的分泌量(mg/L).

1.2.3 NY3生長產(chǎn)Pyo及其提取 加戊二酸于90mL無機鹽培養(yǎng)基中,濃度達0.1mol/L,NY3菌接種10%(/).150r/min,30℃恒溫培養(yǎng)24h.按照1.2.2中方法重復操作2次萃取Pyo.將Pyo收集到氯仿相,揮發(fā)溶劑.用蒸餾水溶解,并調(diào)OD378nm至1.032 (22.51mg/L),儲于4℃冰箱,備用.

1.2.4 高分泌Pyo對NY3菌氧化還原酶比活力的影響 按照1.2.2中方法投加十六烷和NY3種子液,戊二酸投加至濃度為0.1mol/L,以未加戊二酸為對照.150r/min,30℃恒溫培養(yǎng),分別于10,14,18,24,48, 72h采樣,測定OD600nm的吸光度,用以表示生長體系的菌量.用正己烷萃取剩余十六烷,十二烷為內(nèi)標,氣相色譜測定十六烷含量,并計算降解率.同時10000r/ min離心收獲10,14,18,24,48,72h等時刻100mL培養(yǎng)液中的菌體,用pH=7.2磷酸鹽緩沖液洗滌菌體3次,并制備成菌懸液.置于0℃冰水浴中,用超聲波細胞破碎儀間歇處理20次,每次1min,功率為450W.破碎后,4℃,10000r/min離心10min,上清液為粗酶液.粗酶液的氧化還原反應酶活性以NADH的反應速率表示[18].取3mL pH=7.2的磷酸鹽緩沖液于10mL離心管中,加2mL粗酶液,30μL 26.2mmol/L NADH水溶液,加入200μL(22.51mg/L)的Pyo,以未加Pyo為對照,測定1min內(nèi)OD340nm處吸光度變化量,每隔10s記錄一次.每個樣品平行3個實驗.并測定粗酶液中蛋白濃度[19].按下式計算粗酶液烷烴氧化酶比活力[20].

式中:為烷烴氧化酶比活力,U/mg;t為反應液總體積,mL;s為粗酶液體積,mL;為NADH摩爾消光系數(shù),6.22L/(mmol×cm);為比色皿厚度,cm;D/D為每min吸光度變化值,min-1;pr為蛋白濃度,mg/L.

1.2.5 Pyo對NY3菌粗酶液催化氧化十六烷效率的影響 取90mL無機鹽于250mL錐形瓶中,加入150μL十二烷,NY3菌接種量10%(/),150r/min, 30℃恒溫培養(yǎng)24,48,72h離心收集菌體,并按上述方法洗滌和制備粗酶液.取3mL pH=7.2的磷酸鹽緩沖液于10mL反應瓶中,加2mL粗酶液,30μL 26.2mmol/L NADH溶液,5.0μL十六烷,分別加200,300μL上述Pyo(22.51mg/L)溶液,以未加Pyo為對照.按照1.2.4測定并計算菌體氧化還原酶比活力.反應15min后,用上述方法萃取并測定剩余的十六烷含量,并計算降解率.

1.2.6 高分泌Pyo對NY3菌降解十六烷體系電子傳遞速率的影響 采用CHI660A電化學系統(tǒng)(上海CHI公司)在-0.8~+0.8V電位范圍間記錄其循環(huán)伏安(CV)曲線.其中,降解體系樣品制備方法為為直接吸取10mL降解體系;上清液樣品制備方法為取10mL降解體系于12000,4℃離心20min,將所得上清液過0.22mm濾膜,除去未離心掉的菌體,所得液體即為上清樣品;菌體制樣方法為將上清制樣過程中離心所得菌體以無機鹽洗滌3次,最后重懸于10mL無機鹽中,即為菌體的電化學檢測樣品.電化學檢測采用三電極體系,其中SCE為參比電極,鉑絲為對電極,GCE或Ft-SWNTs-CTAB/GCE 為工作電極.

