盧 青 成秋宸 肖緒華 范麗雯

(1 桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)院感染管理科，廣西桂林市 541000，電子郵箱：18577956626@163.com；2 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科，南寧市 530021)

異性隱窩灶(aberrant crypt foci,ACF)和腺瘤是結(jié)直腸癌兩個重要的早癌階段[1]。ACF是目前結(jié)直腸癌發(fā)生過程中能在光鏡下觀察到的最小且最早期的結(jié)直腸黏膜病變，被認為是腫瘤癌變前期病變。結(jié)直腸癌的發(fā)病機制至今尚未闡明，亦缺乏針對性的藥物治療。多項研究結(jié)果提示ACF可用來評價化合物和食品的抗癌和致癌作用以及相應(yīng)機制[2-3]。本課題組前期采用荔枝核總黃酮(total flavone ofsemenlitchi,TFL)體外干預(yù)人結(jié)直腸癌細胞株HT29，發(fā)現(xiàn)TFL具有抑制HT29細胞系增殖的作用，對相關(guān)分子通路的蛋白也有抑制作用[4]。本研究建立經(jīng)典ACF癌前病變大鼠模型，再給予TFL灌胃，探討TFL對大鼠結(jié)直腸癌前病變的抑制作用，以及對ACF中程序性死亡受體1(programmed cell death protein 1,PD-1)、核因子-кB(nuclear factor-kappaB,NF-κB)p65基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 40只成年雄性Wistar大鼠，體重150～180 g，無特定病原體級，由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK桂2009-0002。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，喂養(yǎng)環(huán)境溫度(25±1)℃，濕度60%～80%，自由進食飲水，光照12 h/d。

1.2 藥品與試劑 二甲肼購自Sigma公司(批號：#BCBQ2802V)，使用前用生理鹽水配成2%的濃度，用NaHCO3調(diào)整pH值至6.5左右。TFL購自南京草本源生物科技有限公司(批號：ZC16081016)，純度83.5%。谷胱甘肽測試盒購于南京建成生物工程研究所(批號：A061)。總RNA提取試劑盒購自中國康為公司(批號：CW0581)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper) 購自南京諾唯贊公司(批號：R223-01)；AceQ qPCR SYBR Green Master Mix試劑購自南京諾唯贊公司(批號：Q311-02)。引物由上海生工生物工程公司合成。

1.3 儀器 SZX10型解剖鏡購自日本奧林巴斯公司，qTOWERE 2.2熒光定量PCR儀購自德國AnalytikJena公司，F(xiàn)200 PRO酶標(biāo)儀購自瑞士Tecan Infinite公司，D3024R型冷凍離心機購自美國SCILOGEX公司，Tone 96G梯度PCR儀購自德國Analytik Jena公司，K5500型微量分光光度計購自北京凱奧科技發(fā)展有限公司。

1.4 建模及干預(yù)方法 將40只大鼠按照隨機數(shù)字表法分為對照組、模型組、TFL小劑量組、TFL大劑量組，每組10只。制備大鼠ACF模型[5]：除對照組外，按照20 mg/kg的劑量給予其他組大鼠皮下注射二甲肼，對照組只注射等劑量生理鹽水，均1次/周，連續(xù)注射15周。在首次給予二甲肼處理后第2天起，對照組、模型組給予5 mL/(kg·d)的生理鹽水灌胃，TFL小劑量組、TFL大劑量組分別按100 mg/(kg·d)、200 mg/(kg·d)給予TFL灌胃，1次/d，直至實驗第15周最后1 d，應(yīng)用放血法處死大鼠。

1.5 ACF計數(shù) 取大鼠全部結(jié)直腸，并將腸組織沿腸系膜縱向切開，0℃磷酸緩沖鹽溶液洗凈，黏膜面朝上置于10%中性甲醛液中固定48 h。然后表面均勻噴灑0.2%的亞甲藍溶液，將染色10 s后的腸組織于10倍放大的解剖鏡下觀察并計算ACF的數(shù)目。ACF判斷標(biāo)準：鏡下見腺管開口明顯擴大、上皮細胞層增厚，腺管之間間距增大，不規(guī)則的管腔，鏡下可見輕微的隆起。

