顏 敏,劉 靜,夏 天,許國旺,樸海龍*

(1.中國科學院大連化學物理研究所,中國科學院分離分析重點實驗室,遼寧 大連 116023;2.中國科學院大學,北京 100049)

世界范圍內(nèi),前列腺癌是發(fā)病率第二、死亡率第五的男性癌癥[1]。近期的流行病學統(tǒng)計發(fā)現(xiàn),在中國,前列腺癌發(fā)病率正在逐年提高[2],并具有低齡化趨勢[3]。代謝紊亂是前列腺癌特征之一。正常前列腺組織中含有高濃度的鋅,可通過抑制烏頭酸酶使檸檬酸氧化受阻,導致檸檬酸濃度升高[4]。在轉(zhuǎn)變?yōu)榍傲邢侔┖?組織中鋅濃度降低,三羧酸(TCA)循環(huán)得到恢復,因此可產(chǎn)生更多ATP促進癌細胞增殖[5]。另外,脂代謝紊亂也是前列腺癌的一個重要特征。研究發(fā)現(xiàn),同源性磷酸酶-張力蛋白(PTEN)缺失的前列腺癌中膽固醇酯含量增加,并能夠促進前列腺癌侵襲和增殖[6]。因此,代謝紊亂已成為前列腺癌新的研究趨勢。

在前列腺癌中,散斑型BTB/POZ蛋白(SPOP)是突變頻率最高的蛋白之一,6%～15%的前列腺癌患者攜帶SPOP突變[7]。SPOP是一種E3泛素化連接酶,可以介導底物蛋白質(zhì)發(fā)生泛素化降解[8]。已知SPOP底物雄激素受體(AR)、DEK-原癌基因和ETS轉(zhuǎn)錄因子(ERG)等均為代謝相關重要因子[9-11]。因此,推斷SPOP突變與前列腺癌代謝紊亂高度相關。在之前的研究中,本課題組[12]通過對SPOP突變前列腺癌和癌旁組織進行代謝組學分析后發(fā)現(xiàn),SPOP突變可促進TCA循環(huán)和脂肪酸代謝中多個基因和代謝物表達量增加。但是,還沒有基于整合組學對SPOP調(diào)控的代謝通路進行深層次分子機制研究。

代謝組學是研究生物體內(nèi)代謝物變化規(guī)律的一門新興技術,已被用來研究多種疾病機制[13]。其中,基于細胞的代謝組學分析主要用來研究藥物及基因引起的代謝重編程[14,15]。蛋白質(zhì)組學是研究生物體內(nèi)大分子蛋白質(zhì)變化規(guī)律的技術[16]。在本研究中,利用LNCaP對照組細胞(LNCaP CON)、LNCaP SPOP野生型過表達細胞(SPOP_WT)、LNCaP SPOP Y87N突變體過表達細胞(SPOP_Y87N)和F133L突變體過表達細胞(SPOP_F133L),進行代謝組學及蛋白質(zhì)組學分析。研究了SPOP突變調(diào)控的代謝物、代謝酶及代謝通路,并在Du145 SPOP敲除細胞系中進行了驗證。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

使用GCMS-QP 2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津)進行代謝組學分析。使用DGU-20A5液相色譜堿性-pH RPLC(日本島津)進行肽段分離。使用ultra-HPLC EASY-nLC 1000系統(tǒng)連接Q Exactive質(zhì)譜(美國Thermo Fisher Scientific)進行蛋白質(zhì)組學分析。使用Fusion Fx化學發(fā)光儀(法國VILBER)進行蛋白免疫印跡(western blot)分析。