2 結(jié)果與討論

2.1 戊二酸作為共存碳源對NY3菌分泌Pyo的影響

NY3以十六烷(C16)為碳源生長的發(fā)酵液顏色呈淺綠色,C16+戊二酸為碳源的發(fā)酵液為的深綠色,該顏色屬于典型的Pyo顏色.因此,基于胞外液的顏色,可初步判斷外加戊二酸能使NY3菌產(chǎn)較多的Pyo.為了進一步驗證戊二酸的影響作用,分別測定NY3菌生長體系中OD600nm、pH值、Pyo濃度及生長單位菌體(以OD600nm表示)對十六烷去除率等指標,結(jié)果如表1所示.由表1可看出,在以十六烷為碳源生長的NY3菌培養(yǎng)液中,投加戊二酸可促進菌體的生長,同時提高Pyo的分泌量.一般來說,菌體生長量越高,必然導致碳源(十六烷)利用率提高.為了對比不同生長體系菌體對十六烷的代謝活性,以十六烷去除率除以培養(yǎng)液的OD600nm,表示單位菌體對十六烷去除率.結(jié)果表明,外加戊二酸對NY3菌體生長、Pyo分泌量、十六烷去除率以及單位菌體去除的十六烷的效率均有明顯提高.因此,戊二酸代謝促進了NY3菌細胞的生長以及胞外Pyo的分泌,但其促進機制還有待進一步研究.

表1 共存碳源存在下NY3菌生長16h培養(yǎng)液中相關指標的測定結(jié)果

注:碳源十六烷投加量30μL;戊二酸投加量:濃度達到0.1mol/L.

2.2 高分泌Pyo對NY3菌細胞中烴氧化酶活力的影響

將不同生長階段的NY3菌細胞破碎后,測定所獲粗酶液中具有十六烷氧化能力的烴氧化酶活力及不同時間點的Pyo產(chǎn)量,結(jié)果如圖1所示.戊二酸存在的體系中菌體的烴氧化酶活力力均高于對照體系,投加戊二酸的體系中Pyo的產(chǎn)量均高于無戊二酸體系,尤其是在14h后兩者差距更大.而酶活測定時菌體經(jīng)過了離心、重懸、破碎處理.粗酶液中并無Pyo的存在,因此酶活性的高低取決于酶蛋白的含量.綜上可知,戊二酸在促進菌體分泌Pyo的同時還使得烴氧化酶的合成增加.即戊二酸的存在能夠使Pyo處于高分泌狀態(tài),Pyo可使NY3菌的氧化還原酶活性活力提高,說明戊二酸可通過直接影響Pyo的分泌從而間接影響NY3菌對十六烷的降解率.研究表明,微生物是先將石油烴組分運移至細胞內(nèi)部,再進行細胞內(nèi)生化降解,則胞內(nèi)烷烴氧化酶的數(shù)量則直接會影響烷烴的降解[21].

2.3 Pyo對NY3菌細胞粗酶液中烴氧化酶比活力的影響

表2 Pyo對NY3菌粗酶液催化氧化十六烷效率的影響作用

注:所有所投加的Pyo濃度均為22.51mg/L.

測定不同濃度的純品Pyo對NY3菌粗酶液中烴氧化酶比活力及其對十六烷降解率,結(jié)果如表2所示.對于24h收獲的菌體,加入200,300μL Pyo (22.51mg/L),與未加Pyo相比,氧化還原酶比活力分別提高了0.14,0.25U/mg,15min內(nèi)粗酶液對十六烷去除率增加了0.6%、5%.對于48h和72h所收獲菌體的粗酶液,加Pyo對于氧化還原酶比活力和十六烷的去除率均有提高,提高幅度較24h菌體粗酶液小.因此,Pyo不僅可提高NY3菌粗酶的液氧化還原酶比活力,也能提高粗酶液對烷烴的去除率,說明Pyo在NY3菌體降解烴類物質(zhì)時,參與了氧化還原酶的電子傳遞系統(tǒng),對提高酶的活性是有利的.相較于其他研究[22-23]中通過調(diào)節(jié)微生物生長過程中的其他物理因素影響菌體的生長從而影響降解效率,Pyo是直接作用于參與氧化烷烴的酶,使其比活力提高,進而加快烷烴降解.

2.4 Pyo對NY3菌降解烴體系中電子傳遞速率的影響

由圖2(a)可知,當以十六烷為唯一碳源時(對照組),NY3菌降解十六烷反應液的C-V曲線中存在一個氧化還原電對和一個氧化電位.當戊二酸共存時,NY3菌降解十六烷反應液的C-V曲線較十六烷為唯一碳源時多出一個氧化還原電對,且相同電壓下體系的電流加大,電子傳遞速度加快.由此可知,戊二酸共存可使NY3菌降解十六烷體系分泌一種新的氧化還原物質(zhì),且可加速體系的電子傳遞速度,從而促進了十六烷的降解.由圖2(b)可知,外加純品Pyo時,在相同的電壓條件下的響應電流要明顯大于未加Pyo的體系,即Pyo可使體系的電子傳遞速率增大.上述結(jié)果表明,戊二酸的存在可促進Pyo的分泌從而導致降解體系內(nèi)的電子傳遞速率,進而提高了對十六烷的降解效率

2.5 Pyo對NY3菌降解十六烷影響機制的推測

基于本研究的上述結(jié)果以及前期工作[24-26],本文推測Pyo參與NY3菌降解十六烷的作用機制如圖3所示.

