馮夢雨,劉 栓,2,高 燕,周澍堃,國 振,李秀琴*,張慶合

(1.中國計(jì)量科學(xué)研究院,北京 100029;2.北京化工大學(xué),北京 100029)

玉米赤霉酮(zearalanone,ZAN)為玉米赤霉烯酮經(jīng)過多次轉(zhuǎn)化得到的降解產(chǎn)物,是一種白色結(jié)晶,CAS號(hào)為5975-78-0,化合物的結(jié)構(gòu)式見圖1。玉米赤霉酮具有弱雌激素效應(yīng),通過食物鏈進(jìn)入人體后,可引起人體功能發(fā)生紊亂,甚至影響生育[1,2]。目前國內(nèi)外還沒有玉米赤霉酮的限量標(biāo)準(zhǔn),國家標(biāo)準(zhǔn)方法[3-6]中規(guī)定，測定動(dòng)物源食品(牛豬肝腎、肌肉組織、牛奶和雞蛋等)和水產(chǎn)品(河豚、鰻魚、烤鰻)中玉米赤霉酮?dú)埩袅烤捎靡合嗌V-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)。目前已建立了各種分析玉米赤霉酮的方法,包括高效液相色譜法(HPLC)[7]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[8,14]、液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)[9]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10-12]。質(zhì)譜儀器因其高靈敏度和準(zhǔn)確性已經(jīng)越來越多的應(yīng)用于玉米赤霉酮等的研究。Li等[13]改進(jìn)了一種基于UPLC-MS/MS的96孔微洗脫固相萃取方法,并運(yùn)用這種方法對玉米赤霉烯酮、玉米赤霉酮及其他代謝產(chǎn)物進(jìn)行了高通量及高靈敏度的測定。Qian等[14]開發(fā)了凝膠滲透色譜法和氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法(GC-QqQ MS)同時(shí)測定食用植物油中的玉米赤霉酮等。采用雙波長熒光偏振免疫分析(DWFPIA)[15]檢測玉米中總黃曲霉毒素和玉米赤霉酮,用不同的熒光素標(biāo)記黃曲霉毒素B1(AFB1)和玉米赤霉酮,通過結(jié)合特異性抗體，開發(fā)DWFPIA方法篩選天然污染的樣品,取得了和HPLC-MS/MS相似的結(jié)果。然而目前國內(nèi)外還沒有玉米赤霉酮純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),在國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)數(shù)據(jù)庫(COMAR)和國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)資源共享平臺(tái)均未查到玉米赤霉酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及其溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相關(guān)信息。因此開展玉米赤霉酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制工作是十分必要的,以保障玉米赤霉酮相關(guān)檢測結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠。

圖1 玉米赤霉酮的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of zearalanone(ZAN)

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

超高效液相色譜-串聯(lián)Q Exactive四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀(UPLC-HRMS,美國Thermo Fisher Scientific公司);Agilent 1290超高效液相色譜儀(美國Agilent公司);ME235S(0.01 mg)、ME36S電子天平(0.001 mg)(德國Sartorius公司)。

玉米赤霉酮(純度≥99.0%)、玉米赤霉烯酮(純度≥99.5%)、α-玉米赤霉醇(純度≥97%)、β-玉米赤霉醇(純度≥98%)、α-玉米赤霉烯醇乙腈溶液(104.8 mg/L)、β-玉米赤霉烯醇乙腈溶液(99.3 mg/L)、7-脫氫玉米赤霉烯酮(純度≥90%)均購自天津阿爾塔科技有限公司。乙腈、甲酸(色譜純)購自美國Thermo Fisher Scientific公司;水(色譜純)購自德國Merck公司。

分別取適量玉米赤霉酮樣品,配制成質(zhì)量濃度為0.1 g/L和0.5 g/L的玉米赤霉酮乙腈溶液。置于-20 ℃冰箱中保存。本研究中所使用的標(biāo)準(zhǔn)溶液均采用重量法配制,乙腈為溶劑。