超純水來自于Milli-Q水純化系統(tǒng)(美國Millipore)。純乙腈和純甲醇購自德國Merck公司。甲氧胺鹽酸鹽(純度≥98%)、吡啶(純度≥99.9%)、二氯甲烷(純度≥99.8%)、N-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺(MSTFA,純度≥98.5%)、十三酸(純度≥98%)、二硫蘇糖醇(DTT,純度≥99%)、碘乙酰胺(IAA,純度≥99%)、尿素(純度≥99.5%)、28%(質(zhì)量分數(shù))氨水、甲酸(純度≥96%)和乙酸銨(純度≥98%)購自美國西格瑪奧德里奇公司。Tris-Cl(純度≥99.9%)、EDTA(純度≥99.5%)、5%(體積分數(shù))Nonidet P-40(NP-40)水溶液、脫氧膽酸(純度≥99%)和5%(體積分數(shù))Triton水溶液均購自中國索萊寶公司。NaCl(純度≥99.5%)和甘油(純度≥99%)購自中國科密歐公司。RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖溶液(PBS)、殺稻瘟菌素(10 g/L)、嘌呤霉素(10 g/L)、雙抗(10 000單位青霉素/mL和10 000 μg鏈霉素/mL)、細胞轉(zhuǎn)染試劑、上樣緩沖溶液和串列質(zhì)量標簽(tandem mass tag,TMT)均購自美國Thermo Fisher Scientific公司。胎牛血清購自德國Serana公司。10 cm培養(yǎng)皿購自美國Corning公司。聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購自美國Bio-Rad公司。蛋白酶和磷酸化抑制劑購自美國InvivoGen公司。

放射免疫沉淀測定(radio-immunoprecipitation assay,RIPA)裂解液由實驗室自配,包含50 mmol/L pH7.4的Tris-Cl、150 mmol/L NaCl、1 mmol/L pH8的EDTA、1%(體積分數(shù),下同)NP-40、0.125%脫氧膽酸、10%甘油、1% Triton和1%蛋白酶和磷酸化抑制劑,并用純水補齊。兔抗人SPOP多抗(16750-1-AP,1∶1 000,v/v)和兔抗人Flag多抗(20543-1-AP,1∶1 000,v/v)購自美國Proteintech公司,鼠抗人Vinculin單抗(V4505,1∶2 000,v/v)購自美國西格瑪奧德里奇公司。

SPOP_WT和突變型(Y87N和F133L)質(zhì)粒分別由中國科學院北京基因組研究所劉江教授和復旦大學王陳繼教授贈予。將其克隆到帶有3×Flag標簽的pLOC-RFP載體上,質(zhì)粒酶切位點為Not I和Nhe I。通過BsmBI酶切位點將SPOP CRISPR/Cas9插入序列克隆到lentiCRISPRv2載體上。SPOP CRISPR/Cas9插入序列分別為sgSPOP1:CCAGTAACAGGTAAAGTGAC;sgSPOP2:GGTTT GTGCAAGGCAAAGAC;sgSPOP3:CAAGCTTACC CTCTTCTGCG。

1.2 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

LNCaP和Du145細胞均培養(yǎng)在含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基中。HEK293T細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基中。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染是通過在HEK293T細胞中包慢病毒對癌細胞進行感染的方法進行的。LNCaP CON(pLOC-RFP空載體)、SPOP_WT、SPOP_Y87N、SPOP_F133L慢病毒包裝好后,經(jīng)0.22 μm濾器過濾,加入LNCaP細胞,感染24 h。72 h后,用殺稻瘟菌素進行篩選。sgControl、sgSPOP1、sgSPOP2、sgSPOP3慢病毒包裝好后,經(jīng)0.22 μm濾器過濾,加入Du145細胞感染24 h。72 h后,通過嘌呤霉素進行篩選。

1.3 Western blot分析

加入RIPA裂解液進行細胞裂解。于4 ℃以12 000 r/min的速度離心15 min,取上清,加入上樣緩沖溶液變性。等量的蛋白質(zhì)通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。一抗4 ℃孵育過夜,二抗室溫孵育1 h后,通過化學發(fā)光試劑進行條帶檢測。

