霍春暉,李英華,喬 智,尚 志,曹成喜,洪 洋,肖 華*

(1.微生物代謝國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,上海 200240;2.復(fù)旦大學(xué)附屬第五人民醫(yī)院,上海 200240;3.上海交通大學(xué)電子信息與電氣工程學(xué)院,上海 200240)

外泌體是細(xì)胞分泌的具膜小體,尺寸在30～150 nm之間,具有穩(wěn)定的雙層膜結(jié)構(gòu),可以選擇性地包裹大量生物活性物質(zhì),如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等[1,2]。外泌體屬于細(xì)胞外囊泡,在進(jìn)入細(xì)胞外微環(huán)境后,通過(guò)膜融合的方式,將內(nèi)含的物質(zhì)傳遞到受體細(xì)胞中,進(jìn)行物質(zhì)的交流和傳遞,可以反映人體的生理和病理狀態(tài)[3,4]。據(jù)文獻(xiàn)[5]報(bào)道,惡性細(xì)胞分泌的外泌體與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),并影響正常細(xì)胞的功能,同時(shí)可以促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移和血管的生成,或引起體內(nèi)的免疫應(yīng)答等功能。外泌體攜帶大量的蛋白質(zhì),目前的研究表明,外泌體蛋白質(zhì)可用于多種疾病的臨床診斷和機(jī)制研究。例如,乳腺癌患者血漿外泌體中RALGAPA2等蛋白質(zhì)相對(duì)正常人顯著上調(diào),有望用于乳腺癌的早期分子篩查[6]。定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明,骨質(zhì)疏松患者的血清外泌體參與抑制體內(nèi)成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程[7]。因此,對(duì)外泌體蛋白質(zhì)組進(jìn)行深入研究,一方面可以更好地理解疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制,另一方面可以為疾病的分子診斷和治療提供支持,加速推進(jìn)精準(zhǔn)醫(yī)療。

隨著人口老齡化程度的加重,骨質(zhì)疏松癥已日益成為我國(guó)嚴(yán)重的健康問(wèn)題,給社會(huì)和家庭帶來(lái)了巨大的負(fù)擔(dān)[8]。骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生是由于人體內(nèi)負(fù)責(zé)骨吸收的破骨細(xì)胞與決定骨形成的成骨細(xì)胞之間的骨動(dòng)態(tài)平衡被打破,當(dāng)骨形成的能力弱于骨吸收的能力,會(huì)引起骨密度降低,導(dǎo)致骨骼微結(jié)構(gòu)惡化,從而增加臨床骨脆性骨折的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[9,10]。由于骨量減少的過(guò)程往往非常緩慢且缺乏明顯癥狀,患者在早期骨量減少階段很難意識(shí)到疾病的存在[11],一般在骨折之后才會(huì)意識(shí)到嚴(yán)重性,但已錯(cuò)過(guò)了最佳的預(yù)防和治療時(shí)機(jī)。

臨床上常用雙能X射線(xiàn)法測(cè)定人體骨密度,評(píng)估骨量狀態(tài)和罹患骨折的風(fēng)險(xiǎn)并診斷骨質(zhì)疏松。世界衛(wèi)生組織對(duì)骨密度診斷骨質(zhì)疏松癥的評(píng)價(jià)是測(cè)定T值進(jìn)行評(píng)估,T值的定義為(測(cè)定值-同性別同種族正常成人骨峰值)/正常成人骨密度標(biāo)準(zhǔn)差,通常當(dāng)骨密度T值≤-2.5為時(shí)骨質(zhì)疏松,當(dāng)-2.5-1.0時(shí)為健康狀態(tài)[12]。但是通常情況下,骨密度只能反映骨量的多少,很難體現(xiàn)骨質(zhì)量的高低,如骨礦化等,所以骨密度診斷法有時(shí)不能很準(zhǔn)確地判斷骨量狀態(tài),且很難分辨患者在接受治療后的骨平衡狀態(tài)[13]。骨轉(zhuǎn)換生化標(biāo)志物的檢測(cè)也經(jīng)常用于骨質(zhì)疏松癥的診斷,如N-telopeptide、C-telopeptide等,對(duì)這些生化標(biāo)志物含量的測(cè)定,在預(yù)后評(píng)價(jià)上有著更大的優(yōu)勢(shì)。通過(guò)觀察這些物質(zhì)的含量變化,可以更好地了解骨吸收和骨形成動(dòng)態(tài)過(guò)程,用來(lái)評(píng)估骨平衡狀態(tài)。但是這些體液中的標(biāo)志物容易受到飲食、性別和體液內(nèi)酶影響,靈敏度不是很高[14]。因此,急需發(fā)展特異性生物標(biāo)志物,用于骨質(zhì)疏松癥的篩查,促進(jìn)骨質(zhì)疏松的預(yù)防和治療。

