陳君堯

（武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院 湖北武漢 430000）

1 前言

β-胡蘿卜素是一種非常常見(jiàn)的類胡蘿卜素。β-胡蘿卜素的顏色是黃色和橙色，很容易從水果和其他植物中提取。

β-胡蘿卜素不僅在食品技術(shù)中有許多用途，更重要的是，它對(duì)人體也有許多益處，因此，在研究中變得越來(lái)越重要。從食品科學(xué)的角度研究β-胡蘿卜素可以全面了解其成分、組成元素、化學(xué)性質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

β-胡蘿卜素是一種抗氧化劑，但是對(duì)于吸煙者來(lái)說(shuō)，他們攝入的β-胡蘿卜素的高含量可能會(huì)增加患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。因此，適量的β-胡蘿卜素有利于人體健康。

β-胡蘿卜素可以在人體內(nèi)轉(zhuǎn)化為維生素A，而維生素A 是必需的維生素。維生素A 有許多重要用途，也有一些研究證實(shí)，通過(guò)飲食攝入β-胡蘿卜素中的維生素A 可以應(yīng)用于人體的許多方面。例如，維生素A 有利于皮膚健康和黏液膜、免疫系統(tǒng)和視力；也有一些研究證明，每天攝入適量的β-胡蘿卜素可以減少癌癥和心血管疾病。

β-胡蘿卜素的另一個(gè)益處是其可以延遲認(rèn)知辨別能力的下降。在人們的身體中，氧化應(yīng)激是導(dǎo)致認(rèn)知能力下降的主要原因，研究證實(shí)了這一點(diǎn)。在這種情況下，β-胡蘿卜素是一種抗氧化劑，可以防止認(rèn)知能力的惡化，因?yàn)檠a(bǔ)充抗氧化劑可以調(diào)節(jié)機(jī)體的活性氧種類和抗氧化系統(tǒng)之間的平衡[1]。因此，越來(lái)越多的研究者將使用不同的抗氧化劑。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法對(duì)β-胡蘿卜素進(jìn)行了分析。

高效液相色譜（HPLC）是分析化學(xué)中的一項(xiàng)現(xiàn)代技術(shù)。它用于檢測(cè)混合物的不同成分，依靠泵的功率使樣品混合物通過(guò)填充有固體吸附材料的柱，樣品中的不同組分與吸附材料有不同程度的反應(yīng)，這將導(dǎo)致不同組分在管，最終結(jié)果是組件彼此分離[2]。此外，高效液相色譜根據(jù)物質(zhì)的極性或是否為親水性組分離不同的物質(zhì)。目前，高效液相色譜法已在許多應(yīng)用中得到應(yīng)用，例如，藥物、分離生物樣品的研究和醫(yī)學(xué)方面。在食品研究領(lǐng)域，高效液相色譜法也被廣泛應(yīng)用于食品成分的研究，如脂質(zhì)、維生素、氨基酸和無(wú)機(jī)陰離子等，是食品分析研究的熱點(diǎn)[3]。

2 材料與方法

2.1 材料

實(shí)驗(yàn)器材:電動(dòng)攪拌器；燒杯；錫箔；磁力攪拌器；真空過(guò)濾器；布氏漏斗；Whatman 42 號(hào)濾紙；收集瓶；100 mL 容量瓶；250 mL 圓底瓶；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；超聲波??；高效液相色譜瓶；50 mL 容量瓶；25 mL容量瓶。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

在電動(dòng)攪拌器中對(duì)胡椒粉進(jìn)行均質(zhì)化，并在干凈、干燥的燒杯中稱取5 g 勻漿，燒杯確保用錫箔包裹。將 62 mL 萃取溶劑（甲醇）、2.5 g 無(wú)水硫酸鹽和0.5 g 碳酸鎂添加到勻漿中，并將所有成分混合5 min。在這一步中使用了磁力攪拌器，必須在煙霧柜中進(jìn)行。在此過(guò)程中，燒杯被錫箔覆蓋，勻漿通過(guò)裝有Whatman 42 號(hào)濾紙的Buchner 漏斗真空過(guò)濾。在這個(gè)過(guò)程中，收集瓶和布氏漏斗的頂部被錫箔覆蓋。當(dāng)沒(méi)有更多的濾液通過(guò)時(shí)，用2×10 mL 等份提取溶劑清洗濾餅。