1.4 細胞代謝物提取及衍生

10 cm細胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)細胞達到80%時,抽走培養(yǎng)液,用4 ℃的PBS沖洗2次。加入1 mL含10 mg/L十三酸的甲醇-水(4∶1,v/v)溶液,將細胞刮下至Eppendorf(EP)管中,充分渦旋。于4 ℃以14 258 r/min的速度離心15 min,取上清,混合每種樣品得到質(zhì)量控制樣本,凍干。

采用兩步法對凍干的樣本進行硅烷化衍生。首先,在每個樣品中加入50 μL甲氧胺吡啶溶液(20 g/L),于37 ℃反應1.5 h。然后,在每個樣品中加入40 μL MSTFA,于37 ℃反應1 h后,于4 ℃以13 273 r/min的速度離心15 min,取上清進樣。

1.5 代謝組學分析

GC-MS代謝組學分析條件和文獻[17]所述相同,只稍作改變。簡單來講,樣品通過30 m×250 μm×0.25 μm DB-5 MS毛細管柱(美國J&W Scientific)進行分離。初始柱溫為70 ℃,保持3 min,以5 ℃/min的速率升至300 ℃,保持10 min。采用電子轟擊電離源,溫度為230 ℃,采用70 eV電離模式。通過ChromaTOF 4.43軟件(美國LECO)進行解卷積、峰檢測,并結(jié)合數(shù)據(jù)庫及組內(nèi)標樣進行代謝物定性。通過GCMS solution軟件(日本島津)進行定量分析,得到原始代謝物峰表。

1.6 蛋白質(zhì)組學分析

細胞重懸到8 mol/L的尿素中,超聲破碎。定量后,于56 ℃下和DTT孵育1 h,打開二硫鍵,在暗室中與IAA反應40 min,進行烷基化。用50 mmol/L pH 8.0 PBS將體系中的尿素稀釋到1 mol/L,并按照質(zhì)量比1∶50(酶:蛋白)的比例加入胰酶,于37 ℃過夜孵育并除鹽。LNCaP CON、SPOP_WT、SPOP_Y87N和SPOP_F133L樣品分別用TMT進行標記。將TMT試劑溶解在41 μL的無水乙腈中,加入50 μg的肽段。室溫孵育1 h后,加入8 μL 5%氨水淬滅,孵育15 min。等質(zhì)量混合LNCaP CON、SPOP_WT、SPOP_Y87N和SPOP_F133L樣品。

通過DGU-20A5液相色譜堿性-pH RPLC進行肽段分離。使用緩沖液A(pH 10,含2%乙腈、98%水、10 mmol/L乙酸銨)和緩沖液B(pH 10,含80%乙腈、20%水、10 mmol/L乙酸銨)在自制的C18柱上以0.5 mL/min的流速梯度洗脫。梯度為:0.01～57.00 min,6.25%B～43.75%B;57.00～60.00 min,43.75%B～100%B。將肽段分離為60個組分,按照1+13+25+37+49、2+14+26+38+50、……、12+24+36+48+60的順序分別合并各組分,得到12個樣本。凍干后用含0.1%甲酸的水復溶。

接下來,進行LC-MS/MS蛋白質(zhì)組學分析。樣本在自制的C18柱(150 mm×150 μm,1.9 μm)上分離。緩沖液A為含0.1%甲酸的乙腈-水(2∶98,v/v);緩沖液B為含0.1%甲酸的乙腈-水(98∶2,v/v)。流動相流速為600 nL/min。梯度洗脫程序為:0～45 min,5%B～25%B;45～65 min,25%B～40%B;65～70 min,40%B～80%B。通過數(shù)據(jù)依賴模式,在Orbitrap全掃描模式、70 000分辨率條件下,從m/z300到1 800進行掃描。自動增益控制目標設定為3×106離子容量,最大注入時間設定為60 ms。二級碎片采集分辨率為17 500。