外泌體蘊(yùn)含豐富的蛋白質(zhì),有望作為骨質(zhì)疏松癥早期診斷標(biāo)志物。對(duì)骨質(zhì)疏松癥患者血清外泌體的蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行研究,可以更好地從蛋白質(zhì)水平去理解骨量流失過(guò)程,找出在骨質(zhì)疏松癥狀態(tài)下發(fā)生變化的蛋白質(zhì),作為臨床診斷特異性的標(biāo)志物。本文對(duì)血清外泌體進(jìn)行了分離分析和表征,對(duì)正常人、骨量減少患者和骨質(zhì)疏松患者血清中的外泌體采用基于液相色譜-質(zhì)譜的技術(shù)進(jìn)行定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)骨量減少過(guò)程中外泌體蛋白質(zhì)組所發(fā)生了系統(tǒng)性變化,為骨質(zhì)疏松疾病的篩查和診斷奠定了基礎(chǔ)。

表1 入組樣本的臨床信息Table1 Clinical information of the enrolled samples

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 血清樣本的收集

本研究所用血清樣本均由復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院提供,樣本提供者在樣本采集前均簽署了書(shū)面知情同意書(shū),12例臨床樣本信息匯總見(jiàn)表1。所有實(shí)驗(yàn)方案和操作步驟均根據(jù)上海交通大學(xué)Bio-X倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的方案(IRB#M15017)進(jìn)行。血液樣本均按照批準(zhǔn)的方案進(jìn)行收集,具體步驟為,首先將收集的血液置于含促凝劑的離心管中,室溫放置20 min直至部分凝固,然后以2 000 g的速度離心20 min,去除血細(xì)胞和血小板,最后將得到的血清分裝到1.5 mL管中并置于-80 ℃冷凍儲(chǔ)存,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 儀器、試劑與材料

血清外泌體蛋白質(zhì)組分析采用液相色譜-質(zhì)譜系統(tǒng),包括納升液相色譜(EASY nL Thermo,Fisher Scientific,USA)和四極桿超高分辨軌道阱質(zhì)譜儀(Q Exactive Plus,Thermo Fisher Scientific,USA),用于蛋白質(zhì)的定性和定量分析。超高速離心機(jī)(Beckman,USA)用于外泌體的分離富集。納米粒徑分析儀Nano Sight S300(Malvern,UK)用于外泌體粒徑分布和濃度檢測(cè)。透射電子顯微鏡(TecnaiG2 spirit Biotwin,USA)用于觀察血清外泌體的形態(tài)。

質(zhì)譜級(jí)乙腈和甲酸溶液購(gòu)于Thermo Fisher Scientific公司(USA)。RIPA裂解液(Millipore,USA)用于外泌體的破膜處理和蛋白提取。Pierce?BCA蛋白試劑盒(Thermo Fisher Scientific,USA)用于總蛋白濃度的測(cè)定。測(cè)序級(jí)胰蛋白酶(Promega,USA)用于蛋白質(zhì)的酶解。Fast Silver銀染試劑盒(Beyotime,中國(guó))用于SDS-PAGE蛋白膠條的染色。CD63(ImmunoWay,USA)、TSG101(Abcam,UK)和CD9(Abcam,UK)抗體用于血清外泌體的表征。