1.2 定性分析方法

采用紫外檢測法和質(zhì)譜法對玉米赤霉酮主成分進(jìn)行定性分析,并采用UPLC-DAD和高分辨質(zhì)譜對ZAN原料中所含痕量雜質(zhì)進(jìn)行定性鑒定。

1.2.1UPLC-DAD方法

色譜柱:Phenomenex Kinetex EVO C18柱(250 mm×4.6 mm,2.6 μm);柱溫:27 ℃;流動(dòng)相:A相為乙腈-水(40∶60,v/v)(含0.1%(v/v)甲酸)混合溶液,B相為0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液;流速:1.5 mL/min。梯度洗脫條件:0～15 min,100%A;15～16 min,100%A～10%A;16～18 min,10%A;18～19 min,10%A～100%A;19～25 min,100%A。,進(jìn)樣量:10 μL(0.5 g/L玉米赤霉酮乙腈溶液);檢測波長:264 nm。

1.2.2UPLC-HRMS方法

采用高分辨質(zhì)譜的一級質(zhì)譜全掃描加數(shù)據(jù)依賴的二級質(zhì)譜掃描方式(Full MS/dd-MS2),分析時(shí)采用正負(fù)離子切換方式。

一級質(zhì)譜參數(shù):離子源為電噴霧電離源;掃描范圍為m/z200～800;分辨率為70 000 FWHM(一個(gè)峰半峰高處的全峰寬);自動(dòng)增益控制目標(biāo)離子數(shù)(AGC target)為1×106。

dd-MS2參數(shù):分辨率為17 500 FWHM;歸一化碰撞能量(NCE)為30 eV;動(dòng)態(tài)排除時(shí)間為10.0 s;AGC target為1×105。為避免污染儀器,主成分不進(jìn)入質(zhì)譜。

1.3 主成分定量分析

購買雜質(zhì)對照品,采用已建立的UPLC-DAD方法,測量雜質(zhì)的響應(yīng)因子；無對照品雜質(zhì)的響應(yīng)因子采用其他雜質(zhì)響應(yīng)因子的平均值代替。最后采用響應(yīng)因子校正面積歸一化法對玉米赤霉酮主成分進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜分析條件的優(yōu)化

2.1.1色譜柱的選擇

目前國內(nèi)外HPLC測定真菌毒素的文獻(xiàn)[16-18]中,最常用的色譜柱為含C18官能團(tuán)的色譜柱,主要是因?yàn)镃18固定相有較高的含碳量和更好的疏水性,柱穩(wěn)定性高,壽命長,平衡速度、分析速度快,重現(xiàn)性好,對真菌毒素具有很好的分離效果。本實(shí)驗(yàn)考察了3種C18反相色譜柱,分別為色譜柱1 ACQUITY UPLC HSS T3柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)、色譜柱2 Kinetex EVO C18柱(150 mm×3.0 mm,2.6 μm)和色譜柱3 Phenomenex Kinetex EVO C18柱(250 mm×4.6 mm,2.6 μm)。實(shí)驗(yàn)以乙腈-水(40∶60,v/v)為流動(dòng)相等度洗脫20 min,結(jié)果顯示,在3種色譜柱上樣品的峰形與分離效果均較好,能分離出的雜質(zhì)數(shù)目相同,各個(gè)峰的分離度均大于1.5,其中采用色譜柱3時(shí)，分離出的4個(gè)色譜峰的分離度分別為13.37、13.67和13.64,分離度最好。因此本研究選擇分離度最好的Phenomenex Kinetex EVO C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,2.6 μm)進(jìn)行分析。

圖2 采用不同流動(dòng)相時(shí)玉米赤霉酮原料的色譜圖Fig.2 Chromatograms of ZAN raw material using the different mobile phases a.mobile phase:water and acetonitrile (50∶50,v/v),isocratic elution;b.mobile phase:water (A)and acetonitrile (B),gradient elution:0～23 min,60%A;23～24 min,60%A～10%A;24～26 min,10%A;26～27 min,10%A～60%A;27～35 min,60%A;c.mobile phase:acetonitrile-water (40∶60,v/v)containing with 0.1% (v/v)formic acid (A)and acetonitrile containing with 0.1% (v/v)formic acid (B),gradient elution:0～23 min,100%A;23～24 min,100%A～10%A;24～26 min,10%A;26～27 min,10%A～100%A;27～35 min,100%A. Peaks 1-4 were the impurities 1-4..

