李 偉 莊濠宇 溫爾英 張崢嶸 黃琦容 周廣彪*

（1.梅州海關(guān) 廣東梅州 514021；2.揭陽海關(guān)；3.汕頭海關(guān)）

1 前言

創(chuàng)傷弧菌(Vibrio Vulnificus)廣泛存在于蟹、蝦等水生動物中，是海水養(yǎng)殖及加工產(chǎn)品中常見的致病性弧菌。創(chuàng)傷弧菌具有暴發(fā)性強(qiáng)、死亡率高、不易控制等特點(diǎn)，一旦暴發(fā)就難于控制，往往帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。同時，創(chuàng)傷弧菌還是一種人與動物共患的致病菌，誤食其污染的海產(chǎn)品，容易造成原發(fā)性敗血癥和軟組織感染，是引起食物中毒最為嚴(yán)重的食源性疾患之一。因此，對創(chuàng)傷弧菌進(jìn)行快速檢測，在食品安全領(lǐng)域具有很重要的意義[1]。

目前，創(chuàng)傷弧菌的檢測以常規(guī)的微生物法為主，該法存在檢測時間長、靈敏度低、操作煩瑣、受環(huán)境及主觀因素影響較大等缺陷，同時創(chuàng)傷弧菌由于受饑餓和物理系壓力等因素影響，可能進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)(Viable But Non-Culturable State,VBNC)[2]，從而不能被常規(guī)方法所檢測。由于常規(guī)方法的諸多缺陷，建立一種快速、準(zhǔn)確的現(xiàn)代食品安全監(jiān)督檢測的實(shí)驗(yàn)方法勢在必行。在諸多食源性致病菌檢測手段中，重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）是一種由重組酶、單鏈 DNA 結(jié)合蛋白和鏈置換Bsu 聚合酶參與的恒溫擴(kuò)增新技術(shù),是近年來建立的一種新的核酸恒溫擴(kuò)增技術(shù)。該法具有操作簡單、靈敏度高、特異性強(qiáng)、可在短時間內(nèi)快速擴(kuò)增出目的片段等優(yōu)點(diǎn), 在早期的動物疫病診斷、現(xiàn)場查驗(yàn)、進(jìn)出口商品快速檢疫等方面具有良好的應(yīng)用潛力[3-6]。

擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)一般是將一段人工構(gòu)建的DNA 序列或一段致病菌的看家基因序列，添加到PCR 反應(yīng)體系中，用于指示是否存在假陰性現(xiàn)象。在PCR 反應(yīng)時，既定序列與目標(biāo)基因一起進(jìn)行擴(kuò)增，如果操作失誤或存在較多抑制物時，本該擴(kuò)增的內(nèi)標(biāo)片段不能被擴(kuò)增，從而達(dá)到指示反應(yīng)假陰性的目的[7]。

由于受抑制劑等因素的影響，在RPA 檢測中也容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果，在一定程度上限制了其在實(shí)際檢測工作中的應(yīng)用。針對RPA 反應(yīng)中存在的假陰性而影響其檢測準(zhǔn)確性的問題，本文擬根據(jù)編碼創(chuàng)傷弧菌gryB 的基因保守序列，設(shè)計RPA 檢測的引物對，將一條人工構(gòu)建的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)引入RPA 檢測體系，以克服上述假陰性的問題，建立一種適用于現(xiàn)場快速檢驗(yàn)創(chuàng)傷弧菌的技術(shù)方法，并測試其特異性和靈敏度[8-10]。

2 材料與方法

2.1 材料與試劑

標(biāo)準(zhǔn)菌株:創(chuàng)傷弧菌（ATCC27562）、腸炎弧菌（ATCC17802）、擬態(tài)弧菌（ATCC33653）、河流弧菌（ATCC33809）、溶藻弧菌（ATCC17749）、霍亂弧菌（ATCC39315）、哈維弧菌（ATCC33842）、沙門菌（ATCC14028）、大腸埃希菌（ATCC25922）、金黃色葡萄球菌（ATCC25923）和單增李斯特菌（ATCC19114），采購自美國MBL 公司、中國科學(xué)院水生生物研究所和廣東食品微生物安全工程技術(shù)研究開發(fā)中心；擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒和引物來源于生工生物工程（上海）股份有限公司；電泳級瓊脂糖、DNA Marker 及顯色劑來源于寶生物工程（大連）有限公司；RPA 擴(kuò)增試劑盒為 TwistDX 公司產(chǎn) TwistAmp Basic Kits；核酸提取試劑盒購自天根生化科技有限公司（批號:DP302）；本次試驗(yàn)樣品來源于汕頭海關(guān)技術(shù)中心2018年法定和委托檢驗(yàn)中的留樣。

2.2 主要儀器與設(shè)備

主要儀器與設(shè)備見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備

2.3 方法

（1）核酸樣本提取依據(jù)相關(guān)規(guī)定要求將上述標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行復(fù)壯增菌及生化鑒定，再按照天根生化科技有限公司核酸提取試劑盒（批號:DP302）要求提取樣本中的核酸，樣本核酸濃度和純度的測定由核酸蛋白分析儀檢測并統(tǒng)一稀釋為100 ng/μL 備用。