圖1 血清外泌體的分離和蛋白質(zhì)組學(xué)分析流程示意圖Fig.1 Schematic diagram of the isolation and proteomicsanalysis of serum exosomes

1.3 血清外泌體的分離富集

血清外泌體的分離按照文獻(xiàn)[15]方法進(jìn)行,步驟如圖1所示。首先將血清樣本和PBS(phosphate buffered saline)溶液以1∶20(v/v)的比例充分混勻稀釋,并以300 g的速度離心10 min去除血細(xì)胞和血小板,將上清以2 600 g的速度離心20 min去除沉淀。得到的上清在10 000 g的速度下離心60 min,去除微囊泡。對(duì)所得上清以100 000 g的速度離心120 min,得到血清外泌體,以PBS溶液對(duì)血清外泌體進(jìn)行重懸洗滌,以100 000 g的速度離心120 min,重復(fù)洗滌步驟兩次,棄去上清,得到最終的血清外泌體。將所得外泌體重懸在100 μL PBS溶液中,加入10 μL RIPA裂解液和10 μL蛋白酶抑制劑,置于冰上60 min進(jìn)行破膜和蛋白質(zhì)提取,采用BCA(bicinchoninic acid)法測(cè)定外泌體蛋白質(zhì)濃度,并于-80 ℃下保存,以備使用。所有操作步驟均在4 ℃下進(jìn)行。

1.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)

分別將2 μg血清蛋白質(zhì)和血清外泌體蛋白質(zhì)點(diǎn)樣進(jìn)10%SDS-PAGE凝膠(GenScript,USA)中,以120 V電壓運(yùn)行70 min。預(yù)染色的蛋白標(biāo)記物(Life technologies,中國(guó))用來(lái)追蹤蛋白質(zhì)遷移,觀察電泳情況。采用Fast Silver銀染試劑盒進(jìn)行染色,使用EPSON Perfection V700 PHOTO(EPSON,中國(guó))掃描凝膠圖像。

1.5 外泌體的納米粒徑分析

將分離富集的外泌體重懸于100 μL PBS溶液中,充分振蕩混勻后,取10 μL,用超純水稀釋至1 mL,注入Nano-Sight S300納米粒度分析儀中,按照標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行粒徑分布和濃度的測(cè)定。測(cè)試溫度為4 ℃。每個(gè)樣本的取樣分析次數(shù)設(shè)定為3次。采用Nano-Sight NTA(V 3.2)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,取3次擬合結(jié)果。

1.6 外泌體的透射電鏡分析

將分離富集的外泌體重懸于100 μL PBS溶液中,取10 μL滴在電鏡測(cè)試的銅網(wǎng)上,室溫下靜置5 min,然后用濾紙吸去浮液,再用超純水洗3次,待其風(fēng)干之后加10 μL磷鎢酸溶液于銅網(wǎng)上,靜置染色2 min后用無(wú)塵濾紙吸去殘液,室溫下靜置風(fēng)干,制成電鏡測(cè)試樣本,上機(jī)分析。采用透射電鏡(TecnaiG2 spirit Biotwin,USA)在80～120 kV下觀察血清外泌體的形貌。