2.1.2流動(dòng)相組成

考察了不同比例的水和乙腈作為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫和梯度洗脫時(shí)主成分與雜質(zhì)的出峰情況,結(jié)果見圖2。由圖2可知,在水-乙腈(50∶50,v/v)(流動(dòng)相a)條件下等度洗脫,分離出3種雜質(zhì),基線較平穩(wěn),各雜質(zhì)之間及與主峰之間能基本分離,但主峰有拖尾現(xiàn)象(拖尾因子(T)=1.32)。在水-乙腈(60∶40,v/v)(流動(dòng)相b)初始條件下梯度洗脫,僅分離出的2種雜質(zhì),各雜質(zhì)之間與主峰之間均能完全分離,但所有峰均有嚴(yán)重拖尾現(xiàn)象,3個(gè)峰的拖尾因子分別為2.01、1.79和2.1。以乙腈-水(40∶60,v/v)(含0.1%(v/v)甲酸)混合溶液為A相、0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液為B相(流動(dòng)相c)進(jìn)行梯度洗脫，可分離出4種雜質(zhì),而且峰與峰之間的分離度均大于1.5,色譜峰對稱性較好。因此,綜合考慮分離雜質(zhì)數(shù)量和峰形,選擇流動(dòng)相c作為最佳流動(dòng)相條件。

為確證該流動(dòng)相條件下能夠?qū)⒃现兴械姆菢O性雜質(zhì)完全洗脫,在最優(yōu)流動(dòng)相洗脫結(jié)束后,再以乙腈-水(90∶10,v/v)洗脫60 min,結(jié)果表明主成分出峰之后并無雜質(zhì)被洗脫出來,因此后續(xù)不采用乙腈-水(90∶10,v/v)繼續(xù)洗脫。

2.1.3流動(dòng)相流速

考察了1.0 mL/min和1.5 mL/min不同流速下玉米赤霉酮原料的分離情況。結(jié)果顯示,兩者分離出的雜質(zhì)數(shù)目相同,且峰與峰之間的分離度均大于1.5。增加流速,可縮短分析時(shí)間,因此選用1.5 mL/min的流速。

2.1.4樣品濃度的選擇

考察了0.1、0.5、1.0 g/L的樣品進(jìn)樣時(shí)的分離情況。結(jié)果顯示,不同的樣品濃度,分離結(jié)果沒有差別。為了節(jié)省樣品、減少污染,采用0.1 g/L樣品溶液進(jìn)行定量分析,0.5 g/L樣品溶液進(jìn)行定性分析。

2.1.5檢測波長的選取

對玉米赤霉酮原料在190 nm～400 nm波長下掃描,發(fā)現(xiàn)玉米赤霉酮的3個(gè)最大吸收波長分別為216、264和302 nm;雜質(zhì)1的最大吸收波長為262 nm,雜質(zhì)3的為216 nm和264 nm,雜質(zhì)4的為256 nm。綜合考慮主成分和雜質(zhì)的響應(yīng),選用264 nm作為檢測波長。

2.2 定性分析

2.2.1主成分定性分析

從玉米赤霉酮原料的質(zhì)譜圖可得出其主成分([M-H]-)的相對分子質(zhì)量為319.2,與玉米赤霉酮的相對分子質(zhì)量(320.380)相符合,另外兩個(gè)特征碎片離子的m/z275.3、205.2均與文獻(xiàn)報(bào)道[19,20]一致。根據(jù)玉米赤霉酮的裂解規(guī)律,推測玉米赤霉酮的裂解途徑見圖3,其酯基斷裂,脫去一個(gè)CO2分子,產(chǎn)生離子[M-H-CO2]-,該離子進(jìn)一步脫去一個(gè)C5H10分子得到[M-H-CO2-C5H10]-,兩個(gè)離子的質(zhì)荷比與上述兩個(gè)特征碎片離子的質(zhì)荷比一致,可以證明此樣品為玉米赤霉酮。

