呂曉楠 徐立蒲 張 文 王小亮 曹 歡 王靜波 王 姝

（北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站 北京 100176）

1 前言

傳染性造血器官壞死病（Infectious Hematopoietic Necrosis，IHN）是由傳染性造血器官壞死病毒（Infectious Hematopoietic Necrosis Virus，IHNV）感染引起，嚴(yán)重危害虹鱒（含金鱒）等鮭科魚(yú)類的一種急性冷水魚(yú)病毒性傳染病，分布廣泛、發(fā)病率高，對(duì)我國(guó)鮭鱒魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大危害[1-4]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將IHN 列為必須申報(bào)的動(dòng)物疫病。近年來(lái)，隨著水生動(dòng)物及其產(chǎn)品的進(jìn)出口貿(mào)易，IHNV也隨之在世界范圍內(nèi)擴(kuò)散，造成該病的感染率急劇增加，因此，IHN 的檢測(cè)和防治顯得愈發(fā)重要[5,6]。

該病的病原為IHNV，屬?gòu)棤畈《究芌habdoviridae，基因組為不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA。目前檢測(cè)IHNV 的方法主要有細(xì)胞分離培養(yǎng)、ELISA 和RT-PCR 方法等，均需借助專業(yè)設(shè)備完成檢測(cè)，缺少能夠現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)IHNV 的快速檢測(cè)技術(shù)[7-9]。本文通過(guò)一系列的引物設(shè)計(jì)篩選、體系建立以及試驗(yàn)驗(yàn)證等工作，建立了針對(duì)IHN 的逆轉(zhuǎn)錄重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增（Reverse Transcription Recombinase -Aid Amplifica -tion，RT-RAA）檢測(cè)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)快速、靈敏的檢測(cè)IHNV。在養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生疑似IHNV 感染時(shí)，可及時(shí)進(jìn)行方便、快速的檢測(cè)，為IHN 的控制提供一種有效的工具。

2 材料與方法

2.1 樣品來(lái)源

健康和患病的魚(yú)樣品均由北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站水生動(dòng)物疾病檢測(cè)技術(shù)中心收集及保藏。35 份IHNV 的檢測(cè)樣品均來(lái)自北京、新疆、貴州、云南、陜西、甘肅等虹鱒（含金鱒）養(yǎng)殖場(chǎng)。傳染性鮭魚(yú)貧血病毒（Infectious Samon Anaemia Virus，ISAV）、傳染性胰臟壞死病毒（Infectious Pancreatic Necrosis Virus，IPNV）和病毒性出血性敗血癥病毒（Viral Hemorrhagic Septicemia Virus，VHSV）樣品均由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

2.2 主要試劑與儀器

PCR 儀（Veriti 96 well Thermal cycler，Applied Biosystems）；熒光 PCR 儀（7500 real timePCR system，Applied Biosystems）；電泳儀（DYY-6C，北京六一儀器廠）；凝膠成像儀（ChampGel5000,北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司）。

RNeasy Mini Kit 試劑盒（QIAGEN，德國(guó)）；RTRAA 恒溫?zé)晒鈾z測(cè)試劑盒（杭州眾測(cè)生物技術(shù)有限公司）；2×Power Taq PCR MasterMix（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）；引物和探針(上海生工)。

2.3 方法

2.3.1 RT-RAA 引物的設(shè)計(jì)

以NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中IHNV G 基因序列為靶位點(diǎn)，依據(jù)RT-RAA 引物設(shè)計(jì)原則，采用DNAMAN 6.0 軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析，選取同源性高的片段，用primer primer 5.0 進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，詳見(jiàn)表1。

表1 IHNV 引物和探針序列

2.3.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與定量

由北京華大基因合成IHNV G 基因序列（1527bp），并克隆至pUC57 載體上，構(gòu)建成標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pUC57-IHNV，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度約為269.4ng/μL，推算出pUC57-IHNV 質(zhì)粒拷貝數(shù)大約是 6.39×1010copies/μL。