1.7 蛋白免疫印跡分析

采用蛋白免疫印跡對(duì)血清外泌體的標(biāo)志性蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè),包括CD63(CD63 antigen)、TSG101(tumor susceptibility gene 101 protein)和CD9(CD9 antigen)。簡(jiǎn)要實(shí)驗(yàn)步驟為:(1)SDS-PAGE分離:分別取10 μg外泌體蛋白質(zhì)和血清上清液蛋白質(zhì),上樣到10% Bis-Tris蛋白質(zhì)凝膠中,在120 V下電泳70 min。(2)轉(zhuǎn)膜:將預(yù)先用乙醇活化好的PVDF膜準(zhǔn)備好,采用濕轉(zhuǎn)法在恒定電流200 mA的轉(zhuǎn)膜緩沖液中遷移60 min,將SDS-PAGE膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。(3)封閉:將PVDF膜用PBST(phosphate buffered saline Tween-20)溶液簡(jiǎn)單清洗后,加5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂牛奶并在室溫下輕微振蕩,封閉60 min。(4)一抗孵育:按照抗體說(shuō)明書(shū)推薦的比例用BSA溶液稀釋一抗,與PVDF膜在4 ℃下孵育過(guò)夜。(5)二抗孵育:將一抗孵育過(guò)夜后的膜以PBST溶液洗滌3次,然后加入相應(yīng)的二抗,在室溫孵育1 h。(6)顯色:加入ECL(electrochemiluminescence)顯色液,反應(yīng)幾分鐘之后,用EPSON顯影儀器進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。

1.8 蛋白質(zhì)酶解

采取FASP(filter-aided sample preparation)酶解方式進(jìn)行蛋白質(zhì)酶解[15]。具體實(shí)驗(yàn)步驟為,首先將外泌體蛋白質(zhì)和5倍體積的50%(體積分?jǐn)?shù),下同)乙醇、50%丙酮和0.1%乙酸組成的有機(jī)溶液充分混勻,在-20 ℃下過(guò)夜。將得到的蛋白質(zhì)沉淀溶解于60 μL 6 mol/L鹽酸胍溶液中。加入2 μL DL-二硫蘇糖醇(DTT),在60 ℃下還原60 min,然后加入10 μL吲哚-3-乙酸(IAA),在避光條件下烷基化40 min。將得到的蛋白質(zhì)溶液轉(zhuǎn)移到10 kDa過(guò)濾管中,并在4 ℃下以12 000 g的速度離心20 min以濃縮蛋白質(zhì),按酶:蛋白質(zhì)=1∶20(質(zhì)量比)的比例加入胰蛋白酶(Promega,USA),在37 ℃下反應(yīng)16 h,將外泌體蛋白質(zhì)充分酶解成肽段。

1.9 液相色譜-質(zhì)譜條件和免標(biāo)記定量分析

1.9.1液相色譜-質(zhì)譜條件

采用納升液相色譜-四極桿超高分辨軌道阱質(zhì)譜儀對(duì)外泌體蛋白質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析。將外泌體蛋白質(zhì)的肽段重溶在0.1%甲酸水溶液中,取等量(1 μg)肽段樣品進(jìn)樣到色譜系統(tǒng)中,以200 nL/min的流速通過(guò)15 cm長(zhǎng)的分析型反相色譜柱(15 cm×75 μm,3 μm,C18,Thermo Fisher Scientific),運(yùn)行120 min色譜梯度進(jìn)行分離。流動(dòng)相A為99.9%水和0.1%甲酸混合液,流動(dòng)相B為80%乙腈水溶液和0.1%甲酸混合液。洗脫的梯度為0～25 min,2%～8%B;25～90 min,9%～20%B;90～106 min,20%～30%B;106～109 min,30%～95%B;109～117 min,95%B;117～119 min,95%～2%B;119～120 min,2%B。采用ESI正極模式,電噴霧電壓為2.0 kV,離子源溫度為275 ℃,選擇質(zhì)荷比在350～1 500之間且電荷數(shù)為2～7的母離子進(jìn)行二級(jí)碎裂,采用數(shù)據(jù)依賴(lài)性?huà)呙枘Ｊ?。母離子掃描分辨率設(shè)為70 000,自動(dòng)增益控制(automa-tic gain control,AGC)為106,碰撞能量設(shè)置為28,在Orbitrap中以17 500的分辨率檢測(cè)離子碎片。動(dòng)態(tài)排除時(shí)間設(shè)置為30 s,在一個(gè)MS掃描之后交替進(jìn)行20次MS/MS。