1.6 血清酶學(xué)檢測 收集大鼠全血5 mL置于促凝管，4℃ 3 500 r/min離心10 min分離出血清，按照試劑盒說明書進行血清谷胱甘肽的檢測。

1.7 mRNA水平檢測 取大鼠ACF組織約5 mg，對照組取非ACF的腸道組織5 mg，應(yīng)用RNA保存液凍存，加TRIzol在冰上勻漿裂解，按照總RNA提取試劑盒(柱式法)提取總RNA，使用無酶水將RNA從提取柱上洗脫，RNA微量定量儀測定濃度及純度，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將500 ng RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。去除基因組DNA，將模板和上下游引物均稀釋10倍后進行熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 μL(SYBR Green Master Mix 10 μL，10 μM引物1 10.5 μL,10 μM引物2 20.5 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 7 μL)，PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 30 s，變性95℃ 10 s，退火55℃ 15 s，共反應(yīng)39循環(huán)，延伸72℃ 20 s。每個樣本重復(fù)3次，同步設(shè)立空白對照。以β-肌動蛋白為內(nèi)參，引物序列見表1。利用2-△△CT計算目的基因相對表達量，△CT=CT目的基因-CT內(nèi)參基因。

表1 引物序列

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用TamhaneT2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 4組大鼠ACF計數(shù)比較 模型組大鼠結(jié)直腸出現(xiàn)直徑約5 mm的ACF，對照組大鼠結(jié)直腸未發(fā)現(xiàn)有ACF病變。模型組、TFL小劑量組、TFL大劑量組大鼠ACF的數(shù)量依次下降(均P<0.05)，見表2。

表2 4組大鼠ACF計數(shù)及血清谷胱甘肽含量比較(x±s)

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與TFL小劑量組比較，△P<0.05。

2.2 4組大鼠血清谷胱甘肽含量比較 模型組、TFL小劑量組、TFL大劑量組、對照組大鼠血清谷胱甘肽含量依次升高(均P<0.05)，見表2。

2.3 4組PD-1、NF-κBp65 mRNA的表達水平比較 模型組ACF中PD-1 mRNA的表達水平高于對照組及TFL大劑量組(P<0.05)，其余組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。與對照組比較，模型組NF-κBp65 mRNA的表達水平升高，而TFL大劑量組的表達水平下降(均P<0.05)；模型組、TFL小劑量組、TFL大劑量組NF-κBp65 mRNA的表達水平依次降低(均P<0.05)。見表3。

表3 4組大鼠ACF組織中PD-1、NF-κB p65 mRNA的相對表達水平比較(x±s)

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與TFL小劑量組比較，△P<0.05。

3 討 論

我國是結(jié)直腸癌的高發(fā)國家，每年新發(fā)病例超過25萬，死亡病例約14萬，均占全世界同期相應(yīng)病例的20%左右[6]。研究表明，早期癌癥患者治療后5年生存率可提高到90%以上，而晚期結(jié)直腸癌患者術(shù)后5年生存率只有12%[7]。如何早期發(fā)現(xiàn)并處理病變，預(yù)防結(jié)直腸癌的發(fā)展是迫切需要解決的重大問題。近年來，天然植物中的抗腫瘤有效成分及其相關(guān)機制成為研究熱點之一。

抗氧化劑抗腫瘤的機理主要通過抑制腫瘤相關(guān)基因和蛋白質(zhì)表達，抑制脂質(zhì)過氧化，減少腫瘤細胞增殖，促進細胞凋亡，以阻止腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、惡化。黃酮類化合物是一類具有2-苯基色原酮結(jié)構(gòu)的化合物，是自然界廣泛存在的一種較強的抗氧化劑[8]。黃酮類化合物除了具有清除自由基和抗氧化作用外，還可抗病毒、抗腫瘤及雙向調(diào)節(jié)細胞凋亡[9]。TFL是從傳統(tǒng)中藥荔枝核中提取的黃酮類化合物的總稱，是荔枝核中抗氧化的最主要成分。目前，尚缺乏有關(guān)TFL在腫瘤發(fā)生中作用的研究。本研究中，模型組大鼠結(jié)直腸出現(xiàn)直徑約5 mm的ACF，提示使用二甲肼成功建造大鼠直腸癌癌前病變模型。給予一定劑量的TFL進行干預(yù)后，模型組、TFL小劑量組、TFL大劑量組大鼠ACF的數(shù)量依次下降(均P<0.05)，提示TFL可抑制大鼠結(jié)直腸出現(xiàn)ACF，且大劑量的TFL作用更佳。前期實驗結(jié)果表明TFL有抑制體外HT29細胞增殖的作用[4]，因此，我們推測TFL對結(jié)直腸癌前病變的產(chǎn)生有一定的抑制作用。

