鐘偉娟 梁 瑩 宋德志 田雯鈺 賴振屏 樊曉暉

(廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物教研室，南寧市 530021，電子郵箱：3230390976@qq.com)

作為腫瘤生物治療的候選病毒株，新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)具有幾乎無毒的安全優(yōu)勢和顯著的抑瘤效果。NDV不僅可直接誘發(fā)腫瘤細胞的凋亡和自噬，還可以通過激活機體抗瘤免疫應(yīng)答來清除腫瘤細胞[1-2]。研究表明，自然殺傷(natural killer，NK)細胞的腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)表達上調(diào)，是NK細胞殺傷腫瘤細胞的重要機制。NDV可通過上調(diào)TRAIL的表達來增強NK細胞的抗瘤效應(yīng)[3-5]。然而，在NK細胞中介導(dǎo)這一過程的信號通路目前尚未清楚。我們前期研究證實在不依賴干擾素(interferon,IFN)-γ情況下，NDV經(jīng)血凝素-神經(jīng)氨酸酶(hemagglutinin-neuraminidase，HN)途徑誘導(dǎo)TRAIL表達來增強NK細胞的抗瘤效應(yīng)；此外，信號抑制劑阻斷實驗結(jié)果顯示，脾臟酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase,Syk)和核因子-κB(nuclear factor-kappaB，NF-κB)是TRAIL活化的重要通路分子[6]?？紤]到信號抑制劑作用靶點的非唯一性，本研究用小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)特異性敲低IFN-γ受體缺失的NK細胞(IFN R-/-NK)的信號分子Syk、NF-κB，進一步闡明Syk、NF-κB在TRAIL活化中的作用，為NDV抗瘤的免疫活化機制研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 NDV-HN為本實驗室保存的大腸桿菌表達純化產(chǎn)物。無血清RPMI-1640培養(yǎng)基、兔抗小鼠磷酸化IκBα單抗(批號：I1212)、兔抗鼠Syk單抗(批號：12311)、兔抗鼠TRAIL單抗(批號：E01040-1630)均購自SantaCruz公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG單抗(批號：ZS230)、兔抗β-肌動蛋白(β-actin)抗體(批號：130906)均購自ZSGB-BIO公司，兔抗小鼠p65單克隆抗體(批號：B2312)購自Pierce公司，Lipofectamine 3000(批號：L3000008)、胎牛血清(批號：1828728)均購自賽默飛公司，胰酶(批號：20180625)購自索萊寶公司，MiniBEST Universal RNA盒(批號：9767/9767S)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號：RR036A)、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(批號：RR820A)購自TaKaRa公司，小鼠分泌型TRAIL蛋白酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(批號：10M22A)、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度測定增強型試劑盒(批號：AR0146)、硝酸纖維素膜(批號：AR0135502)、電化學(xué)發(fā)光顯影試劑盒(批號：12L22C)均購自Boster公司，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate-buffered saline,PBS)購買自吉諾生物公司(批號：GNM20012)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：IFN R-/-NK細胞株購自賽齊生物制品有限公司，用含有鏈霉素(100 U/mL)、青霉素(100 U/mL)、谷氨酰胺(2 mM)、10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，并置于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。

1.2.2 細胞分組與瞬時轉(zhuǎn)染：(1)分組。用RPMI-1640培養(yǎng)基重懸IFN R-/-NK細胞，以2×105個細胞/孔接種于6孔細胞板，將細胞分為siRNA-Syk1組、siRNA-Syk2組、siRNA-Syk3組、siRNA-p65-1組、siRNA-p65-2組、siRNA-p65-3組、未處理組、脂質(zhì)體組、siRNA-NC組。(2)瞬時轉(zhuǎn)染。先把siRNA粉末配成20 pmol/μL，將5 μL siRNA(Syk1-siRNA、Syk2-siRNA、Syk3-siRNA，p65-1-siRNA、p65-2-siRNA、p65-3siRNA，廠家均為上海吉瑪基因，批號：66618、66422、66423、66619、66620、66621)、3.75 μL Lipofectamine 3000和250 μL Opti-MEM培養(yǎng)基(Gibco公司，批號：2003808)混勻配置成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，siRNA-Syk1組、siRNA-Syk2組、siRNA-Syk3組、siRNA-p65-1組、siRNA-p65-2組、siRNA-p65-3組細胞分別加入相應(yīng)的轉(zhuǎn)染復(fù)合物，未處理組細胞加入相同體積的PBS，脂質(zhì)體組細胞加入由Lipofectamine 3000和Opti-MEM培養(yǎng)基組成的轉(zhuǎn)染復(fù)合物，siRNA-NC組加入由非特異性siRNA(上海吉瑪基因，批號：171211)、Lipofectamine 3000和Opti-MEM培養(yǎng)基組成的轉(zhuǎn)染復(fù)合物。siRNA序列詳見表1，瞬時轉(zhuǎn)染操作按照Lipofectamine 3000瞬時轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進行。36 h后，檢測Syk或p65 mRNA、蛋白的表達水平。