1.9.2質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析處理

對(duì)采集的質(zhì)譜數(shù)據(jù),通過(guò)MaxQuant軟件進(jìn)行分析處理,在Human SwissProt數(shù)據(jù)庫(kù)(548208序列)中進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定。搜索條件設(shè)置為:最多允許2個(gè)胰蛋白酶漏切位點(diǎn),氧化修飾和乙酰化修飾設(shè)為可變修飾,前體和碎片離子的質(zhì)量誤差分別為6 ppm(10-6)和0.5 Da。蛋白質(zhì)鑒定的標(biāo)準(zhǔn)為:至少檢測(cè)到2個(gè)特征肽段,p<0.05,且假陽(yáng)率(FDR)小于1%。通過(guò)在MaxQuant中使用基于強(qiáng)度的絕對(duì)定量(intensity-based absolute quantification,iBAQ)對(duì)鑒定的肽段進(jìn)行定量分析,將每種蛋白質(zhì)的iBAQ對(duì)其所在樣品總iBAQ值的貢獻(xiàn)進(jìn)行歸一化處理,且至少根據(jù)該蛋白質(zhì)的兩個(gè)特征肽段iBAQ值來(lái)確定其相對(duì)豐度。計(jì)算差異蛋白質(zhì)的變化倍數(shù)和p值,p<0.01表示組間存在顯著差異變化,變化倍數(shù)大于2視為顯著上調(diào),小于0.5則表示顯著下調(diào)。

2 結(jié)果與討論

本文對(duì)血清外泌體進(jìn)行了分離富集和表征,并對(duì)血清外泌體蛋白質(zhì)組進(jìn)行了定性分析。通過(guò)對(duì)正常對(duì)照組、骨量減少組和骨質(zhì)疏松癥的血清外泌體進(jìn)行定量蛋白質(zhì)組分析,發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松相關(guān)蛋白質(zhì)。

圖2 血清外泌體的表征Fig.2 Characterization of serum exosomes a.Exosomes particle size distribution.b.Western blotting analysis of CD63 (CD63 antigen),TSG101 (tumor susceptibility gene 101 protein),and CD9 (CD9 antigen)in exosomes (Exo)and serum supernatant (Sup).c.Transmission electron microscope images of exosomes.

2.1 血清外泌體的分離富集和表征

血清樣本黏度很高,且含有大量高豐度蛋白質(zhì),不利于外泌體分離,因此,在分離富集之前用PBS溶液按照1∶20的體積比對(duì)血清進(jìn)行稀釋,然后再進(jìn)行差速分離。對(duì)分離富集得到的外泌體,分別進(jìn)行納米粒徑分析、透射電鏡分析和免疫印跡分析,表征結(jié)果如圖2所示。從圖2a外泌體的粒徑分布結(jié)果可以看出,富集到的外泌體尺寸大小在30～150 nm之間,并且其粒徑峰值在97 nm處。外泌體的濃度為2.05×109particles/mL。接著,采用免疫印跡方法對(duì)外泌體表面特異性標(biāo)志物CD63、TSG101和CD9進(jìn)行了驗(yàn)證,同時(shí)以血清上清蛋白質(zhì)作為對(duì)照,結(jié)果如圖2b所示,這3種標(biāo)志物在外泌體蛋白質(zhì)中的表達(dá)強(qiáng)度很高,但在血清上清中沒(méi)有表達(dá)或表達(dá)量很低。最后對(duì)外泌體進(jìn)行了透射電鏡分析,直接觀察其形貌,結(jié)果如圖2c所示。血清外泌體的尺寸大小在100 nm左右,為橢圓形,符合外泌體的形貌特征。以上結(jié)果說(shuō)明成功富集到了血清外泌體,所用外泌體分離流程可以用于后續(xù)骨質(zhì)疏松實(shí)驗(yàn)。