2.3.3 RNA 的提取

樣品取魚(yú)肝、腦、脾、腎組織，勻漿后加含M199 細(xì)胞培養(yǎng)液（含10%的胎牛血清、1000IU/mL 的青霉素和1000IU/mL 的鏈霉素），4℃下 6 000 r/min 離心 20 min，收集上清液用于RNA 的提取。

2.3.4 實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄重組酶介導(dǎo)核酸擴(kuò)增反應(yīng)條件

RT-RAA 反應(yīng)體系配方表詳見(jiàn)表2。

表2 RT-RAA 反應(yīng)體系配方表

按照表2配置反應(yīng)體系，混合均勻，加入到RTRAA 熒光反應(yīng)單元干粉管中，使干粉重懸均勻，瞬時(shí)離心。再向每個(gè)反應(yīng)管中加入2.5 μL B Buffer 反應(yīng)液（內(nèi)含MgAc）。將上述反應(yīng)溶液放到熒光PCR儀中，37℃反應(yīng)20 min。陰、陽(yáng)性對(duì)照按照同樣方法進(jìn)行操作。

2.3.5 靈敏度實(shí)驗(yàn)

為了比較本文建立的RT-RAA 檢測(cè)方法與國(guó)際OIE 提供的參考方法RT-PCR 的檢測(cè)靈敏度，將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pUC57-IHNV 進(jìn)行10 倍系列稀釋，濃度分 別為 105copies/μL、104copies/μL、103copies/μL、102copies/μL、101copies/μL。每個(gè)稀釋度取 2 μL 作為模板分別加入到RT-RAA 和RT-PCR 反應(yīng)體系中，分別參照對(duì)應(yīng)的方法進(jìn)行擴(kuò)增、比較。

2.3.6 特異性驗(yàn)證

利用本實(shí)驗(yàn)室確定的IHNV 陽(yáng)性樣品和3 份IHNV 為陰性的其他鮭鱒RNA 病原陽(yáng)性樣品（包括ISAV、IPNV 和 VHSV）作為 RT-RAA 檢測(cè)模板，分別加入到RT-RAA 反應(yīng)體系中，以測(cè)試本研究建立的IHNV RT-RAA 檢測(cè)方法的特異性。

2.3.7 與其他檢測(cè)方法檢測(cè)符合性的比較

用本文所建立的RT-RAA 檢測(cè)方法與GB/T 15805.2—2017《傳染性造血器官壞死病診斷規(guī)程》[10]中RT-PCR 方法對(duì)35 個(gè)虹鱒（含金鱒）養(yǎng)殖場(chǎng)樣品進(jìn)行檢測(cè)。采用OIE《水生動(dòng)物診斷試驗(yàn)手冊(cè)》推薦的診斷敏感性和診斷特異性計(jì)算方法，對(duì)2 種方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。

3 結(jié)果

3.1 RT-RAA引物的設(shè)計(jì)和篩選

經(jīng)過(guò)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中多條IHNV-G 基因序列的比對(duì)，選取同源性較高的片段，共設(shè)計(jì)3 對(duì)引物和1條探針（具體信息表1）。以IHNV 質(zhì)粒pUC57-IHNV為模板，分別對(duì)這些引物進(jìn)行測(cè)試，選取擴(kuò)增信號(hào)強(qiáng)，擴(kuò)增時(shí)間短的引物組合（IHNV-1-F/IHNV-1-R），作為最終選擇的引物，進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