1.2.3 敲低Syk或p65對NDV-HN作用后IFN R-/-NK細胞TRAIL蛋白表達的影響：瞬時轉(zhuǎn)染16 h后，于siRNA-Syk1組、siRNA-Syk2組、siRNA-Syk3組、siRNA-p65-1組、siRNA-p65-2組、siRNA-p65-3組、脂質(zhì)體和siRNA-NC組細胞中加入500 ng NDV-HN，并分別設(shè)為siRNA-Syk1+HN組、siRNA-Syk2+HN組、siRNA-Syk3+HN組、siRNA-p65-1+HN組、siRNA-p65-2+HN組、siRNA-p65-3+HN組、脂質(zhì)體+HN和siRNA-NC+HN組，未處理組加入相同體積的PBS。繼續(xù)培養(yǎng)20 h后，PBS洗滌兩次，分別收集細胞和上清液，檢測膜型和分泌型TRAIL蛋白表達水平。實驗重復(fù)3次。

表1 siRNA序列

1.2.4 敲低Syk對NDV-HN作用后IFN R-/-NK細胞IκBα磷酸化的影響：瞬時轉(zhuǎn)染16 h后，于siRNA-Syk1組、siRNA-Syk2組、siRNA-Syk3組、脂質(zhì)體組和siRNA-NC組細胞中加入500 ng/mL NDV-HN，并分別設(shè)為siRNA-Syk1+HN組、siRNA-Syk2+HN組、siRNA-Syk3+HN組、脂質(zhì)體+HN和siRNA-NC+HN組，未處理組加入相同體積的PBS，繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，PBS洗滌兩次，收集細胞，測定磷酸化IκBα蛋白表達水平。

1.2.5 實時熒光定量PCR法檢測Syk及p65 mRNA表達水平：提取細胞總RNA，按照MiniBEST Universal RNA提取試劑盒說明書進行操作。采用紫外光光度計鑒定RNA純度及質(zhì)量后，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得cDNA。按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ說明書進行實時熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系包括12 μL SYBR Premix Ex TaqTMⅡ、0.5 μL 10 μM PCR上游引物、0.5 μL 10 μM PCR下游引物、1.0 μL cDNA模板和6 μL RNase Free d H2O。反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃ 3 min、變性94℃ 30 s、退火59℃ 30 s、延伸72℃ 30 s，共40個循環(huán)，延伸72℃ 10 min后，于4℃終止反應(yīng)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內(nèi)參，目的基因及內(nèi)參基因的引物序列見表2。按照2-△△Ct方法計算Syk及p65的相對表達量，△△Ct=實驗組Ct -脂質(zhì)體組Ct。

表2 p65、Syk、GAPDH的引物序列

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測Syk、p65、TRAIL蛋白及磷酸化IκBα水平：提取細胞總蛋白，按照BCA蛋白濃度測定增強型試劑盒說明書進行蛋白定量，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，加樣量為5 μg總蛋白，利用半干法，以100 mA恒流40 min進行電轉(zhuǎn)膜，室溫洗膜3次，5 min/次，用含5%脫脂牛奶和0.5%吐溫20的PBS液室溫封閉1 h后用PBST液洗滌3次，5 min/次，加入一抗(1 ∶1 000)，4℃孵育過夜，PBST液洗滌3次，5 min/次。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1 ∶20 000)，室溫孵育1 h，PBST液洗滌3次，5 min/次，采用電化學(xué)發(fā)光顯影后進行灰度值掃描。其中以β-actin作為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以(x±s)表示，多組樣本間的比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 瞬時轉(zhuǎn)染后細胞Syk或p65 mRNA及蛋白表達情況 瞬時轉(zhuǎn)染36 h后，siRNA-Syk1、siRNA-Syk2、siRNA-Syk3組的Syk mRNA及蛋白表達水平低于脂質(zhì)體組；siRNA-p65-1、siRNA-p65-2、siRNA-p65-3 組p65 mRNA及蛋白表達水平低于脂質(zhì)體(均P<0.05)。見表3～4及圖1～2。

