鄒 悅 李金容 唐興江

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川省瀘州市 646000，電子郵箱：573760533@qq.com)

腦卒中是全球第2大死亡原因[1]，具有高發(fā)病率和高致殘率的特點(diǎn)。缺血性卒中是腦卒中常見(jiàn)的類型，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的腦血管疾病之一。目前，組織纖溶酶原激活劑是治療缺血性卒中最有效的方法之一，但其治療時(shí)間窗狹窄，禁忌證和并發(fā)癥較多，因此臨床上只有一小部分患者從中獲益。研究表明缺血性腦卒中發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，主要的機(jī)制有鈣離子超載、炎癥因子釋放、氧化應(yīng)激、線粒體自噬、細(xì)胞凋亡等。最近有學(xué)者提出，先天免疫誘導(dǎo)缺血后炎癥反應(yīng)，在腦缺血再灌注損傷中扮演重要角色，而NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域3(NOD-like receptor pyrin domain containing 3，NLRP3)是其中一個(gè)重要的潛在靶點(diǎn)。

6-芐氨基嘌呤(6-benzylaminopurine，6-BA)是一種植物激素，也叫細(xì)胞分裂素，其在植物中的主要功能包括調(diào)控細(xì)胞周期、分化、分裂和衰老。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，6-BA對(duì)小鼠卵巢、小腸、腦、肝臟等具有抗氧化應(yīng)激、抗脂質(zhì)過(guò)氧化的作用[2-5]。本研究探討預(yù)處理6-BA對(duì)糖尿病大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后腦組織NLRP3和白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β表達(dá)的影響，為進(jìn)一步探究6-BA腦保護(hù)作用機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年雄性SD大鼠100只，周齡6～7周，體重220～250 g，由西南醫(yī)科大學(xué)城北動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，使用許可證：SYXK(川)2018-065，生產(chǎn)許可證：SCXK(川)2018-17。飼養(yǎng)于清潔動(dòng)物房，用普通飼料喂養(yǎng)，飲用自來(lái)水，自然光照，室溫22℃～25℃。

1.2 試劑和儀器 6-BA購(gòu)自合肥博美生物科技有限責(zé)任公司(批號(hào)：2016122011；100 mg/瓶)，用0.06 mol/L鹽酸配制成1 000 mg/L、2 000 mg/L的6-BA儲(chǔ)備液備用。兔抗大鼠NLRP3多克隆抗體(英國(guó)Abcam公司，批號(hào)：ab214185)，兔抗大鼠IL-1β多克隆抗體(英國(guó)Abcam公司，批號(hào)：ab16502)，鏈脲佐菌素(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：20170508c5)，脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)試劑盒(美國(guó)Roche公司，批號(hào)：11684817910)，二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色劑(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：ZLL-9033)。微量血糖儀(長(zhǎng)沙三諾生物傳感股份有限公司，型號(hào)：2015709723)，光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司，型號(hào)：CX-21)，熒光顯微鏡(日本Olympus公司，型號(hào)：IX51)。

1.3 動(dòng)物模型制備及預(yù)處理

1.3.1 糖尿病大鼠模型的建立：參考林心君等[6]的方法制作糖尿病大鼠模型。采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)大鼠4周，4周后用腹腔注射低劑量的鏈脲佐菌素2次，25 mg(kg·m2)，間隔2 d，第5周采用微量血糖儀測(cè)大鼠隨機(jī)血糖，隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L為糖尿病大鼠模型造模成功。

1.3.2 動(dòng)物分組：采用隨機(jī)數(shù)字表法將糖尿病大鼠分為4組，包括假手術(shù)組、對(duì)照組、低劑量6-BA組、高劑量6-BA組，每組25只。

1.3.3 藥物干預(yù)：成功建立糖尿病大鼠模型后，在建立大腦中動(dòng)脈阻斷模型前7 d，低劑量6-BA組、高劑量6-BA組大鼠分別給予20 mg/kg、40 mg/kg的6-BA灌胃，假手術(shù)組和對(duì)照組大鼠用等量的0.06 mol/L鹽酸灌胃,1次/d,連續(xù)給藥7 d。