圖3 Pyo影響NY3菌降解十六烷的過程模型

據(jù)圖3可知,NY3菌降解烷烴的過程中同步分泌Pyo,對于菌體細胞內(nèi)代謝過程來說,Pyo可使烴氧化酶處于高活性狀態(tài),提高烴氧化酶活力及氧化酶比活力,從而加速烴類物質(zhì)的酶促降解過程.對于分泌到胞外Pyo來說,其可作為電子穿梭體,加速電子在有機物于氧氣之間的傳遞,從而增加降解體系的電子傳遞.通過這兩方的總和作用,Pyo加速了NY3菌對烴類的降解過程.

3 結(jié)論

3.1 投加戊二酸能提高NY3菌對Pyo的分泌,相較于無戊二酸體系提高了86.6%,同時可提高NY3菌的細胞生長量和單位菌體對十六烷的降解活性,16h時十六烷去除率增加了16.29%.

3.2 Pyo能提高NY3菌胞內(nèi)烴氧化酶的合成及其比活力,增加其對十六烷的降解速率,在菌體生長至72h、Pyo投加量分別為200,300μL時,相較于未投加Pyo體系,烷烴氧化酶比活力分別提高了121.8%和346.5%;Pyo亦可通提高降解體系電子傳遞速率,提高幅度達7倍之多.

3.3 Pyo促進NY3菌降解十六烷的機制是通過對胞內(nèi)關鍵酶活性的促進與對胞外電子傳遞速率的同時進行.

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The effects of pyocyanin on alkanes degradation byNY3.

ZHANG Bo1, NIE Mai-qian1,2*, NIE Hong-yun1,2, TIAN Xiao-ting1, QIAO Qi1

(1.School of Environmental and Municipal Engineering, Xi’an University of Architecture and Technology, Xi’an 710055, China；2.Shaanxi Key Laboratory of Membrane Separation, Xi’an University of Architecture and Technology, Xi’an 710055, China)., 2019,39(7)：3088~3093

The secretion of pyocyanin (Pyo) is one of the most significant characteristics of Pseudomonas aeruginosa NY3. Previous experiments have observed that Pyo secretion is often positively correlated with hydrocarbon degradation efficiency, but its role in pollutant degradation has not been concerned, and the mechanism is unclear. Based on the coexistence of glutaric acid as a high-secreting Pyo system and reagent-grade Pyo standard, the effects of Pyo on intracellular redox enzyme activity, specific enzyme activity and extracellular electron transfer rate during hydrocarbon degradation by NY3 bacteria were studied. Glutaric acid could significantly increase the secretion of Pyo, which was 86.6% higher than that of non-glutaric acid system, and with the increase of Pyo secretion, the removal rate of hexadecane by NY3 bacteria increased by 16.29%. Pyo secretion by NY3 bacteria was beneficial to increase the activity of intracellular alkane oxidase. When the bacteria grew to 72h and the dosage of Pyo was 200L and 300L, respectively, compared with that without Pyo system, alkane was removed by NY3 bacteria. The specific activity of hydrocarbon oxidase increased by 121.8% and 346.5% respectively. At the same time, in the presence of Pyo, the extracellular electron transfer rate was increased by nearly 7 times, which increased the degradation rate of hexadecane. Based on this, we propose that Pyo secretion by NY3 bacteria can promote the degradation of hexadecane by increasing the activity of intracellular enzymes and the rate of extracellular electron transfer.

NY3；pyocyanine pyo；hydrocarbons；alkane oxidase；glutaric acid

X172

A

1000-6923(2019)07-3088-06

張 波(1993-),男,陜西延安人,西安建筑科技大學碩士研究生,從事持久性有機污染物的生物降解技術(shù)研究.

2018-12-05

陜西省科技廳重點產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新鏈項目(2019ZDLSF05-04);中國博士后科學基金(2018M633479);陜西省教育廳科研計劃項目(18JK0449)

*責任作者, 教授, niemaiqian@xauat.edu.cn