2.2 血清外泌體的蛋白質(zhì)組研究

對(duì)提取的外泌體蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE分析,以血清上清蛋白質(zhì)作為對(duì)照,結(jié)果如圖3a所示。從圖中可以看出,外泌體的蛋白質(zhì)輪廓與血清上清有顯著不同。血清中的高豐度蛋白質(zhì)在外泌體中都明顯減少甚至消失,如70 kDa的血清白蛋白、55和25 kDa的免疫球蛋白重鏈和輕鏈。同時(shí),外泌體中有許多血清上清中沒(méi)有的特征條帶,特別是在相對(duì)分子質(zhì)量高于100 kDa的區(qū)域,可能是因?yàn)檫@些外泌體蛋白質(zhì)攜帶大量的翻譯后修飾[16]。采用液相色譜-質(zhì)譜對(duì)外泌體蛋白質(zhì)進(jìn)行定性分析,3次技術(shù)重復(fù)的結(jié)果共鑒定到了179個(gè)外泌體蛋白質(zhì)(見(jiàn)圖3b)。為了分析這些外泌體蛋白質(zhì)具有的分子功能、參與的生物過(guò)程以及在細(xì)胞中的定位,本文進(jìn)行了基因注釋分析(Gene Ontology,GO),如圖3d所示。結(jié)果表明,外泌體蛋白質(zhì)主要參與防御反應(yīng)、蛋白質(zhì)激活和免疫應(yīng)答等生物過(guò)程,主要分布在細(xì)胞外區(qū)域和囊泡中,參與的分子功能主要有蛋白質(zhì)結(jié)合和抗原結(jié)合等,這些結(jié)果與文獻(xiàn)[17]報(bào)道基本一致。綜上所述,血清外泌體具有自身的獨(dú)特性,外泌體蛋白質(zhì)組可以反映生理和病理變化。

圖3 外泌體的蛋白質(zhì)組學(xué)分析Fig.3 Proteomic analysis of serum exosomes a.SDS-PAGE (sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)of exosomes and serum supernatant.Lane M:marker;lane Sup:serum supernatant;lane Exo:exosomes.b.Venn diagram of identified exosomes proteins.c.Venn diagram of exosomes proteins and ExoCarta database.d.Gene Ontology analysis of exosomes proteins.

2.3 血清外泌體蛋白質(zhì)組在骨質(zhì)疏松中的應(yīng)用

進(jìn)一步將血清外泌體蛋白質(zhì)組應(yīng)用于骨質(zhì)疏松研究。將正常對(duì)照組(n=4)、骨量減少組(n=4)和骨質(zhì)疏松組(n=4)的血清分別混合均勻,并分離富集血清外泌體。采用免標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法對(duì)3組外泌體蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行比較分析,每個(gè)樣品進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。經(jīng)MaxQuant軟件分析和歸一化,共鑒定到229個(gè)蛋白質(zhì),其中在正常對(duì)照組、骨量減少組和骨質(zhì)疏松組中分別鑒定到188、224和185個(gè)蛋白質(zhì)(見(jiàn)圖4a)。對(duì)鑒定到的229個(gè)蛋白質(zhì)和外泌體數(shù)據(jù)庫(kù)ExoCarta進(jìn)行了比對(duì),結(jié)果顯示有74.5%的蛋白質(zhì)是外泌體蛋白質(zhì)(見(jiàn)圖3c)。定量比較分析結(jié)果顯示,很多蛋白質(zhì)在3組之間差異明顯(圖4b)。其中,骨量減少組相對(duì)正常對(duì)照組有71個(gè)上調(diào)、9個(gè)下調(diào),骨質(zhì)疏松組相對(duì)骨量減少組有5個(gè)上調(diào)、77個(gè)下調(diào),而骨質(zhì)疏松組相對(duì)正常對(duì)照組有6個(gè)上調(diào)、20個(gè)下調(diào)。