圖3 負(fù)離子模式下玉米赤霉酮的裂解途徑Fig.3 Fragmentation pathway of the ZAN in negative ion mode

圖4 玉米赤霉酮乙腈溶液(0.5 g/L)、乙腈、α-玉米 赤霉醇(0.1 g/L)和β-玉米赤霉醇(0.1 g/L)的典型色譜圖 Fig.4 Typical chromatograms of ZAN acetonitrilesolution(0.5 g/L),acetonitrile,α-ZAN(0.1 g/L)and β-ZAN(0.1 g/L)Peaks 1-4 were the impurities 1-4.

2.2.2雜質(zhì)定性分析

采用UPLC-DAD對玉米赤霉酮原料進(jìn)行分析,得到其主成分及雜質(zhì)成分的典型色譜圖(見圖4)。根據(jù)面積歸一化法可知,雜質(zhì)1～4的含量分別為0.018%、<0.01%、0.287%和0.19%。根據(jù)ZAN可能的代謝降解路徑,推測樣品中可能含有玉米赤霉醇、玉米赤霉烯醇、玉米赤霉烯酮等。根據(jù)保留時(shí)間進(jìn)行初步鑒定,雜質(zhì)1為β-玉米赤霉醇,雜質(zhì)3為α-玉米赤霉醇。

采用UPLC-HRMS的Full mass dd-MS2模式對ZAN原料中的3種主要雜質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。由圖5可知,雜質(zhì)1母離子([M-H]-)的m/z為321.171 11與β-玉米赤霉醇母離子的m/z321.171 14一致,質(zhì)譜圖也完全一致,確證該雜質(zhì)為β-玉米赤霉醇;雜質(zhì)3母離子([M-H]-)的m/z為321.171 20與α-玉米赤霉醇母離子的m/z321.172 03一致,質(zhì)譜圖也完全一致,確證該雜質(zhì)為α-玉米赤霉醇。α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇為同分異構(gòu)體,它們的主要質(zhì)譜碎片的裂解途徑見圖6a,m/z為303.160 92的主要碎片為玉米赤霉醇7位C上的羥基與6位C上的氫作用脫去一個(gè)H2O分子,而產(chǎn)生的離子[M-H-H2O]-,該分子進(jìn)一步脫去一個(gè)CO2產(chǎn)生m/z為259.170 72的離子;另一m/z為277.181 24的主要碎片為玉米赤霉醇的酯基脫去一個(gè)CO2分子產(chǎn)生。

由圖5可知,雜質(zhì)4母離子的m/z為303.160 74,軟件推測雜質(zhì)4的分子式為C18H24O4,可以得知該化合物母離子與玉米赤霉醇母離子(m/z321.171 11)的分子量相差18,推測該化合物為玉米赤霉醇的脫水降解產(chǎn)物,其結(jié)構(gòu)為玉米赤霉醇7位羥基脫掉一個(gè)H2O分子,在6位C和7位C之間形成一個(gè)烯鍵。根據(jù)該雜質(zhì)的進(jìn)一步質(zhì)譜碎片,推測其裂解途徑如圖6b所示,主要碎片(m/z259.170 68)為脫水玉米赤霉醇的酯基脫去一個(gè)CO2分子,該分子進(jìn)一步脫去一個(gè)C2H4分子產(chǎn)生m/z為231.138 52的碎片,其脫去一個(gè)C2H2分子得到m/z為205.123 12的碎片離子。但是,目前無法購買到脫水玉米赤霉醇的對照品,不能進(jìn)行驗(yàn)證。

圖5 雜質(zhì)1、3與其對照品和雜質(zhì)4的二級質(zhì)譜圖Fig.5 MS2 spectra of impurities1,3 and their standards,and impurity4

