黃超囡,李 云,彭俊鈺,陳吉平*

(1.中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所,中國科學(xué)院分離分析化學(xué)重點實驗室,遼寧 大連 116023;2.中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049)

鄰苯二甲酸酯(phthalates,PAEs)是一類大量生產(chǎn)的化工產(chǎn)品,作為添加劑被廣泛應(yīng)用于服裝、涂料、包裝材料、醫(yī)療器械、兒童玩具、個人護(hù)理品、聚氯乙烯地板、墻紙和電子電纜絕緣材料中,其目的主要是為了增加材料的可塑性和柔韌性[1]。PAEs在工業(yè)產(chǎn)品中的添加量高達(dá)30%～50%,且這些PAEs與高聚物之間不是以共價鍵形式結(jié)合,故在生產(chǎn)、運輸、使用以及廢棄過程中都會逐漸釋放到環(huán)境中。鄰苯二甲酸二(乙基己基)酯(di(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP)是產(chǎn)量最大的一種PAEs化合物,在歐洲和中國分別占到PAEs總量的三分之一和80%,鄰苯二甲酸二正丁酯(di-n-butyl phthalate,DnBP)是全球應(yīng)用最廣的PAEs化合物。

圖1 PAEs的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of phthalates(PAEs)

表1 幾種常見PAEs的物理化學(xué)性質(zhì)Table1 Physical and chemical properties of some PAEs

Abbr.:abbreviation;* 25 ℃;Sw:water solubility;Kow:octanol-water partition coefficient;Koa:octanol-air partition coefficient;Kaw:air-water partition coefficient;Vp:vapor pressure.

PAEs的結(jié)構(gòu)如圖1所示,其中R和R′是兩個碳原子數(shù)相同或不同的烷基。在常溫下PAEs是黏稠液體,難溶于水,易溶于有機溶劑,幾種常見PAEs的物理化學(xué)性質(zhì)見表1[2,3]。由于PAEs烷基側(cè)鏈的碳原子數(shù)不同,PAEs具有很寬的蒸氣壓(Vp)、辛醇-水分配系數(shù)(Kow)、辛醇-空氣分配系數(shù)(Koa)和空氣-水分配系數(shù)(Kaw)范圍。這些物理化學(xué)性質(zhì)決定了不同種類PAEs在環(huán)境中的分布情況,短鏈PAEs如鄰苯二甲酸二甲酯(dimethyl phthalate,DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(diethyl phthalate,DEP)、DnBP在水、空氣中的濃度比較高,而長鏈PAEs如DEHP、鄰苯二甲酸二正辛酯(di-n-octyl phthalate,DnOP)、鄰苯二甲酸二異壬酯(diisononyl phthalate,DiNP)、鄰苯二甲酸二異癸酯(diisodecyl phthalate,DiDP)易于吸附在灰塵、污泥、土壤及水體懸浮顆粒物中[3-5]。故PAEs普遍存在于包括灰塵、大氣氣溶膠、污泥、污水、河水、海水、飲用水和空氣等各類環(huán)境介質(zhì)中[6-8]。

大量研究表明,PAEs是一類內(nèi)分泌干擾物,會引起生殖能力受損并對后代生殖發(fā)育產(chǎn)生影響。PAEs不僅能夠通過重新編程改變胎盤和胎兒的表觀遺傳信息而影響子代,而且能夠降低男性生殖激素水平、降低精子質(zhì)量、造成精子中DNA損傷、減小男嬰生殖器與肛門之間的距離以及降低男性特征等[9,10]。此外,PAEs還能導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)疾病和神經(jīng)系統(tǒng)的損害[11,12],而且可能與糖尿病、兒童肥胖癥和乳腺癌等多種現(xiàn)代疾病相關(guān)[13-15]。新生兒和兒童的飲食方式、手口動作、接觸地面和玩具等行為和生活習(xí)慣,導(dǎo)致他們暴露于PAEs的量明顯高于成人,所以PAEs對新生兒和兒童的健康影響更大[16,17]。

近年來,由于PAEs在環(huán)境中的普遍存在及對人體健康的嚴(yán)重危害,對人體暴露水平的評估受到了廣泛重視。本文以對人體PAEs暴露水平的評估為切入點,對人體尿液中PAEs生物標(biāo)志物的選擇和分析方法的最新進(jìn)展進(jìn)行了回顧和總結(jié),并對其前景進(jìn)行了展望。