1.7 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

通過內(nèi)標峰面積和蛋白質(zhì)干重對代謝組學數(shù)據(jù)校正后進行分析。通過(代謝物峰面積-均值)/標準差進行歸一化,并通過MeV 4.8.1軟件進行熱圖可視化。通過SIMCA-P 11.0軟件(瑞典Umetrics)進行偏最小二乘判別分析(PLS-DA),統(tǒng)計主成分1上變量重要性投影(variable importance for the projection,VIP)值大于1的代謝物。通過單因素方差分析進行3組及3組以上的比較,通過T檢驗進行兩組間的比較。通過在線軟件MetaboAnalyst 3.0[18]和KOBAS 3.0[19]分別進行差異代謝物和差異蛋白通路富集分析。通過GraphPad Prism 5軟件繪制柱狀圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 SPOP突變對前列腺癌LNCaP細胞代謝的影響

構(gòu)建了LNCaP CON、SPOP_WT、SPOP_Y87N和SPOP_F133L 4種細胞系。Y87N和F133L突變位點位于SPOP底物結(jié)合域,為前列腺癌病人中最常見的突變[7]。Western blot分析(見圖1)發(fā)現(xiàn),SPOP_WT、SPOP_Y87N和SPOP_F133L細胞中SPOP表達上調(diào),說明高表達細胞系構(gòu)建成功。

圖1 Western blot分析LNCaP對照組(LNCaP CON)、LNCaP散斑型BTB/POZ蛋白(SPOP)野生型過表達(SPOP_WT)、LNCaP SPOP Y87N突變體過表達(SPOP_Y87N)和F133L突變體過表達(SPOP_F133L)細胞 Fig.1 Western blot analysis of LNCaP control cells(LNCaP CON),speckle type BTB/POZ protein(SPOP)_WT over expressed LNCaP(SPOP_WT)cells,SPOP_Y87N mutation over expressed LNCaP(SPOP_Y87N)cells,and SPOP_F133L mutation over expressed LNCaP(SPOP_F133L)cells Vinculin was used as a loading control.CON:LNCaP CON;WT:SPOP_WT;Y87N:SPOP_Y87N;F133L:SPOP_F133L.

分析LNCaP CON、SPOP_WT、SPOP_Y87N和SPOP_F133L 4種細胞代謝組學變化情況,發(fā)現(xiàn)多種代謝物(如氨基酸和有機酸等)在轉(zhuǎn)入SPOP_WT及SPOP突變體質(zhì)粒后發(fā)生了變化(見圖2)。PLS-DA分析(見圖3)發(fā)現(xiàn),代表解釋能力的模型解釋的X變量變化分數(shù)R2X=0.512,范圍≤1;模型解釋的Y變量變化分數(shù)R2Y=0.616,范圍≤1;代表模型預測能力的Q2=0.475,范圍≤1。說明該模型具有較好的解釋和預測能力。其中,SPOP_Y87N、SPOP_F133L與SPOP_WT分組明顯。所有代謝物在主成分1上VIP值的變化見圖4,共有36種代謝物的VIP值大于1。通過MetaboAnalyst 3.0軟件進行代謝通路分析,結(jié)果顯示氨?；?tRNA生物合成、氮代謝、TCA循環(huán)以及多種氨基酸代謝通路發(fā)生明顯變化(見圖5a)。

接下來,對這36種代謝物進一步通過單因素方差分析,結(jié)合Tukey’s Multiple Comparison事后檢驗的方式進行比較,通過韋恩圖可以看出共有2種代謝物在SPOP_WT、SPOP_Y87N、SPOP_F133L與LNCaP CON細胞的比較中均有顯著性差異(見圖5b)。通過柱狀圖分析(見圖6)發(fā)現(xiàn),天冬氨酸的量在SPOP_WT細胞中顯著降低,在SPOP_Y87N和SPOP_F133L細胞中顯著上升。天冬酰胺的量在SPOP_WT細胞中顯著降低。另外,TCA循環(huán)中間代謝產(chǎn)物檸檬酸、富馬酸和蘋果酸的量也在SPOP_WT細胞中顯著降低。由此可以推測SPOP突變可促進TCA循環(huán)。