1.3.4 缺血再灌注損傷模型的建立：采用改良Longa法[7]建立大腦中動(dòng)脈阻斷缺血再灌注損傷模型。用10%水合氯醛(0.3 mg/kg)腹腔麻醉大鼠后，將大鼠仰臥固定，取頸部正中切口，分離并暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈及頸內(nèi)、外動(dòng)脈，結(jié)扎頸總動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈根部。在低劑量6-BA組、高劑量6-BA組、對(duì)照組大鼠的頸總動(dòng)脈近分叉部5 mm處，剪一“V”形小口，插入魚(yú)線(長(zhǎng)50 mm，直徑0.26 mm，于18 mm處做標(biāo)記)，感到有輕微阻力時(shí)即停止插入，插入深度為(18.0±0.5)mm，結(jié)扎并固定插線，縫合皮膚，阻斷血流2 h后，拔出魚(yú)線進(jìn)行再灌注。假手術(shù)組只需要暴露出頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈，不結(jié)扎、不插入魚(yú)線，其余步驟與其他3組一致。實(shí)驗(yàn)過(guò)程如有大鼠死亡，按相同條件給予補(bǔ)充。

1.4 觀察指標(biāo) 分別于再灌注后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h，每組各取5只大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，然后處死大鼠取腦組織檢測(cè)NLRP3、IL-1β的表達(dá)情況，計(jì)數(shù)大鼠腦組織海馬CA1區(qū)梗死灶細(xì)胞凋亡數(shù)。

1.4.1 神經(jīng)功能缺損評(píng)分：采用Garcia評(píng)分[8]對(duì)大鼠自主運(yùn)動(dòng)、體態(tài)對(duì)稱性、前肢伸展功能、網(wǎng)屏實(shí)驗(yàn)、身體雙側(cè)觸覺(jué)、雙側(cè)胡須反射情況進(jìn)行評(píng)分，總分3～18分，得分越高說(shuō)明神經(jīng)功能損傷越輕。

1.4.2 腦組織NLRP3、IL-1β的表達(dá)：采用免疫組化法測(cè)定大鼠腦組織NLRP3、IL-1β的表達(dá)情況，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。在高倍鏡下計(jì)數(shù)每張切片梗死灶NLRP3、IL-1β陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，陽(yáng)性細(xì)胞為胞核呈棕黃色的細(xì)胞，共觀察5個(gè)視野，取均值。

1.4.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè)：采用TUNEL染色法檢測(cè)海馬CA1區(qū)梗死灶細(xì)胞凋亡情況，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。熒光顯微鏡下凋亡細(xì)胞的胞核為綠色熒光，高倍鏡下計(jì)數(shù)每張切片海馬CA1區(qū)梗死灶5個(gè)視野的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 4組大鼠Garcia評(píng)分比較 在各時(shí)間點(diǎn)，假手術(shù)組、高劑量6-BA組、低劑量6-BA組、對(duì)照組的Garcia評(píng)分均依次降低(均P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)4組大鼠Garcia評(píng)分比較(x±s，分)

注：各時(shí)間點(diǎn)，與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與對(duì)照組比較，#P<0.05；與低劑量6-BA組比較，△P<0.05。

2.2 4組大鼠腦組織NLRP3及IL-1β的表達(dá)水平比較 在各時(shí)間點(diǎn)，假手術(shù)組、高劑量6-BA組、低劑量6-BA組、對(duì)照組的NLRP3及IL-1β陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均依次升高(均P<0.05)，見(jiàn)表2～3。

表2 4組大鼠腦組織NLRP3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較(x±s，個(gè)/視野)

注：各時(shí)間點(diǎn)，與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與對(duì)照組比較，#P<0.05；與低劑量6-BA組比較，△P<0.05。

表3 4組大鼠腦組織IL-1β陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較(x±s，個(gè)/視野)

注：各時(shí)間點(diǎn)，與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與對(duì)照組比較，#P<0.05；與低劑量6-BA組比較，△P<0.05。

2.3 4組大鼠海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)比較 在各時(shí)間點(diǎn)，假手術(shù)組、高劑量6-BA組、低劑量6-BA組、對(duì)照組的海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)均依次增加(均P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 大鼠海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)(x±s，個(gè)/視野)

注：各時(shí)間點(diǎn)，與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與對(duì)照組比較，#P<0.05,與低劑量6-BA組比較；△P<0.05。

3 討 論

近年來(lái)，隨著人們生活方式的改變，以及生活質(zhì)量的提高，糖尿病患病率也逐漸增加，而糖尿病是缺血性腦卒中發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，糖尿病患者并發(fā)腦梗死的危險(xiǎn)性是未患糖尿病者的2～5倍[9]。有研究證實(shí)，糖尿病對(duì)腦血管疾病的損傷機(jī)制包括以下幾個(gè)方面：(1)高血糖加重血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷[10]，促進(jìn)血管基質(zhì)蛋白的非酶氧化反應(yīng)，使得脂質(zhì)代謝受到一定程度的影響，加速動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展[11-13]；(2)高糖可激發(fā)體內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)，刺激活性氧的產(chǎn)生[14]，明顯增加腦血管疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)。6-BA具有穩(wěn)定、安全、廉價(jià)和易于使用的優(yōu)點(diǎn)，不僅具有抗氧化應(yīng)激、抗脂質(zhì)過(guò)氧化的作用，可能還有抗炎、抗凋亡等作用。張自強(qiáng)等[4]發(fā)現(xiàn)，6-BA對(duì)小鼠腦組織氧化損傷具有一定的保護(hù)作用。而在高糖合并腦組織損傷的狀態(tài)下，6-BA是否可以發(fā)揮腦組織保護(hù)作用，鮮見(jiàn)有相關(guān)研究。因此，本研究觀察6-BA預(yù)處理對(duì)糖尿病大鼠腦缺血再灌注損傷后缺血區(qū)NLRP3、IL-1β表達(dá)的影響，為進(jìn)一步探討其在腦缺血再灌注損傷中的腦保護(hù)作用具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