1 PAEs在人體中的代謝

PAEs可以通過飲食、呼吸和皮膚暴露等多種途徑進(jìn)入生物體,在生物體內(nèi)迅速代謝后,主要隨尿液排出體外[18]。PAEs在生物體內(nèi)的代謝途徑主要有兩種(見圖2)。短鏈PAEs進(jìn)入生物體后,其中一個酯鍵迅速水解,轉(zhuǎn)變?yōu)猷彵蕉姿釂熙?即初級代謝產(chǎn)物。有研究發(fā)現(xiàn),其初級代謝物鄰苯二甲酸單酯的生物活性更強,毒性更大,主要表現(xiàn)為“三致”毒性、胚胎發(fā)育毒性和生殖毒性[17,19]。長鏈PAEs水解為單酯后,還可以通過酶促氧化作用將鄰苯二甲酸單酯的烷基側(cè)鏈轉(zhuǎn)化為更親水的氧化產(chǎn)物,即次級代謝物[20]。鄰苯二甲酸單酯和次級代謝產(chǎn)物均可在尿苷-5′-二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶的催化作用下,生成葡萄糖醛酸結(jié)合物,以增加代謝物的親水性并促進(jìn)排出。PAEs的代謝途徑與其碳鏈長度密切相關(guān),當(dāng)側(cè)鏈上的碳原子數(shù)<8時,主要以鄰苯二甲酸單酯(M-1)和鄰苯二甲酸單酯-葡萄糖醛酸結(jié)合物(M-2)的形式排出體外,如DMP、DEP和DnBP等,半衰期為5～6 h。長鏈PAEs主要以次級代謝物(M-3)以及其與葡萄糖醛酸結(jié)合物(M-4)的形式排出,如DEHP、DiNP和DiDP,半衰期大約為12 h[21-23]。

圖2 PAEs的暴露及其在人體中的代謝途徑Fig.2 Exposure and metabolic pathway of PAEs in the human body

2 PAEs暴露的生物標(biāo)志物

生物標(biāo)志物是指示污染物危害效應(yīng)的生物信號,可衡量環(huán)境污染物的暴露與效應(yīng)。常用的生物標(biāo)志物包括母體化合物、鄰苯二甲酸單酯和次級代謝物[24,25]。相比于PAEs代謝物,母體化合物的測定通常存在3個缺點[26]:(1)PAEs類化合物在環(huán)境中普遍存在,采樣、前處理及檢測等過程極易受到污染,空白值較大;(2)由于酯酶/脂肪酶普遍存在于生物樣品中,很難避免PAEs水解的發(fā)生;(3)PAEs在生物體中的半衰期很短,被生物體吸收后很快會被代謝,導(dǎo)致其在尿液、血液等生物樣品中的濃度較低。所以,對PAEs的暴露評估一般不是測量母體化合物,而是代之以測量它特有的代謝物。

盡管PAEs代謝物在羊水、乳汁、唾液、精液、血液中均可檢測到[27,28],但這些生物樣品中都存在酯酶,能促進(jìn)外源性PAEs的水解,從而降低分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和精密度。人體尿液中不含酯酶,且尿液中的代謝物濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于血液,大約是10～100倍[29]。另外,血液樣品的采集范圍和采樣量有限,且成本較高,而尿液樣品具有取樣方便、無創(chuàng)傷且采樣量足等優(yōu)點。因此,尿液中的鄰苯二甲酸單酯和次級代謝物成為評估PAEs暴露水平的最佳生物標(biāo)志物。由于血液中代謝物濃度基本不受飲水量的影響,常常用于代謝動力學(xué)研究以獲得更加合理可靠的數(shù)據(jù)[30]。

3 樣品制備

PAEs代謝物在生物樣品中的濃度通常很低,多在ng/mL水平,且生物樣品基質(zhì)復(fù)雜,因此用儀器分析之前,需要進(jìn)行合理的樣品采集、保存、富集、凈化、濃縮等復(fù)雜的前處理過程。眾所周知,樣品制備是分析過程中的一個關(guān)鍵步驟,也是誤差的主要來源,且通常情況下費力多、耗時長、成本高、污染大[31]。PAEs代謝物分析的難點主要表現(xiàn)在以下兩個方面:一方面,復(fù)雜的生物樣品基質(zhì)對PAEs代謝物的準(zhǔn)確定性和定量造成了嚴(yán)重干擾,通常需要加入同位素內(nèi)標(biāo)來校正基質(zhì)干擾[32];另一方面,周圍環(huán)境和實驗試劑、材料等都含有PAEs母體化合物,這些母體化合物可能會因前處理過程不當(dāng)而引入并發(fā)生水解,造成外源性污染,影響代謝物分析的準(zhǔn)確性[33]。因此,樣品前處理過程的先進(jìn)與否,直接關(guān)系到PAEs生物標(biāo)志物分析方法的準(zhǔn)確性。由于樣品前處理過程的重要性,PAEs暴露生物樣品制備技術(shù)的研究一直是分析化學(xué)家關(guān)注的焦點。