清洗濾餅的濾液轉(zhuǎn)移到干凈、干燥的250 mL 圓底燒瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中蒸發(fā)至干燥。將旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器的溫度控制在30℃～40℃，保持儀器不受光照。用超聲波浴將殘余物重新溶解在10 mL 甲醇中。最后，將溶液樣品注入高效液相色譜小瓶中，并在高效液相色譜中分析，條件為:波長(zhǎng)450 nm、流動(dòng)相（乙腈）∶四氫呋喃（THF）∶水為 85∶12.5∶2.5、流速 2.0 mL/min，在此條件下β-胡蘿卜素的保留時(shí)間應(yīng)約為10 min。

2.3 樣品制備

稱取12.5 mg β-胡蘿卜素，溶解于最小體積的THF 中，用50 mL 容量瓶添加樣品，用THF 將 50 mL容量瓶定容，并用錫箔覆蓋。從儲(chǔ)備溶液中取出0.25 mL、0.50 mL、0.75 mL、1.00 mL 等分試樣，并將其轉(zhuǎn)移到單獨(dú)的25 mL 容量瓶中。用THF 將25 mL容量瓶定容，并用錫箔覆蓋4 個(gè)容量瓶，用上述高效液相色譜法對(duì)這些標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分析。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)溶液配置的濃度詳見(jiàn)表1，用高效液相色譜法測(cè)定的4 個(gè)濃度梯度和1 個(gè)樣品的含量詳見(jiàn)表2，β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)線圖詳見(jiàn)圖1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度

表2 高效液相色譜法測(cè)定的4 個(gè)濃度梯度和1 個(gè)樣品的含量

（續(xù)表2）

圖1 β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)線

未知濃度溶液的計(jì)算如下:

Y=1 016.5X+5.086 6，X 為樣品濃度，Y 為樣品峰面積=1 316.045，M 為坡度=1 016.500，C 為截距=5.086，Y=MX+C

重新排列得到結(jié)果如下:

X=（Y-C））/M 即 X=（1316.045-5.086））/1016.500=1.290 mg/L

參考值為100 g，但本實(shí)驗(yàn)中，將5 g 樣品放入燒杯中，因此，需要將實(shí)驗(yàn)值返回到參考值，并且2 個(gè)砝碼之間的差值的倍數(shù)為100/5=20。因此，最終計(jì)算結(jié)果需要乘以20。所以，未知溶液濃度的最終結(jié)果為 1.290×20=25.806 mg/100g。

4 討論與分析

4.1 批判性分析

在本實(shí)驗(yàn)中，主要的誤差是光、氧、熱不能在實(shí)驗(yàn)室中完全分離，β-胡蘿卜素對(duì)光、氧、熱、不穩(wěn)定，因此，本實(shí)驗(yàn)中的所有玻璃容器在整個(gè)過(guò)程中都被錫箔覆蓋。當(dāng)實(shí)驗(yàn)過(guò)程進(jìn)行到真空過(guò)濾時(shí)，實(shí)驗(yàn)員將燒杯的錫箔取出，通過(guò)布氏漏斗對(duì)勻漿進(jìn)行真空過(guò)濾，由于光線的照射，使得β-胡蘿卜素的濃度低于正常值。此外，當(dāng)使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器干燥圓底燒瓶時(shí)，助手應(yīng)在此過(guò)程中除去錫箔。幸運(yùn)的是，標(biāo)準(zhǔn)函數(shù)中的確定系數(shù)非常接近1（R2=0.995 3），這意味著4 個(gè)梯度標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)非常匹配。

在第2 個(gè)實(shí)驗(yàn)中，主要的誤差來(lái)自于溶液的定容和光照。由于透視上的差異，在這個(gè)過(guò)程中，改變了溶液體積，這可能導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的偏差。另一個(gè)產(chǎn)生誤差的原因是，當(dāng)溶液轉(zhuǎn)移到HPLC 小瓶時(shí)，β-胡蘿卜素溶液的梯度濃度被倒入不同的燒杯中，在此期間，標(biāo)準(zhǔn)溶液暴露在光下。

4.2 方法比較

測(cè)定β-胡蘿卜素的方法還有很多，例如，紫外分光光度法和紙色譜法。

4.2.1 紫外分光光度法

對(duì)于紫外分光光度法而言，該方法檢測(cè)β-胡蘿卜素的優(yōu)點(diǎn)在于，它能夠以簡(jiǎn)單、快速的方式檢測(cè)成分，同時(shí)不會(huì)污染環(huán)境和降低成本；更重要的是，其具有較高的重現(xiàn)性和重復(fù)性，但主要缺點(diǎn)是精度不夠高[4]。