圖6 負(fù)離子模式下(a)雜質(zhì)1、雜質(zhì)3和(b)雜質(zhì)4可能的裂解途徑Fig.6 Proposed fragmentation pathways of(a)impurity1 or impurity3 and(b)impurity4 in negative ion mode

2.3 定量分析

2.3.1雜質(zhì)響應(yīng)因子的測定

2015版中國藥典[21]中規(guī)定測定雜質(zhì)含量時(shí),可采用加校正因子的主成分自身對照法,通常以主成分為參比,且需將供試品溶液稀釋作為對照溶液;雜質(zhì)含量低于0.5%的峰面積的RSD應(yīng)小于10%。趙敬丹等[22]比較了外標(biāo)法和加校正因子的主成分自身對照法測定頭孢孟多酯鈉中的雜質(zhì),結(jié)果基本一致。因此在沒有雜質(zhì)對照品的情況下,均應(yīng)采用加校正因子的主成分自身對照法定量,增加測定結(jié)果的準(zhǔn)確度,也無需持續(xù)提供雜質(zhì)對照品。劉光敏[23]采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法和加校正因子的主成分自身對照法測定非那雄胺片中2種有關(guān)物質(zhì)含量,測定結(jié)果也基本一致。采用相對校正因子法適用于快速檢測,現(xiàn)場檢測[24]。

采用單點(diǎn)法測量,根據(jù)公式(1)和(2)計(jì)算雜質(zhì)和主成分相應(yīng)進(jìn)樣量下的響應(yīng)因子和相對響應(yīng)因子。對于沒有對照品的雜質(zhì)4，用雜質(zhì)1和3兩個(gè)已知雜質(zhì)響應(yīng)因子的平均值作為其相對響應(yīng)因子。公式(1)和(2)如下所示：

(1)

(2)

式中,fi和fm:雜質(zhì)組分和主成分的響應(yīng)因子,mAU×min/ng;Ai和Am:雜質(zhì)組分和主成分的色譜峰面積,mAU×min;Ci和Cm:雜質(zhì)組分和主成分進(jìn)樣的質(zhì)量濃度,g/L;Vi和Vm:雜質(zhì)組分和主成分的進(jìn)樣體積,μL;Fi:各雜質(zhì)相對主成分的相對校正因子。

根據(jù)公式計(jì)算得到雜質(zhì)1、3和主成分的響應(yīng)因子分別為0.745 4、1.196 9和1.392 8 mAU×min/ng。使用主成分響應(yīng)因子校正后得到雜質(zhì)1和3的相對校正因子為0.535 2和0.859 4,雜質(zhì)4的相對校正因子取這兩者的平均值,為0.697 3。3個(gè)雜質(zhì)的相對響應(yīng)因子均不在0.9～1.1之間,因此可采用“加校正因子的主成分自身對照法”計(jì)算雜質(zhì)的含量[25-27]。

2.3.2主成分純度定量分析

由于儀器響應(yīng)的線性限制,峰面積歸一化法一般不宜用于微量雜質(zhì)的檢査。因此采用校正后的峰面積歸一化法來測定主成分純度,公式(3)如下所示:

(3)

式中,Po為主成分純度。

采用UPLC-DAD法測定主成分純度。稱取11份玉米赤霉酮原料約1 mg，配制成0.5 g/L的乙腈溶液，進(jìn)樣分析。按公式(3)計(jì)算，采用相對校正因子校正后，雜質(zhì)1的含量小于0.01%,雜質(zhì)3和雜質(zhì)4的含量分別為0.2%和0.1%。最終得到玉米赤霉酮主成分的純度為99.6%,標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.01%。

3 結(jié)論

研究建立了玉米赤霉酮的純度定量以及結(jié)構(gòu)類似物雜質(zhì)的定性和定量分析方法。針對高純標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制中微痕量雜質(zhì)的定性鑒別和分析難點(diǎn)和關(guān)鍵點(diǎn),通過采用UPLC-DAD和UPLC-HRMS技術(shù)成功鑒定了玉米赤霉酮中的3種雜質(zhì)。該方法可為玉米赤霉酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制提供理論支持。