尿液中PAEs代謝物主要有兩種形式:游離態(tài)和與葡萄糖醛酸結(jié)合的結(jié)合態(tài)。由于結(jié)合態(tài)的代謝物一方面很難直接測定,另一方面也很難獲得結(jié)合態(tài)化合物的標(biāo)準(zhǔn)品,因此需要先將結(jié)合態(tài)的代謝物轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x態(tài)后再進(jìn)行測定。美國疾病預(yù)防控制中心推薦的方法為:利用大腸桿菌所產(chǎn)生的β-葡萄糖醛酸酶將結(jié)合態(tài)水解成為游離態(tài),然后測定包括游離態(tài)和結(jié)合態(tài)的PAEs代謝物總量[26]。由于大腸桿菌的β-葡萄糖醛酸酶具有專一性,即只水解羧基和葡萄糖醛酸結(jié)合的酯基,而不水解鄰苯二甲酸與醇形成的酯基,從而避免了外源性PAEs水解而引入的干擾。而脂肪酶以及酸、堿等水解方法都不具有專一性,會使外源性PAEs水解從而造成污染,因此不推薦使用。目前通用的預(yù)處理條件是在尿液(pH值調(diào)至6.5～7.0)中加入一定量的β-葡萄糖醛酸酶,37 ℃下水解,然后加入甲酸、乙酸或氨水等調(diào)節(jié)溶液的pH以終止酶的水解反應(yīng)[34]。

直接稀釋進(jìn)樣分析法只能用于游離態(tài)PAEs代謝物的測定,該方法受尿液基質(zhì)干擾比較嚴(yán)重,且易造成分離柱堵塞,從而降低分離柱的壽命,通常只能用于PAEs代謝物的快速篩查[35]。為了對復(fù)雜樣品中的PAEs代謝物進(jìn)行準(zhǔn)確定性和定量分析,必須采用復(fù)雜的提取、凈化、富集等樣品前處理過程,通常包括液液萃取(liquid-liquid extraction,LLE)、固相萃取(solid phase extraction,SPE)等。

3.1 液液萃取

液液萃取是利用PAEs代謝物在有機相中的分配系數(shù)大于其在水相的分配系數(shù),使其從水相中轉(zhuǎn)移到有機相。為了提高萃取效率,通常需要先調(diào)節(jié)樣品pH值為2左右使PAEs代謝物質(zhì)子化,或者采用衍生化反應(yīng)使其疏水性增加,再用甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、己烷、甲苯、二氯甲烷等非極性有機溶劑進(jìn)行萃取。Kondo等[36]先用β-葡萄糖醛酸酶水解尿液中的結(jié)合態(tài)代謝物,然后用硫酸調(diào)節(jié)pH值為2.0并用正己烷提取。用氮氣將正己烷吹至近干后加入偶氮甲烷進(jìn)行衍生化反應(yīng),再用弗羅里硅土凈化,最后收集洗脫液,濃縮后使用GC-MS分析PAEs代謝物。Yoshida[37]將硫酸酯酶加入到尿液樣品中(pH值約為5)水解結(jié)合態(tài)的代謝物,然后用鹽酸調(diào)節(jié)pH值后用甲苯提取PAEs代謝物。將提取液濃縮后加入N-(叔丁基二甲基硅烷)-N-三氟乙酰胺進(jìn)行衍生化,最后用GC-MS進(jìn)行分析。

盡管液液萃取成本較低,但是樣品易乳化,凈化效果不佳,使用有機溶劑較多,而且,液液萃取后往往還需要對樣品進(jìn)行凈化,操作步驟繁瑣,費時費力,有逐漸被其他方法取代的趨勢。

3.2 固相萃取

由于可供選擇的吸附劑多種多樣,且具有消耗溶劑少、萃取效率高、凈化效果好、操作簡單、易于實現(xiàn)自動化、不出現(xiàn)乳化現(xiàn)象等優(yōu)點,固相萃取越來越廣泛地應(yīng)用于各種樣品的提取、凈化等前處理過程,已成為一種高效的PAEs代謝物的樣品制備技術(shù)。

3.2.1離線固相萃取(off-line SPE)