（2）引物設(shè)計RPA 引物設(shè)計根據(jù)試劑盒中的要求，查閱Gen Bank 公布的gryB 基因的保守序列(KC821520.1)，利用Oligo V6.22 軟件進(jìn)行其引物的設(shè)計和選擇再利用Primer Blast (NCBI 官網(wǎng))進(jìn)行其特異性的確認(rèn)，其合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。其最終設(shè)計檢測創(chuàng)傷弧菌的RPA 引物擴(kuò)增條帶234 bp，具體序列如下:上游引物:5′-GCTTGAATACCACCTTCATACATGAAGTGATC-3′；下游引物:5′-TCATGGTGTGCCTGATGCACCGCTTG CTAT-3′。

（3）擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)制備原始序列272 bp 來源于Genbank 登錄號為 DQ452569.1，且標(biāo)題為 Sus scrofa beta actin (ACTB) gene,partial cds 中 489-760 的一段序列，將序列2 端人為添加對應(yīng)檢測弧菌的RPA引物序列（上游原始序列及下游反向互補(bǔ)序列），交由上海生工進(jìn)行基因合成，將質(zhì)控合格的質(zhì)粒凍干粉稀釋到 10 ng/μL 備用。

具體所用擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)序列（334 bp）如下:

GCTTGAATACCACCTTCATACATGAAGTGATC GTTCGAGACCTTCAACACCCCAGCCATGTACGTGG CCATCCAGGCGGTGCTGTCCCTGTACGCCTCTGGC CGCACCACTGGCATCGTGATGGACTCCGGAGACG GGGTCACCCACACGGTGCCCATCTACGAGGGGTA CGCCCTGCCCCACGCCATCCTGCGTCTGGACCTGG CTGGCCGGGACCTGACCGACTACCTCATGAAGATC CTGACGGAGCGGGGCTACAGCTTCACCACCACGG CCGAGCGGGAGATCGTGCGGGACATCAAGGATAG CAAGCGGTGCATCAGGCACACCATGA

（4）RPA 擴(kuò)增以（1）中提取的核酸為母板，采用（2）中合成的引物進(jìn)行RPA 擴(kuò)增，以一級水為陰性對照，實(shí)驗(yàn)溫度為37℃、擴(kuò)增為40 min。RPA 擴(kuò)增體系的配制方法具體參照周廣彪等人[11]發(fā)表的《重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（RPA）檢測擬態(tài)弧菌》中RPA 檢測方法的建立。

（5）RPA 擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)用量確認(rèn)采用10 倍梯度稀釋法對從創(chuàng)傷弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株中提取的核酸進(jìn)行稀釋，依次稀釋成5 個梯度濃度，并以稀釋的核酸作為測試的母板。分別添加20 ng 和10 ng 共2 個內(nèi)標(biāo)用量，按照（4）所示的RPA 檢測反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)用量實(shí)驗(yàn)。

（6）方法特異性評價按照前述建立的RPA-IAC檢測反應(yīng)體系，特異性測試時模板核酸均使用100 ng，擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)用量 10 ng，RPA 擴(kuò)增 40 min，對前述 11 種標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因組核酸進(jìn)行檢測，評價建立的RPA-IAC 檢測方法特異性。

（7）RPA-IAC 檢測方法靈敏度評價采用 10 倍梯度稀釋法對從創(chuàng)傷弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株中提取的核酸進(jìn)行稀釋，依次稀釋成5 個梯度濃度，并以稀釋的核酸作為測試的母板，按照（4）所示的RPA-IAC 檢測反應(yīng)體系進(jìn)行靈敏度實(shí)驗(yàn)，能見到明顯條帶的最低濃度梯度即為RPA-IAC 檢測體系靈敏度。

（8）RPA-IAC 應(yīng)用效果測試將創(chuàng)傷弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行活化，取1mL 活化后的菌液按10 倍梯度進(jìn)行稀釋，根據(jù)其麥?zhǔn)隙韧茰y細(xì)菌濃度，再將稀釋液加入魚糜中制備成梯度為106～100cfu/g 的測試樣本，再將測試樣增菌后提取核酸，使用建立的RPA-IAC方法測試應(yīng)用檢測效果。

3 結(jié)果

3.1 擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)用量及RPA-IAC檢測方法的靈敏度

擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)RPA 檢測方法的用量，檢測結(jié)果詳見圖1。其中，創(chuàng)傷弧菌模板量依次為 100 ng、10 ng、1 ng、0.1 ng、0.01 ng。圖1左為擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的用量為 10 ng時不干擾擴(kuò)增，靈敏度與不添加內(nèi)標(biāo)時相同；圖1右為20 ng 有抑制低模板量的目標(biāo)基因擴(kuò)增，說明內(nèi)標(biāo)用量選擇10 ng 合適。RPA 檢測方法設(shè)定為恒溫37℃、反應(yīng)時間40 min、模板核酸含量為0.1～100 ng時，其234 bp 的目標(biāo)條帶可以檢測的到；當(dāng)核酸含量為0.01 ng 時，其234 bp 的目標(biāo)條帶未顯示，說明RPA 檢測的下限為0.1 ng。