進(jìn)一步對(duì)骨質(zhì)疏松組和正常對(duì)照組之間變化倍數(shù)大于2或小于0.5的71個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行了信號(hào)通路分析(ingenuity pathway analysis,IPA),結(jié)果鑒定到了這些蛋白質(zhì)參與的10個(gè)典型通路(見(jiàn)圖4c),包括整合素信號(hào)通路(integrin signaling)和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架信號(hào)通路(actin cytoskeleton signaling)等。整合素信號(hào)通路是維持骨組織動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程的重要信號(hào)通路,可以通過(guò)調(diào)節(jié)骨細(xì)胞功能,包括增殖、發(fā)育、分化、細(xì)胞黏附、遷移和凋亡,參與骨組織的重建和骨平衡的維持[18]。整合素蛋白質(zhì)還可以通過(guò)整合素信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶的磷酸化來(lái)響應(yīng)流體剪切力,調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)[19]。肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架信號(hào)通路以及該信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白質(zhì)在骨細(xì)胞的生長(zhǎng)和骨組織形成過(guò)程中扮演著重要角色,參與該信號(hào)通路的蛋白質(zhì)Filamin A、Talin 1和Gelsolin在本研究中也得到質(zhì)譜鑒定。已有研究表明,通過(guò)對(duì)成骨細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架信號(hào)進(jìn)行抑制,會(huì)影響成骨細(xì)胞的功能,進(jìn)而抑制骨組織形成和骨平衡狀態(tài)[20]。這些結(jié)果表明,在骨質(zhì)疏松患者血清外泌體中發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)可能和骨量減少密切相關(guān),這些蛋白質(zhì)參與的信號(hào)通路有助于深入研究骨質(zhì)流失的機(jī)制。

按照變化倍數(shù)在2倍以上的標(biāo)準(zhǔn),篩選出在骨質(zhì)疏松組或骨量減少組中變化顯著的17個(gè)蛋白質(zhì),包括Integrin β3、Integrin α2β1、Talin 1和Gelsolin等(見(jiàn)表2),并對(duì)這些蛋白質(zhì)進(jìn)行了蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析。結(jié)果表明,這些蛋白質(zhì)之間存在很強(qiáng)的相互作用(見(jiàn)圖4d),它們很可能通過(guò)共同協(xié)作來(lái)行使功能,這也說(shuō)明骨質(zhì)疏松患者體內(nèi)發(fā)生了系統(tǒng)性變化。例如,Integrin β3 (ITGB3)是破骨細(xì)胞中高表達(dá)的一種整合素蛋白質(zhì),對(duì)于破骨細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白環(huán)和皺褶膜的形成有著重要作用,是細(xì)胞骨架重排和破骨細(xì)胞功能活化必不可少的關(guān)鍵蛋白質(zhì)。當(dāng)Integrin β3信號(hào)增強(qiáng)會(huì)提高破骨細(xì)胞的活力,導(dǎo)致骨量下降并大大增加骨折的風(fēng)險(xiǎn)[21]。此外,Integrin β3蛋白還可以調(diào)節(jié)其他骨疾病(如骨瘤)中破骨細(xì)胞的功能[22],因此Integrin β3對(duì)研究骨質(zhì)疏松癥等骨疾病有著重要的意義。另一個(gè)重要的整合素蛋白Integrin α2β1 (ITGA2B),位于破骨細(xì)胞的皺褶邊緣,對(duì)破骨細(xì)胞和骨組織結(jié)合能力有重要的作用,當(dāng)用針對(duì)Integrin α2β1的抗體或反義寡核苷酸消耗掉Integrin α2β1后,可以顯著降低破骨細(xì)胞的骨吸收能力[23]。Talin 1(TLN1)是一種相對(duì)分子質(zhì)量是270 kDa的細(xì)胞溶質(zhì)吸附蛋白質(zhì),可以連接肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架與整合素蛋白進(jìn)而調(diào)控生物過(guò)程。在小鼠模型中,通過(guò)抑制Talin 1蛋白質(zhì)的表達(dá),可以增強(qiáng)破骨細(xì)胞對(duì)骨組織的吸收,進(jìn)而導(dǎo)致骨量的下降[24]。這表明Talin 1可以抑制破骨細(xì)胞對(duì)骨組織的吸收,該蛋白質(zhì)的研究對(duì)今后骨質(zhì)疏松的診斷和治療具有重要作用。人凝溶膠蛋白(gelsolin,GSN)是凝溶膠蛋白質(zhì)家族的一種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白質(zhì),與破骨細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程和功能發(fā)揮有著密切聯(lián)系[25]。已有研究[26]顯示,Gelsolin蛋白在破骨細(xì)胞中足體和肌動(dòng)蛋白環(huán)的生成過(guò)程起重要作用,進(jìn)而對(duì)破骨細(xì)胞骨吸收能力產(chǎn)生影響,引起骨量的變化,有望作為骨質(zhì)疏松癥診斷的潛在標(biāo)志物。此外,許多蛋白質(zhì)在正常對(duì)照組、骨量減少組和骨質(zhì)疏松組中呈現(xiàn)顯著的變化趨勢(shì),或者持續(xù)下調(diào),或者先上調(diào)再下調(diào),如圖5所示。這些蛋白質(zhì)與骨量流失的相關(guān)性目前尚未見(jiàn)到文獻(xiàn)報(bào)道,對(duì)這些重要蛋白質(zhì)的研究有望為研究骨量流失疾病找到新的方向。