圖2 熱圖分析LNCaP CON、SPOP_WT、SPOP_Y87N和SPOP_F133L細胞發(fā)生的代謝物變化(n=4)Fig.2 Heatmap visualization of the changes in allmetabolites of LNCaP CON,SPOP_WT,SPOP_Y87N,and SPOP_F133L cells(n=4) DHA:docosahexenoic acid.

圖3 偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)LNCaP CON、SPOP_WT、SPOP_Y87N和SPOP_F133L細胞Fig.3 Partial least squares-discrimination analysis(PLS-DA)of LNCaP CON,SPOP_WT,SPOP_Y87N,and SPOP_F133L cells a.PLS-DA score plot of LNCaP CON,SPOP_WT,SPOP_Y87N,and SPOP_F133L cells.b.PLS-DA validation plot of LNCaP CON,SPOP_WT,SPOP_Y87N,and SPOP_F133L cells.Q2 indicates predictive ability and R2 indicates explanation ability.The intercepts of Q2 and R2 are -0.214 and 0.258,respectively.

圖4 變量重要性投影值分布圖Fig.4 Distribution plot of variable importance for the projection(VIP)value

圖5 SPOP突變對LNCaP細胞中代謝通路的影響Fig.5 Effects of SPOP mutation on the metabolic pathways in LNCaP cells a.MetaboAnalyst analysis of metabolic pathways by 36 altered metabolites (VIP value>1).b.Venn diagram of differential metabolites in SPOP_WT,SPOP_Y87N and SPOP_F133L cells by one-way analysis of variance (ANOVA).

圖6 LNCaP CON、SPOP_WT、SPOP_Y87N和SPOP_F133L細胞中天冬氨酸、天冬酰胺、富馬酸、蘋果酸和檸檬酸的變化(n=4)Fig.6 Changes in aspartic acid,asparagine,fumaricacid,malic acid and citric acid in LNCaP CON,SPOP_WT,SPOP_ Y87N,and SPOP_F133L cells(n=4) * p<0.05;** p<0.01;*** p<0.001.Data were expressed as mean±SD.

2.2 蛋白質(zhì)組學分析SPOP突變調(diào)控的生物大分子

通過蛋白質(zhì)組學發(fā)現(xiàn),相比SPOP_WT細胞,SPOP_Y87N和SPOP_F133L細胞中分別有1 352和2 014個蛋白質(zhì)表達發(fā)生變化,其中909個蛋白質(zhì)在兩組比較中都具有顯著性差異(p<0.01,見圖7)。通過KOBAS 3.0軟件對909個差異蛋白質(zhì)進行通路分析,發(fā)現(xiàn)碳代謝、脂肪酸代謝、tRNA生物合成、脂肪酸降解、糖酵解/糖異生、氧化磷酸化、丙酮酸代謝、TCA循環(huán)以及磷酸戊糖途徑等代謝通路發(fā)生明顯變化(見圖7)。

圖7 蛋白質(zhì)組學分析SPOP_WT、SPOP_Y87N和SPOP_F133L細胞系(n=3)Fig.7 Proteomics analysis of SPOP_WT,SPOP_Y87N,and SPOP_F133L cells(n=3) Venn diagram of differential proteins in LNCaP SPOP_Y87N and SPOP_F133L cells (up).KOBAS pathway analysis results of the 909 differential proteins (bottom).