圖1 gryB 基因RPA-IAC 檢測內(nèi)標(biāo)用量時靈敏度測試結(jié)果

3.2 RPA-IAC檢測方法的特異性評價

研究結(jié)果顯示，參試菌株均能檢測到334 bp 的內(nèi)標(biāo)基因擴(kuò)增片段，創(chuàng)傷弧菌還能夠擴(kuò)增到234 bp的特異性條帶，其他10 株標(biāo)準(zhǔn)菌株均未檢測到目標(biāo)基因gryB 234 bp 的產(chǎn)物，說明該方法具有較強(qiáng)的特異性（圖2）。

圖2 gryB 基因的RPA-IAC 特異性檢測結(jié)果

3.3 RPA-IAC檢測方法應(yīng)用效果評價

在制備魚糜中添加濃度為106～100cfu/g 的創(chuàng)傷弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，先行增菌培養(yǎng)8 h 再采用建立的RPAIAC 方法進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，濃度為 106～101cfu/g 時均可被檢出，濃度為100cfu/g 的魚糜樣品未檢出。結(jié)果表明，RPA-IAC 檢測方法具有良好的檢測低限，能夠?qū)崿F(xiàn)在創(chuàng)傷弧菌含量較低的水產(chǎn)品中進(jìn)行快速檢測。

4 討論

本研究表明，在與β-actin 基因片段為擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)對照，以創(chuàng)傷弧菌基因gryB 為檢測基因，純培養(yǎng)條件，擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)存在的情況下，創(chuàng)傷弧菌的gryB 基因檢測靈敏度為0.1 ng。結(jié)果表明，RPA-IAC 檢測方法與常規(guī)PCR 檢測方法具有相當(dāng)?shù)蔫b定效果。

采用擴(kuò)增內(nèi)標(biāo) PRA 技術(shù)來檢測水產(chǎn)品中的創(chuàng)傷弧菌，選用 gryB 基因的原因主要考慮:（1）gyrB 基因在細(xì)菌內(nèi)普遍存在；（2）編碼DNA 促旋酶B 亞基單位蛋白,且不顯現(xiàn)頻繁的基因橫向轉(zhuǎn)移，具有很強(qiáng)的特異性。

對樣品進(jìn)行增菌培養(yǎng)，在食品增菌液中，尤其是肉類食品中混有蛋白質(zhì)、脂肪、表面活性劑等可影響和抑制RPA 擴(kuò)增及Taq 酶活性。這些雜質(zhì)很難除去，會導(dǎo)致假陰性的檢測結(jié)果，引入β-actin 基因片段作為RPA 檢測的內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增對照，在反應(yīng)體系中，只有內(nèi)標(biāo)出現(xiàn)，而沒有目的條帶，則為檢測陰性，如果內(nèi)標(biāo)和目的基因條帶均沒有出現(xiàn)，提示整個RPA反應(yīng)受到雜質(zhì)的抑制，檢測為假陰性，需要重新檢測一次?？梢妰?nèi)標(biāo)的引入可以有效防止假陰性結(jié)果導(dǎo)致的檢測污染，從而提高RPA 檢測的準(zhǔn)確度。

擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的選擇對實(shí)驗(yàn)的特異性有著至關(guān)重要的作用，是判斷實(shí)驗(yàn)假陰性的重要指標(biāo)，本文的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)選擇緣由如下:（1）初始片段大小限定為272 bp，這樣原始序列連接所需的上下游引物序列可構(gòu)建300 bp 左右的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)，適于配套 100～500 bp 大小目標(biāo)基因，適配范圍廣、參照性好）。（2）β-actin 基因?yàn)槌Ｓ脙?nèi)參基因，由375 個氨基酸組成，分子量大小為 42～43 kDa。β-actin 基因在多個物種之間均有穩(wěn)定、豐富表達(dá)，但在不同物種之間高度保守。（3）從遺傳距離規(guī)避以及操作污染防范方面考慮，選擇家豬物種的β-actin 基因?yàn)榛A(chǔ)序列構(gòu)建擴(kuò)增內(nèi)參也是比較科學(xué)的，因?yàn)檫@樣與目標(biāo)相似菌群和人類基因組的DNA 均不存在同源性[12,13]。

5 結(jié)語

以β-actin 基因?yàn)閮?nèi)標(biāo)基因，gryB 為目標(biāo)基因，建立的創(chuàng)傷弧菌RPA-IAC 檢測方法具有簡便、快捷、靈敏、高效等顯著優(yōu)勢，適應(yīng)于基層和現(xiàn)場檢測，具有較好的應(yīng)用前景。