表3 瞬時轉(zhuǎn)染36 h后6組細胞Syk mRNA及蛋白的相對表達水平比較(x±s)

注：與脂質(zhì)體組比較，△P<0.05。

表4 瞬時轉(zhuǎn)染36 h后6組細胞p65 mRNA及蛋白的相對表達水平比較(x±s)

注：與脂質(zhì)體組相比，△P<0.05。

圖1 瞬時轉(zhuǎn)染36 h后各組細胞Syk蛋白的表達情況

注：① 未處理組；② 脂質(zhì)體組；③ siRNA-NC組；④ siRNA-Syk1組；⑤ siRNA-Syk2組；⑥ siRNA-Syk3組。

圖2 瞬時轉(zhuǎn)染36 h后各組細胞p65蛋白的表達情況

注：① 未處理組；② 脂質(zhì)體組；③ siRNA-NC組；④ siRNA-p65-1組；⑤ siRNA-p65-2組；⑥ siRNA-p65-3組。

2.2 敲低Syk或p65對NDV-HN干預(yù)IFN R-/-NK細胞TRAIL蛋白表達的影響 未處理組的膜型TRAIL蛋白及分泌型TRAIL蛋白表達水平均低于其他組，siRNA-Syk1+HN組、siRNA-Syk2+HN組、siRNA-Syk3+HN組及siRNA-p65-1+HN組、siRNA-p65-2+HN組、siRNA-p65-3+HN組的膜型TRAIL蛋白及分泌型TRAIL蛋白表達水平均低于脂質(zhì)體+HN組(均P<0.05)。見圖3及表5～6。

圖3 各組細胞膜型TRAIL的表達情況

注：① 未處理組；② 脂質(zhì)體+HN組；③ siRNA-NC+HN組；④ siRNA-Syk1+HN組；⑤ siRNA-Syk2+HN組；⑥ siRNA-Syk3+HN組；⑦ siRNA-p65-1+HN組；⑧ siRNA-p65-2+HN組；⑨ siRNA-p65-3+HN組。

注：與未處理組比較，*P<0.05；與脂質(zhì)體+HN組相比，△P<0.05。

表6 敲低p65后細胞的TRAIL蛋白相對表達水平(x±s)

注：與未處理組比較，*P<0.05；與脂質(zhì)體+HN組相比，△P<0.05。

2.3 敲低Syk對IκBα磷酸化的影響 未處理組磷酸化IκBα的蛋白表達水平均低于其他組，siRNA-Syk1+HN、siRNA-Syk2+HN、siRNA-Syk3+HN組磷酸化IκBα蛋白表達水平均低于脂質(zhì)體+HN組(均P<0.05)。見圖4及表7。

圖4 各細胞的磷酸化IκBα蛋白表達情況

注：① 未處理組；② 脂質(zhì)體+HN組；③ siRNA-NC+HN組；④ siRNA-Syk1+HN組；⑤ siRNA-Syk2+HN組；⑥ siRNA-Syk3+HN組。

表7 敲低Syk后6組細胞磷酸化IκBα蛋白相對表達水平(x±s)

注：與未處理組比較，*P<0.05，與脂質(zhì)體+HN組相比，△P<0.05。

3 討 論

TRAIL是腫瘤壞死因子超家族的Ⅱ型跨膜蛋白，分為膜型和分泌型。與膜型TRAIL相比，分泌型TRAIL僅為完整TRAIL蛋白C末端親水片段的241個氨基酸，是膜型TRAIL經(jīng)水解作用后的解離片段。研究表明，TRAIL的活性部位是C末端親水片段區(qū)內(nèi)，分泌型TRAIL的N端缺失并不影響其活性[6]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，TRAIL基因的啟動子存在可與NF-κB二聚體結(jié)合的κB序列，提示NF-κB可能參與TRAIL表達的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[6]。