接下來,統(tǒng)計了代謝組學和蛋白質(zhì)組學通路富集分析后共同發(fā)生變化的通路。發(fā)現(xiàn)氨?；?tRNA生物合成和TCA循環(huán)在兩種組學分析中均發(fā)生變化(見圖8a)。進一步對碳代謝相關通路進行代謝物和蛋白質(zhì)整合分析。其中,糖酵解通路相關蛋白質(zhì)HK1、GPI、PFKP、PGK1、ENO1、PKM、DLAT、PDHB表達量在SPOP_Y87N和SPOP_F133L細胞中顯著增加,ALDOA表達量顯著降低(見圖8b)。TCA循環(huán)中ME2、MDH2、ACO2、IDH1、IDH2、IDH3G、GLUD1表達量顯著增加,而SUCLG1表達量顯著降低(圖8b)。另外,纈氨酸、亮氨酸及異亮氨酸代謝通路中的BCAT2、BCKDHB、ACADSB及PCCB表達量也在SPOP_Y87N和SPOP_F133L細胞中顯著增加(見圖8b)。纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解后可以通過生成甲基丙二酰輔酶A,然后轉(zhuǎn)變?yōu)殓K酰輔酶A進入TCA循環(huán)進行回補。代謝組學結(jié)果表明,纈氨酸的量在SPOP_Y87N和SPOP_F133L細胞中降低,推測其可能降解進入TCA循環(huán)進行回補(見圖8b)。

圖8 整合代謝組學和蛋白質(zhì)組學分析代謝通路發(fā)生的變化Fig.8 Analysis of the altered metabolic pathways by integration of metabolomics and proteomics a.Venn diagram of the changed metabolic pathways in metabolomics and proteomics analysis.b.Changes in metabolites and proteins in carbon metabolic pathway.Green,black,blue and red indicated undetected,unchanged,down-regulated and up-regulated metabolites or proteins in LNCaP SPOP_Y87N,and LNCaP SPOP_F133L cells compared to LNCaP SPOP_WT cells,respectively.Italics indicate proteins.HK1:hexokinase 1;GPI:glucose-6-phosphate isomerase;PFKP:phosphofructokinase,platelet;PGK1:phosphoglycerate kinase 1;ENO1:enolase 1;ALDOA:fructose-bisphosphate aldolase;PGLS:6-phosphogluconolactonase;PGD:phosphogluconate dehydrogenase;PKM:pyruvate kinase M1/2;DLAT:dihydrolipoamide S-acetyltransferase;PDHB:pyruvate dehydrogenase E1 beta subunit;SUCLG1:succinate-CoA ligase alpha subunit;ME2:malic enzyme 2;MDH2:malate dehydrogenase 2;ACO2:aconitase 2;IDH1:isocitrate dehydrogenase (NADP(+))1,cytosolic;IDH2:isocitrate dehydrogenase (NADP(+))2,mitochondrial;IDH3G:isocitrate dehydrogenase 3 (NAD(+))gamma;GLUD1:glutamate dehydrogenase 1;BCAT2:branched chain amino acid transaminase 2;BCKDHB:branched chain keto acid dehydrogenase E1 subunit beta;ACADSB:acyl-CoA dehydrogenase short/branched chain;PCCB:propionyl-CoA carboxylase subunit beta.

2.3 驗證SPOP調(diào)控的代謝通路

利用CRISPR/Cas9基因編輯技術構(gòu)建了3種SPOP敲除的前列腺癌Du145細胞系,其中sgSPOP1和sgSPOP3序列可有效地降低SPOP蛋白的表達量(見圖9a)。因此,對Du145 sgControl、sgSPOP1、sgSPOP3細胞進行了代謝組學分析。敲除SPOP后,代謝輪廓發(fā)生了明顯的變化,SPOP敲除后的樣品可以和未敲除的樣品得到很好的區(qū)分(見圖9b)。分別有24和22個差異代謝物量在sgSPOP1和sgSPOP3細胞中顯著性增加(見圖9c)。其中,乳酸、2-酮戊二酸、檸檬酸、富馬酸、蘋果酸、丙氨酸、天冬酰胺和O-磷酸-蘇氨酸8種代謝物在Du145 sgSPOP1和sgSPOP3細胞中含量均增加(見圖9d)。其中,檸檬酸、富馬酸、蘋果酸和天冬酰胺的變化趨勢與LNCaP細胞中結(jié)果一致。因此,證明了SPOP可引起這些代謝物變化。