谷胱甘肽可保持細胞膜結(jié)構(gòu)的完整性及組織細胞免受損傷，反映了機體清除氧自由基的能力。有研究表明，黃芪總苷通過降低肝微粒體代謝酶CYP450的含量，提高谷胱甘肽活力，從而抑制大鼠結(jié)直腸ACF的形成[10]。亦有研究表明，七葉亭和七葉苷可抑制二甲肼引起的結(jié)腸DNA氧化損害過程，從而抑制ACF的產(chǎn)生[11]。本研究中，模型組、TFL小劑量組、TFL大劑量組大鼠血清谷胱甘肽含量依次升高(均P<0.05)，提示TFL在該模型中發(fā)揮了較好的抗氧化作用，且大劑量的TFL作用更佳?？梢?，作為一種強抗氧化劑，TFL具有減少ACF的作用,從而防止其進一步發(fā)展導(dǎo)致結(jié)腸癌發(fā)生。

NF-κB通路在結(jié)腸從炎癥到癌變的過程中發(fā)揮極其重要的作用。炎癥時脂多糖與Toll樣受體4特異性結(jié)合后，下游NF-κB信號通路被激活：當(dāng)NF-κB從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)，即被激活，隨后進一步激活其他基因，引起細胞增殖，抑制細胞凋亡[12]。與NF-κBp50組成二聚體的NF-κB p65是NF-κB信號通路中的關(guān)鍵節(jié)點，NF-κBp65主要參與基因轉(zhuǎn)錄的起始調(diào)節(jié)。研究證實，當(dāng)細胞受到腫瘤壞死因子、白細胞介素等外界因素刺激時，NF-κBp65從二聚體上解離而活化，持續(xù)活化的NF-κBp65可改變細胞正常的信號傳導(dǎo)，促進細胞癌變[13]。而在腫瘤細胞中，NF-κBp65可促進腫瘤細胞的增殖，抑制腫瘤細胞的凋亡，促進血管新生，參與細胞外基質(zhì)降解，提高腫瘤細胞的浸潤轉(zhuǎn)移能力[14]。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)，TFL對HT29細胞系有抑制其增殖的作用，且發(fā)現(xiàn)TFL干預(yù)后NF-κB mRNA和蛋白的表達均顯著降低[4]，提示TFL通過干預(yù)NF-κB的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程來抑制HT29細胞增殖；且當(dāng)NF-κB被抑制后其下游的白細胞介素1β表達亦減少，提示NF-κB可能為TFL抑制HT29細胞系增殖的關(guān)鍵因子。在本研究中，模型組、TFL小劑量組、TFL大劑量組NF-κBp65 mRNA的表達水平依次降低(均P<0.05)，提示TFL可降低二甲肼誘導(dǎo)的大鼠ACF中NF-κBp65 mRNA的表達，據(jù)此推斷，TFL通過抑制NF-κBp65基因的表達來抑制大鼠早期結(jié)直腸腫瘤發(fā)生。

PD-1是在結(jié)直腸癌發(fā)病機理中參與免疫逃逸的關(guān)鍵基因。然而僅TFL大劑量組ACF中PD-1 mRNA的表達水平低于模型組(P<0.05)，而TFL小劑量組與模型組差異并無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，TFL沒有顯示出較好的作用，可能是出于腫瘤早期尚未激活PD-1信號通路來促進腫瘤的生長。

綜上所述，TFL對二甲肼誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸癌前病變具有良好的抑制作用，大劑量TFL的作用更佳；NF-κBp65可能為TFL抑制大鼠結(jié)直腸ACF發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因子，或可成為抑制腫瘤發(fā)生的潛在靶點。TFL可作為預(yù)防結(jié)直腸早癌的潛在藥物，其機制需更進一步探索和研究。