其操作方法如下:

樣品在玻璃燒杯中稱取1 g，振蕩15 min，向燒杯中加入5 mL 冷丙酮，溫度控制在約4℃，最后高速離心10 min，上層分離的上清液在另一管中收集。5 mL 丙酮和再萃取將活性化合物混合并離心，然后取上清液與第1 個(gè)上清液混合，將上清液通過(guò)Whatman 第42 號(hào)濾紙，在紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)中以449 nm 波長(zhǎng)測(cè)定提取物的吸光度。

對(duì)胡蘿卜樣品的空白溶液進(jìn)行梯度濃縮稀釋處理，提取方法與上述方法相同。通過(guò)后插法將光密度值繪制為濃度對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而計(jì)算β-胡蘿卜素的含量。

4.2.2 紙色譜法

紙色譜法利用混合物的不同極性和溶解性來(lái)實(shí)現(xiàn)分離，紙色譜法的優(yōu)點(diǎn)是分離效率高，但操作步驟更為復(fù)雜，在進(jìn)行大量的數(shù)據(jù)分析和處理時(shí)，有許多限制因素，而且不夠精確[5]。

其操作方法如下:

將濾紙切割成12 cm×14 cm 的形狀，確保邊緣必須垂直，在紙邊緣用鉛筆畫出1.5～2 cm 的線，將胡蘿卜汁浸入毛細(xì)血管中，放在鉛筆畫的直線上，重復(fù)多次，直到直線上有一個(gè)大約2 cm 的小圓圈，將12 cm 的端部卷成圓柱形，并使用回形針固定端部。將紙卷和一定量的分離液放入燒杯中，將燒杯密封5 min，然后取出濾紙，觀察β-胡蘿卜素的運(yùn)動(dòng)并記錄最遠(yuǎn)的距離，最后計(jì)算β-胡蘿卜素的距離顏色行程/溶劑前行程即Rf 值。

4.3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的改進(jìn)

實(shí)驗(yàn)中存在一定的誤差，這一系列結(jié)果之間的一致性程度可以通過(guò)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢驗(yàn)。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的定義是:同一方法、同一試劑、同一樣品進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn)，2 個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)結(jié)果在概率水平為95%時(shí)的最大差異，由于一個(gè)實(shí)驗(yàn)的偶然性，它是需要多次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以提高準(zhǔn)確性。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)之所以重要，是因?yàn)闊o(wú)論是在機(jī)器加工上還是在樣品制備過(guò)程中，通常都會(huì)有一些誤差，但重復(fù)性實(shí)驗(yàn)可以大大減少這些誤差。MENT 是最佳選擇，從統(tǒng)計(jì)學(xué)的角度來(lái)看，為了減少每組數(shù)據(jù)之間和每組數(shù)據(jù)內(nèi)的誤差，進(jìn)行了多次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，同時(shí)計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差以確定重復(fù)性的成功，通常標(biāo)準(zhǔn)偏差值越小，重復(fù)性越好[6]。

在本實(shí)驗(yàn)中，誤差可分為人為誤差和系統(tǒng)誤差兩大類。為了減少系統(tǒng)誤差，首先要做的是校準(zhǔn)儀器。例如，在本實(shí)驗(yàn)中，可以在實(shí)驗(yàn)前向高效液相色譜中注入空白對(duì)照溶液，通過(guò)峰圖確定機(jī)器是否可以正常使用；另一種減小誤差的方法是多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，因此也可以多次注入樣品溶液，并比較從機(jī)器獲得的數(shù)據(jù)。通過(guò)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差，可以選擇最小值的數(shù)據(jù)，這是一種減少系統(tǒng)誤差的方法。

對(duì)于人為錯(cuò)誤，這可以通過(guò)團(tuán)隊(duì)來(lái)減少錯(cuò)誤的發(fā)生。例如，在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，β-胡蘿卜素樣品溶液可以被同一個(gè)團(tuán)隊(duì)多次配置，每個(gè)團(tuán)隊(duì)成員都將被分配任務(wù)，并且團(tuán)隊(duì)成員可以互相監(jiān)督以遵守實(shí)驗(yàn)的步驟，每個(gè)步驟都將遵循實(shí)驗(yàn)規(guī)則，避免了單一樣品溶液中的偶然誤差，最后通過(guò)對(duì)高效液相色譜分析數(shù)據(jù)的比較，選擇標(biāo)準(zhǔn)偏差最小的數(shù)據(jù)集作為最合適的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。