2.4 SPOP突變調(diào)控代謝通路的機理推測

轉(zhuǎn)錄和代謝組學分析發(fā)現(xiàn)人前列腺癌中TCA循環(huán)激活[20]。其中,富馬酸和蘋果酸與Gleason得分、腫瘤分期以及多種基因的表達相關[20]。并且,根據(jù)本課題組[12]在人前列腺癌組織中對SPOP突變的研究發(fā)現(xiàn),富馬酸和蘋果酸在SPOP突變的癌組織中含量顯著增加。細胞代謝組學結(jié)果驗證了人組織中的結(jié)果。在SPOP突變型LNCaP細胞以及SPOP敲除Du145細胞中富馬酸及蘋果酸含量顯著增加。證明,SPOP突變與前列腺癌中富馬酸和蘋果酸量的增加相關。并且,已知富馬酸是一種癌代謝物[21]。因此,SPOP突變可通過累積富馬酸,促進前列腺癌發(fā)展。

圖9 Du145 SPOP敲除細胞系驗證代謝變化Fig.9 Validation of metabolite alterations in Du145 SPOP knock-out cells a.Western blot analysis of SPOP expression in Du145 sgControl,sgSPOP1,sgSPOP2,and sgSPOP3 cells,wherein vinculin was used as a loading control.b.PLS-DA score plot of Du145 SPOP knock-out cells.c.Venn diagram analysis of increased metabolites in sgSPOP1 and sgSPOP3 cells.(p<0.05 and fold change>1.5).d.Heatmap visualization of commonly increased metabolites in sgSPOP1 and sgSPOP3 cells (n=5).

另外,在乳腺癌中天冬酰胺合成酶的表達量被發(fā)現(xiàn)與癌癥的惡性程度相關。飲食中增加天冬酰胺可促進乳腺癌惡性發(fā)展[22]。發(fā)現(xiàn)在SPOP_WT細胞中,天冬酰胺的量降低;在SPOP敲除的Du145細胞中,天冬酰胺的量增加。因此,SPOP突變可能通過增加天冬酰胺的量來促進前列腺癌的惡性發(fā)展。

根據(jù)“瓦博格效應”,腫瘤細胞傾向于利用有氧糖酵解進行供能[23]。在前列腺癌中,糖酵解過程加強被認為和腫瘤進展及預后相關[24]。本試驗發(fā)現(xiàn)在SPOP_Y87N和SPOP_F133L細胞中多種糖酵解相關的酶(如HK1和PFKP)含量增加,并且在Du145 SPOP敲除的細胞中,乳酸含量增加。因此,SPOP突變可能通過增加糖酵解過程促進前列腺癌發(fā)展。

3 結(jié)論

本研究通過基于GC-MS的細胞代謝組學分析了前列腺癌高頻突變蛋白SPOP對代謝物的影響。研究結(jié)果表明,在LNCaP細胞中過表達SPOP可減少富馬酸、蘋果酸、檸檬酸和天冬酰胺的量。同時,通過蛋白質(zhì)組學分析發(fā)現(xiàn)糖酵解和TCA循環(huán)中多種代謝酶含量在SPOP_Y87N和SPOP_F133L細胞中都增加。因此,可推測SPOP突變可以通過上調(diào)TCA循環(huán)來促進腫瘤發(fā)展。在Du145細胞中,驗證了富馬酸、蘋果酸、檸檬酸和天冬酰胺在SPOP敲除后含量增加,再次證明了SPOP對這些代謝物具有調(diào)控作用。