李 桑 陳星蓉 汪玉玲 廖素溪

（廣東省食品檢驗所 廣東廣州 510435）

1 前言

隨著社會經(jīng)濟(jì)不斷發(fā)展，人民生活水平在不斷提高，對吃的需求不僅限于溫飽，對食品的質(zhì)量要求也越來越高。隨著食品行業(yè)迅猛發(fā)展，作為最受歡迎的飲料已經(jīng)成為了其中的佼佼者，甜味劑也應(yīng)運(yùn)而生。甜味劑種類較多，按其來源可分為天然甜味劑和人工合成甜味劑。天然甜味劑有甜菊糖、甘草、甘草酸二鈉、甘草酸三鉀和甘草酸三鈉等；人工合成甜味劑有糖精、糖精鈉、環(huán)己基氨基磺酸鈉、天門冬酰苯丙氨酸甲酯、阿力甜等。葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉糖和乳糖等糖類物質(zhì)，雖然也是天然甜味劑，但因長期被人食用，且是重要的營養(yǎng)素，通常視為食品原料，在我國不作為食品添加劑。

三氯蔗糖又名三氯半乳蔗糖[1]、蔗糖素、4,1,6-三氯-4,1,6,-三脫氧半乳型蔗糖，是一種白色或近白色結(jié)晶性粉末的蔗糖衍生物，其甜度約為蔗糖的600 倍，口味純正，沒有任何異味或苦澀味，甜味特征曲線幾乎與蔗糖重疊，具有很好的溶解性和穩(wěn)定性，又兼具低熱量、高甜度的特點。相比高熱量、低甜度的食品添加劑[2]——食糖，三氯蔗糖越來越普遍用于飲料中，被認(rèn)為是當(dāng)今最理想的甜味劑。但三氯蔗糖對人體健康也可能產(chǎn)生一些危害[3]，所以我國對三氯蔗糖的添加有一定的限量[4]。

食品中三氯蔗糖測定方法包括離子色譜法[5-7]、高效液相色譜法[8-14]、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）[15]、液相色譜法（LC-MS）[16]、紅外光譜法[17]等。各種方法有各自特點，精度和準(zhǔn)度也存在一定差別，依據(jù)具體的實際條件和要求可選擇不同的三氯蔗糖的測定方法，目前以高效液相色譜法為主。經(jīng)大量實際實驗發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有的食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 22255—2014《食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的測定》[18]中對于飲料中的三氯蔗糖的測定，具有檢測過程長、靈敏度低、實驗試劑毒副作用大等缺點。實驗試劑的毒副作用尤其需要注意，對其使用、回收及處理等都需要嚴(yán)格的要求。對于如何降低或消除實驗試劑的毒副作用，一直是科研工作者的研究熱點。同時，隨著人們環(huán)保意識的提高，亟待開發(fā)出更為綠色環(huán)保的檢測技術(shù)。孫曉娟等比較了蒸發(fā)光散色檢測器和示差檢測器在檢測中的應(yīng)用[19]。有關(guān)高效液相色譜法檢測三氯蔗糖的方法中，毒副作用試劑的替代還未見報道。

本研究對GB 22255—2014 規(guī)定的食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的測定方法進(jìn)行了改進(jìn)，使用了不同類型的色譜柱進(jìn)行檢測，對儀器分析條件進(jìn)行了優(yōu)化，通過比較不同色譜柱的檢測條件，提供了更為綠色環(huán)保的檢測方法。

2 材料與方法

2.1 儀器與試劑

島津高效液相色譜儀（配RID-20A 示差折光檢測器，島津企業(yè)管理（中國）有限公司）；MS 105DU分析天平(瑞士 METTLER TOLEDO 公司)；KQ-500B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AutoEVA-60 氮吹儀（美國 Reeko 公司）。

Oasis HLB 固相萃取柱（美國 Waters 公司）（200 mg，類型為N-乙烯基吡咯烷酮和二乙烯苯親水親脂平衡型填料），使用前依次用4 mL 甲醇、4 mL水活化；0.45 μm 濾膜（美國 Agilent Technologies 公司）。

三氯蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度為98.8%，北京曼哈格生物科技有限公司）；乙腈、甲醇（色譜純，德國默克股份兩合公司）；甲醇、磷酸氫二鉀（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）。

2.2 實驗方法

2.2.1 色譜條件

國標(biāo)方法:C18 反相色譜柱（4.6mm×150mm，5μm，日本GL Sciences 公司）；柱溫:35℃；檢測池溫度:35℃；進(jìn)樣量:20 μL；流速:1.0 mL/min，流動相:乙腈:水=89∶11（V：V）。

方法一:C18 反相色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm，日本GL Sciences 公司）；柱溫:35℃；檢測池溫度:35℃；進(jìn)樣量:20 μL；流速:0.8 mL/min，流動相:甲醇:0.125%磷酸氫二鉀=40：60（V：V）。