3.2 RT-RAA檢測(cè)IHNV的靈敏度

將梯度稀釋的 105～101copies/μL 的 IHNV 陽(yáng)性質(zhì)粒為模板，加入到檢測(cè)管中對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，從熒光結(jié)果（圖1）可以看出，100 copies/μL 的陽(yáng)性質(zhì)粒有明顯的熒光值，表明IHNV 的RT-RAA 恒溫?zé)晒饪焖贆z測(cè)方法靈敏度為100 copies/μL。RT-PCR 方法檢測(cè)結(jié)果顯示（圖2），其最低能檢測(cè)到質(zhì)粒濃度為100 copies/μL。綜上建立的IHNV RT-RAA 檢測(cè)方法和國(guó)際OIE 提供的參考方法IHNV G 基因的RT-PCR 方法靈敏度相當(dāng)，且RT-RAA 檢測(cè)時(shí)間為20 min，而RT-PCR 檢測(cè)時(shí)間（包含核酸電泳）至少需要210 min。

3.3 RT-RAA檢測(cè)IHNV的特異性

利用本文研發(fā)的IHNV 的RT-RAA 恒溫?zé)晒饪焖贆z測(cè)方法對(duì)1 份IHNV 陽(yáng)性樣品和3 份IHNV為陰性的其他鮭鱒病原陽(yáng)性樣品，包括ISAV、IPNV和VHSV 進(jìn)行檢測(cè)，從熒光結(jié)果（圖3）可以看出，除IHNV 陽(yáng)性樣品有熒光值以外，陰性對(duì)照和其他鮭鱒樣品均未檢測(cè)到熒光信號(hào)。結(jié)果表明，IHNV 的RT-RAA 恒溫?zé)晒饪焖贆z測(cè)方法對(duì)含有其他鮭鱒病原核酸的樣品RNA 無(wú)交叉反應(yīng)，該技術(shù)具有良好的特異性。

圖1 RT-RAA 檢測(cè)方法的最低檢測(cè)限

圖2 RT-PCR 檢測(cè)方法的最低檢測(cè)限

圖3 RT-RAA 特異性分析

3.4 RT-RAA方法和RT-PCR方法符合性的比較

利用本文建立的IHNV RT-RAA 方法和國(guó)際OIE 推薦的參考方法RT-PCR 對(duì)來(lái)自全國(guó)6 個(gè)省市的35 份虹鱒（含金鱒）養(yǎng)殖場(chǎng)的樣品進(jìn)行檢測(cè)，部分樣本的檢測(cè)結(jié)果詳見(jiàn)圖4和圖5。采用RT-PCR 方法的陽(yáng)性檢出率為（25/35），采用本文建立的RTRAA 方法的陽(yáng)性檢出率為（23/35）。根據(jù) OIE《水生動(dòng)物診斷實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》 推薦的診斷敏感性和診斷特異性計(jì)算方法，本文建立的RT-RAA 方法對(duì)IHNV 檢測(cè)結(jié)果在診斷特異性上的符合率為100%，在診斷敏感性上的符合率為92%。說(shuō)明RT-RAA 方法基本可以用來(lái)檢測(cè)IHNV，且檢測(cè)準(zhǔn)確快速，20 min 內(nèi)即可完成檢測(cè)。

圖4 RT-RAA 方法檢測(cè)實(shí)際樣本

圖5 RT-PCR 方法檢測(cè)實(shí)際樣本

4 討論

自1985年以來(lái)，我國(guó)已相繼在多地發(fā)現(xiàn)并報(bào)道IHN 疫情，該病給鮭鱒魚(yú)的養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[11-14]。2008年，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部《一、二、三類動(dòng)物疫病病種名錄》將其列為二類動(dòng)物疫病，隨后該病還列入國(guó)家動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)計(jì)劃。由于該病尚無(wú)有效的治療方法，在病原的早期快速檢測(cè)對(duì)疾病的控制至關(guān)重要。