圖4 外泌體蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析Fig.4 Bioinformatics analysis of identified exosomes proteins a.Venn diagram of proteins in the normal,osteopenia,and osteoporosis groups.b.Differentially expressed proteins in the normal,osteopenia,and osteoporosis groups.N:normal;OA:osteopenia;OS:osteoporosis.c.Top 10 pathways enriched by IPA from the proteins that differentially expressed between the osteoporosis and normal groups.d.Protein-protein interaction analysis of 17 candidates.Protein names are the same as those in Table 2.

表2 骨量減少組和骨質(zhì)疏松組中變化顯著的17個(gè)候選蛋白質(zhì)Table2 Seventeen candidates significantly dysregulated in the osteoporosis and osteopenia groups

Nor:normal.

圖5 候選蛋白質(zhì)在不同組別的表達(dá)趨勢(shì)Fig.5 Protein expression trend in different groups a.Resistin,ferritin light chain,and histone H2B type 1-C/E/F/G/I.b.Fibrinogen alpha,gamma,and beta chains.iBAQ:intensity-based absolute quantification.c.Volcano plots from MaxQuant quantitative analysis of exosomes in the osteoporosis and normal groups.Red dot:significantly up-regulated proteins (p<0.05,fold change>2);green dot:significantly down-regulated proteins (p<0.05,fold change<0.5);black dot:no significant difference.FC:fold change.

3 結(jié)論

本文對(duì)血清外泌體進(jìn)行了分離分析和表征,對(duì)血清外泌體蛋白質(zhì)組進(jìn)行了研究,并應(yīng)用于骨質(zhì)疏松癥研究。通過(guò)定量比較正常對(duì)照組、骨量減少組和骨質(zhì)疏松組在外泌體蛋白質(zhì)表達(dá)上的差異,發(fā)現(xiàn)了與骨量流失相關(guān)的蛋白質(zhì)與人體骨平衡和骨細(xì)胞的功能密切相關(guān),雖然這些蛋白質(zhì)有待進(jìn)一步驗(yàn)證,但本研究提示血清外泌體蛋白質(zhì)組有望作為骨質(zhì)疏松癥診斷和治療的靶標(biāo)。