固相萃取吸附劑種類繁多,常見的有親水-疏水平衡(hydrophilic-lipophilic balance,HLB)吸附劑、反相/陰離子交換混合型吸附劑以及基于硅膠改性的C18吸附劑等。由于C18吸附劑主要依靠反相作用保留目標(biāo)分析物,導(dǎo)致其對極性較強的PAEs代謝物保留效果較差,回收率偏低,如鄰苯二甲酸單甲酯和鄰苯二甲酸單乙酯[38]。Chen等[39]采用200 mg C18固相萃取吸附劑萃取200 μL尿液中的5種鄰苯二甲酸單酯,采用1.5 mL去離子水淋洗,最后用1 mL乙腈洗脫鄰苯二甲酸單酯。結(jié)果表明:親水性較強的鄰苯二甲酸單甲酯和鄰苯二甲酸單乙酯的回收率較低,分別為69.8%和85.2%,而極性較弱的鄰苯二甲酸單丁酯、鄰苯二甲酸單芐酯和鄰苯二甲酸單乙基己基酯的回收率很好,為94.6%～105.3%。

HLB吸附劑是由親水單體N-乙烯基吡咯烷酮和親酯交聯(lián)劑二乙烯基苯聚合而成的大孔共聚物,具有較高而穩(wěn)定的回收率,對親水性差異很大的PAEs代謝物都具有很好的反相保留作用。Feng等[24]用氨水將水解后尿液的pH值調(diào)至堿性后加載至HLB(60 mg)小柱,并收集上樣溶液的流出液。將流出液的pH值調(diào)至2.0后,加載到另一HLB(60 mg)小柱,然后依次用3 mL NaH2PO4和5 mL去離子水淋洗,最后用2 mL乙腈和2 mL乙酸乙酯洗脫,結(jié)果表明17種PAEs代謝物的回收率為67%～109%。

反相/陰離子交換混合模式吸附劑同時提供反相和離子交換作用,既能滿足極性較強的PAEs代謝物,又兼顧帶有長鏈的非極性較強的PAEs代謝物。此外,由于PAEs代謝物含有羧基,可以通過調(diào)節(jié)樣品pH值使羧基電離而帶有負(fù)電荷,從而激活PAEs代謝物與反相/陰離子交換混合模式吸附劑之間的靜電相互作用,這樣就可以使用純甲醇、乙腈等高強度淋洗液去除盡可能多的僅通過反相作用保留的雜質(zhì),獲得明顯優(yōu)于HLB和C18吸附劑的凈化效果[40]。Zhang等[41]將酶解后的尿液加載至Oasis MAX固相萃取柱后,依次用3 mL去離子水和3 mL乙腈淋洗,最后用3 mL含2%(v/v)甲酸的乙腈/乙酸乙酯(1∶1,v/v)洗脫,加標(biāo)回收率為84%～122%,且凈化效果更佳。

在固相萃取基礎(chǔ)上發(fā)展起來的固相微萃取(solid phase microextraction,SPME)既保留了固相萃取的優(yōu)點,又克服了柱固相萃取樣品量大、吸附劑用量大、操作復(fù)雜等缺點。SPME集采樣、萃取、濃縮、進(jìn)樣于一體,整個過程幾乎不需要消耗有機溶劑,大大加快了分析檢測的速度。Alzaga等[42]將酶解后尿液的pH值調(diào)節(jié)至1.5,然后用涂覆有聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯的SPME纖維萃取PAEs代謝物。萃取完成后,將該SPME纖維直接插入重氮甲烷發(fā)生器中進(jìn)行衍生化反應(yīng),可以直接用GC-MS分析。另外,磁固相萃取也是一種新型固相萃取方法,具有裝置簡單,便于固液分離的優(yōu)點,Rastkari等[43]使用僅1 mg的磁性碳納米管材料富集凈化尿液中的5種PAEs代謝物,回收率高達(dá)92.6%～98.8%。

相比于液液萃取,固相萃取減少了有機溶劑的用量,且回收率高,凈化效果好。然而,利用離線固相萃取進(jìn)行PAEs代謝物分析時,通常上樣1～3 mL生物樣品,這就需要使用較多吸附劑(100～500 mg)和洗脫溶劑(2～5 mL),導(dǎo)致濃縮及溶劑置換過程費時費力,且可能造成目標(biāo)物損失和干擾,不適用于大批量樣品的前處理。

3.2.2在線固相萃取(on-line SPE)