目前OIE 推薦的諸多診斷方法中，病毒分離、中和試驗(yàn)等傳統(tǒng)病毒檢測(cè)方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力；ELISA 等免疫學(xué)檢測(cè)方法，具有快速高通量的優(yōu)點(diǎn)，但前期需準(zhǔn)備特異性抗體，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，并且操作步驟煩瑣，存在一定漏檢情況。國(guó)內(nèi)由于受到抗體來(lái)源的限制，免疫學(xué)技術(shù)方面的研究比較缺乏；目前RT-PCR 是較為常見(jiàn)檢測(cè)IHNV 的分子生物學(xué)方法，但檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、對(duì)儀器設(shè)備溫度精準(zhǔn)度和人員操作技術(shù)要求極高、設(shè)備投入大且容易造成氣溶膠污染。因此上述方法均不適用于IHNV 的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

逆轉(zhuǎn)錄重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)（RT-RAA）是通過(guò)設(shè)計(jì)RT-RAA 引物，采用源于真菌或細(xì)菌的重組酶，并結(jié)合RNA 逆轉(zhuǎn)錄酶以及DNA 聚合酶，替代了PCR 高溫變形循環(huán)過(guò)程，從而實(shí)現(xiàn)了在37℃～39℃常溫條件下，快速、靈敏檢測(cè)目的基因片段。RTRAA 方法靈敏度高、特異性好、可將RNA 直接作為模板，無(wú)需額外逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程、操作流程簡(jiǎn)便、檢測(cè)周期短、不需要高溫循環(huán)，沒(méi)有升降溫處理、不需要昂貴PCR 儀器（僅需攜帶手持便攜恒溫裝置），結(jié)合熒光探針能夠?qū)崿F(xiàn)實(shí)時(shí)檢測(cè)以及現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)[15-20]。

本文以IHNV 高度保守G 基因?yàn)槟０妫O(shè)計(jì)特異性RT-RAA 引物和探針，建立了IHNV 的逆轉(zhuǎn)錄重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)。結(jié)合RNA 提取法，不需要單獨(dú)逆轉(zhuǎn)錄RNA 以及凝膠電泳等其他輔助，操作簡(jiǎn)單無(wú)需專業(yè)人員操作，僅需將樣本放入37℃恒溫反應(yīng)20 min，即可通過(guò)熒光曲線來(lái)判斷樣品是否感染了IHNV。本方法可最低檢測(cè)到100 個(gè)病毒拷貝，靈敏度與RT-PCR 方法相當(dāng)，且檢測(cè)時(shí)間縮短為RT-PCR 的1/10。本方法還具有良好的特異性，僅與IHNV 特異性的發(fā)生反應(yīng)，而與IPNV 等3 種鮭鱒魚(yú)病病原RNA 均不發(fā)生交叉反應(yīng)。

采用本方法和RT-PCR 方法同時(shí)對(duì)35 份虹鱒（含金鱒）樣品進(jìn)行檢測(cè)2 種方法的檢測(cè)結(jié)果符合率為96%，在診斷特異性上的符合率為100%，在診斷敏感性上的符合率為92%。本文建立的RT-RAA 檢測(cè)方法可高效、準(zhǔn)確、快捷地從虹鱒（含金鱒）樣品中檢測(cè)到IHNV 陽(yáng)性。值得注意的是，用RT-RAA 方法檢測(cè)實(shí)際樣本時(shí)，有2 份陽(yáng)性樣品擴(kuò)增信號(hào)偏弱，這對(duì)結(jié)果判定造成干擾，提示在后續(xù)研究中需要進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)體系提高檢測(cè)靈敏度。

綜上所述，本文建立的IHNV 實(shí)時(shí)熒光RTRAA 核酸檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單、特異性好、靈敏度高，反應(yīng)只需要20 min，大大縮短了反應(yīng)時(shí)間，擺脫了復(fù)雜儀器的束縛，完全滿足基層、小型實(shí)驗(yàn)室或現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需求，為IHNV 快速檢測(cè)提供了一種新的技術(shù)與方法。該技術(shù)具有廣泛的應(yīng)用場(chǎng)景，將為IHNV 控制措施提供檢測(cè)技術(shù)支撐。