炎癥反應(yīng)是腦缺血再灌注損傷的機(jī)制之一，在腦缺血再灌注早期，機(jī)體會(huì)釋放出大量的炎癥因子，如IL-1、IL-6、腫瘤壞死因子α、C反應(yīng)蛋白等，可進(jìn)一步加重腦組織的損傷。抑制炎癥因子釋放和上調(diào)抗炎因子的表達(dá)，是治療腦缺血再灌注損傷的方法之一。IL-1β是參與炎癥反應(yīng)的主要促炎因子，主要來(lái)源于活化的小膠質(zhì)細(xì)胞，在協(xié)調(diào)有效的先天性和適應(yīng)性免疫中扮演重要角色，可激活吞噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等進(jìn)一步促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，從而加重局部炎癥反應(yīng)[15-16]。

NLRP3屬于胞質(zhì)內(nèi)模式識(shí)別受體，激活后可形成NLRP3炎性體，在腦組織損傷過(guò)程中，NLRP3炎性體可促進(jìn)IL-1β的產(chǎn)生，加重炎癥反應(yīng)，不利于損傷腦組織的修復(fù)[17-18]。有研究表明，多種外源性及內(nèi)源性因素，如感染、組織損傷、代謝失調(diào)、胞外三磷酸腺苷、乙酰透明質(zhì)酸、Aβ原纖維、尿酸晶體等，均可激活NLRP3形成NLRP3炎性體[19]。還有研究顯示，活性氧、細(xì)胞內(nèi)鉀離子外流和溶酶體破裂釋放組織蛋白B可能是NLRP3被激活形成NLRP3炎性體的主要模式[20]。而腦缺血再灌注后，大量活性氧的產(chǎn)生可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，促進(jìn)鈣離子釋放，鉀離子外流增多，三磷酸腺苷生成減少，NLRP3被激活形成NLRP3炎性體，炎癥反應(yīng)級(jí)聯(lián)放大。抑制NLRP3的表達(dá)，減少NLRP3炎性體的形成，從而減輕炎癥反應(yīng)，是減輕腦缺血再灌注后腦組織損傷的途徑之一。

本研究結(jié)果顯示，在各時(shí)間點(diǎn)，假手術(shù)組、高劑量6-BA組、低劑量6-BA組、對(duì)照組的Garcia評(píng)分依次降低，而NLRP3及IL-1β陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)依次升高(均P<0.05)，提示6-BA可能通過(guò)抑制NLRP3的表達(dá)從而下調(diào)IL-1β的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，起到保護(hù)腦神經(jīng)元細(xì)胞的作用。其機(jī)制可能是6-BA可以清除氧自由基，從而抑制NLRP3被激活形成NLRP3炎性體，減少炎性細(xì)胞因子、黏附分子的產(chǎn)生，減輕腦組織水腫及神經(jīng)功能損傷。有學(xué)者指出，NLRP3可以增加胱天蛋白酶1的作用從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，而胱天蛋白酶-1也可以促使參與糖酵解過(guò)程中的一些酶失去活性，導(dǎo)致細(xì)胞失去生物活性后死亡[21]。本研究結(jié)果還顯示，在各時(shí)間點(diǎn)，假手術(shù)組、高劑量6-BA組、低劑量6-BA組、對(duì)照組的海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)依次增加(均P<0.05)，提示6-BA可能通過(guò)抑制NLRP3表達(dá)，下調(diào)胱天蛋白酶-1、IL-1β的表達(dá)，從而減輕腦梗死后水腫周圍組織神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，起到腦保護(hù)作用。

綜上所述，6-BA預(yù)處理可減輕腦缺血再灌注后糖尿病大鼠的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)，6-BA可能通過(guò)下調(diào)NLRP3的表達(dá)從而減少IL-1β生成及神經(jīng)細(xì)胞凋亡，減輕炎癥反應(yīng)，起到腦保護(hù)作用。