方法二:Hi-Plex H 色譜柱（300 mm×7.7 mm，美國安捷倫科技有限公司）；柱溫:65℃；檢測池溫度:35℃；進(jìn)樣量:20 μL；流速:0.8 mL/min，流動相:超純水。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液:精確稱取三氯蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品0.100 g于10 mL 容量瓶中，用超純水溶解完全后，定容至刻度，濃度約為10 mg/mL，放入2～8℃箱中儲存?zhèn)溆茫Ｙ|(zhì)期6 個月。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制

分別精確移取三氯蔗糖標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋成以下濃度:20 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L，進(jìn)樣量為 20 μL。以濃度（X，mg/L）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y，mV·min）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

2.2.4 樣品前處理方法

精確稱取5 g（精確到0.001 g）試樣，置于25 mL塑料離心管中，加入5 mL 超純水稀釋，渦旋混合器上震蕩 30 min，以 3 000 r/min 離心 10 min。取全部上清液移入預(yù)先活化的固相萃取柱，控制液體流速為1 滴/s，柱上液面為2 mm 左右時，加入1 mL 的超純水，繼續(xù)保持液體流速不超過1 滴/s，至柱中液體完全排出后，用3 mL 甲醇洗脫，收集甲醇洗脫液。將洗脫液置于氮吹儀中吹干，殘渣用1.00 mL 流動相溶解，溶液過0.45 μm 濾膜，濾液為制備的試樣溶液，備用。

3 結(jié)果與分析

3.1 色譜條件的比對

在之前的預(yù)實驗中，已經(jīng)優(yōu)化了C18 反相色譜柱的實驗條件，驗證了方法一的實驗不僅能夠達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)要求，且更為省時、節(jié)約試劑[20]。

本次實驗主要對比不同色譜柱條件下的實驗結(jié)果。檢測色譜圖詳見圖1，陽性樣品回收率實驗結(jié)果詳見表1，陰性樣品回收率實驗結(jié)果詳見表2。

由圖1（a）、（b）可以看出，方法一與方法二在三氯蔗糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為20 mg/L 時均有良好的響應(yīng)值，且方法一的出峰時間較快。

通過t 檢驗兩種方法得出的陽性樣品濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。根據(jù)表1可以看出，兩種方法在樣品的加標(biāo)回收率均在95%以上，具有良好的回收率。

在陰性樣品中加入濃度2.5 g/kg 的三氯蔗糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)表2可以看出，兩種方法在樣品的加標(biāo)回收率均在95%以上，具有良好的回收率。

圖1 三氯蔗糖標(biāo)品色譜圖

表1 飲料（陽性樣品）中三氯蔗糖加標(biāo)回收率試驗（n=4）

表2 飲料（陰性樣品）中三氯蔗糖加標(biāo)回收率試驗（n=4）

3.2 檢出限及定量限

三氯蔗糖加標(biāo)濃度為2.5 mg/L 的陰性樣品，稱樣量為5 g、進(jìn)樣量為20 μL 時，方法一的檢出限為0.000 5 g/kg，方法二的檢出限為0.000 5 g/kg，均低于國標(biāo)方法中的檢出限0.002 5 g/kg，可以滿足測定的需要。

3.3 精密度試驗

對同一含量樣品進(jìn)行6 次測定，方法一與方法二的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 分別為0.2%、0.1%。

如圖2所示，三氯蔗糖的濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系，濃度（X，mg/L）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y，mV·min）為縱坐標(biāo)，方法一的回歸方程為Y=930.3X+201.1，相關(guān)系數(shù)為 0.999 9，線性范圍 20～400 mg/L；方法二的回歸方程為Y=906.4X-727.0，相關(guān)系數(shù)為1，線性范圍 20～400 mg/L。

圖2 線性試驗結(jié)果圖

4 結(jié)論

本研究中采用的兩種非國標(biāo)方法檢測飲料中的三氯蔗糖，操作穩(wěn)定，在精密度、準(zhǔn)確度、檢出限等方面都能完全滿足日常分析的需要，與國家檢測標(biāo)準(zhǔn)及一些學(xué)者[21,22]的研究結(jié)果相比，加快了分析速度，提高了靈敏度。方法一用甲醇代替乙腈，毒性和成本都有所降低；加入了鹽，穩(wěn)定性得到了提高，加快了檢測器的平衡，節(jié)約了流動相的使用，檢測效率提高，與甘賓賓等的研究結(jié)果一致，適合日常大量的飲料樣品檢測工作；與陳曉霞等[23]的研究相比，降低了柱溫與檢測溫度，降低了對色譜柱的損耗，延長了色譜柱的使用壽命。方法二使用了與王桂華等研究中同樣的水性色譜柱，使用超純水作為流動相較易配制，但出峰時間較晚，較為浪費試劑。從有益于環(huán)保的角度出發(fā)，使用水柱的廢液相較于有機(jī)相廢液更易處理，且節(jié)約了金錢成本。讀者可以就自己的實際情況選擇適合自己的方法進(jìn)行試驗。

往后的工作，可以繼續(xù)深究兩種方法是否能夠運(yùn)用到其他類型樣品的檢測，也可以繼續(xù)優(yōu)化前處理方法，減少整個實驗周期的時間，提高檢測效率。