在抗腫瘤免疫應(yīng)答的初始階段，腫瘤細胞的清除需依賴于NK細胞的胞毒效應(yīng)?？贵w依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒效應(yīng)(antibody dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)、Fas配體、顆粒酶/穿孔素及TRAIL是NK細胞行使胞毒效應(yīng)的主要機制。Syk屬于非受體型的Syk家族成員之一，是先天免疫應(yīng)答信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要分子。Syk不僅參與巨噬細胞和樹突狀細胞免疫應(yīng)答啟動的活化[7]，還參與NK細胞的ADCC、顆粒酶/穿孔素介導(dǎo)，以及TRAIL胞毒效應(yīng)的觸發(fā)[8-9]。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)，NDV體外刺激NK細胞后，細胞中的Syk發(fā)生磷酸化從而可上調(diào)TRAIL的表達，增強胞毒效應(yīng)，而Syk信號抑制劑可以削弱這個作用[7]。因此我們認為Syk信號通路可被溶瘤病毒NDV體外活化，是NDV的抗腫瘤免疫活化的機制之一。本研究結(jié)果顯示，siRNA-Syk1+HN組、siRNA-Syk2+HN組及siRNA-Syk3+HN組的膜型及分泌型TRAIL表達水平低于脂質(zhì)體+HN組，即敲低Syk基因后，NDV-HN誘導(dǎo)NK細胞TRAIL上調(diào)的效應(yīng)被削弱，且膜型和分泌型TRAIL蛋白變化趨勢一致，提示在NK細胞中，Syk的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對NDV-HN所致的TRAIL介導(dǎo)的胞毒效應(yīng)具有重要作用。

我們在前期研究中還發(fā)現(xiàn)，NDV體外刺激NK細胞后，NK細胞中TRAIL介導(dǎo)的細胞毒效應(yīng)顯著增強，而NF-κB信號抑制劑可以削弱這個作用[10]，表明具有活性的NF-κB二聚體在NDV上調(diào)NK細胞TRAIL表達過程中起信號調(diào)控作用。也有研究表明，在NK細胞的胞毒效應(yīng)啟動過程中，進入細胞核識別靶基因需要轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，而具有活性的NF-κB二聚體在這個過程中起著重要作用[11-13]。p65是NF-κB二聚體的亞單位，本研究結(jié)果顯示，siRNA-p65-1+HN組、siRNA-p65-2+HN組及siRNA-p65-3+HN組的膜型及分泌型蛋白均低于脂質(zhì)體+HN組(P<0.05)，即敲低p65后NDV-HN上調(diào)NK細胞表達TRAIL蛋白的作用減弱，提示NF-κB信號通路在NDV體外活化NK細胞上調(diào)抗瘤效應(yīng)分子TRAIL中起著信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用。

IκBα是NF-κB的負調(diào)控元件，在細胞質(zhì)內(nèi)，IκBα可與NF-κB二聚體發(fā)生結(jié)合，形成NF-κB-IκBα三聚體，導(dǎo)致NF-κB處于失活狀態(tài)；當(dāng)感知外界信號時，IκBα激酶被激活，致IκBα從三聚體上解離，NF-κB二聚體的核定位信號結(jié)構(gòu)域被暴露，NF-κB二聚體進入細胞核內(nèi)，與含有κB序列的DNA分子結(jié)合，開啟該基因的轉(zhuǎn)錄及表達。IκBα磷酸化水平越高，進入細胞核的NF-κB二聚體就越多。本研究結(jié)果顯示，siRNA-Syk1+HN組、siRNA-Syk2+HN組、siRNA-Syk3+HN組磷酸化IκBα的蛋白表達水平均低于脂質(zhì)體+HN組(均P<0.05)，表明Syk-NF-κB可能是NDV-HN的胞內(nèi)活化信號的路徑，即Syk將活化信號傳導(dǎo)給NF-κB，導(dǎo)致TRAIL的上調(diào)。但該結(jié)論及其具體的機制仍需進一步的實驗研究驗證。

綜上所述，敲低Syk或p65可以削弱NDV-HN上調(diào)NK細胞表達TRAIL蛋白的作用，Syk和NF-κB信號通路可能參與NDV-HN增強NK細胞的抗瘤效應(yīng)。