在線固相萃取技術(shù)通常使用柱長5～20 mm、內(nèi)徑1～4.6 mm、填料粒徑5～30 μm的短柱,采用通道切換便可達(dá)到樣品制備與分離分析的偶聯(lián)。該技術(shù)集富集、凈化、分離和檢測于一體,使得生物樣品不需要經(jīng)過復(fù)雜的手動處理便可達(dá)到分析要求。通常情況下,在線固相萃取要求萃取填料對目標(biāo)分析物的保留能力比LC分離柱的保留能力稍弱或相當(dāng),這樣有利于將目標(biāo)物快速洗脫并在LC分離柱前端富集,從而實現(xiàn)“瞬時濃縮”進(jìn)樣。對于生物樣品中PAEs代謝物的分析,常用的在線固相萃取柱填料包括C18、反相聚合物材料、限進(jìn)材料(restricted access material,RAM)、整體柱材料等[44-46]。限進(jìn)材料具有獨特的結(jié)構(gòu),不僅填料的外表面鍵合了二醇基或甲基纖維素等各種親水性基團,利用分子尺寸排阻的分離原理,將生物樣品中的蛋白質(zhì)等大分子排出色譜柱,而且內(nèi)表面還鍵合了各種非極性基團,如苯基、C4、C8、C18等,各種小分子目標(biāo)物經(jīng)滲透進(jìn)入填料內(nèi)表面后能夠通過反相作用被保留[47]。與僅具有疏水保留作用的C18和普通聚合物材料相比,限進(jìn)材料在凈化和富集等方面具有更大的優(yōu)勢,更適用于生物樣品的在線前處理過程。Preuss等[48]采用基于反相限進(jìn)材料Lichrospher RP-8 ADS的在線固相萃取小柱(25 mm×4 mm,25 μm,Merck)與HPLC-MS/MS偶聯(lián)成功測定了尿液中DEHP的5種主要代謝物。

與填充柱相比,整體柱具有更好的多孔性和滲透性,具有傳質(zhì)速度快、壓力低、富集效率高等優(yōu)點。Kato等[49]將C18硅基整體柱(25 mm×4.6 mm,Chromolith Flash RP-18e,Merck)作為固相萃取介質(zhì),建立了人尿中16種PAEs代謝物的在線SPE-HPLC-MS/MS測定方法,且該固相萃取柱反復(fù)使用600次后未發(fā)現(xiàn)萃取效率降低的現(xiàn)象,使用壽命明顯優(yōu)于填充柱ALexa(25 mm×2.1 mm,30 μm,Varian)。

相對于傳統(tǒng)離線固相萃取方法,在線方法的自動化程度高,不需要濃縮溶劑和再溶解等步驟,這不僅有效避免了環(huán)境中外源性PAEs的干擾,提高了方法的準(zhǔn)確性和精密度,還縮短了樣品處理時間,很好地解決了離線固相萃取模式的弊端。而且在線固相萃取吸附劑更容易再生,節(jié)約了分析成本。此外,離線固相萃取往往需要較多的樣品量(約1～3 mL尿液),而在線固相萃取只需要很少的樣品量(約0.1 mL尿液),大大減少了洗脫溶劑的消耗。

4 定量分析方法

4.1 氣相色譜-質(zhì)譜分析方法

在各種分析技術(shù)中,GC-MS具有很好的檢測靈敏度和相對較低的運行成本,是痕量有機污染物分析的常用技術(shù)。由于PAEs代謝物極性強、揮發(fā)性低,用GC-MS方法進(jìn)行定性定量分析之前,為降低其在氣相色譜柱上的化學(xué)吸附并增加其揮發(fā)性,需要對PAEs代謝物進(jìn)行衍生化處理。常用的衍生化試劑有重氮甲烷[50]、三甲基氯硅烷[43]、N-(叔丁基二甲基硅)-N-甲基三氟乙酰胺[37]、N,O-雙三甲基硅基三氟乙酰胺(N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide,BSTFA)[51],且主要通過甲基衍生化、乙基衍生化或硅烷化對羧基進(jìn)行衍生化處理。由于這些衍生化反應(yīng)通常需要無水環(huán)境,所以PAEs代謝物的GC-MS分析通常與液液萃取、中空纖維液相微萃取等前處理方法相結(jié)合,而不太適用于固相萃取、在線固相萃取等有水參與的前處理過程。在PAEs代謝物的GC-MS分析方法中,常用的氣相色譜柱有DB-5MS、HP-Ultra 2、HP-5MS SV等,這些色譜柱的固定相主要是5%苯基-95%甲基聚硅氧烷,分析時的溫度范圍通常為70～310 ℃[25,51]。

表2列出了一些文獻(xiàn)報道的GC-MS分析方法,其中電子轟擊離子源(electron impact ionization,EI)是最常用的電離源,為了提高檢測靈敏度和重現(xiàn)性,避免樣品中其他組分的干擾,多采用選擇離子監(jiān)測模式(selected ion monitoring,SIM)。在SIM模式下,質(zhì)譜檢測器只檢測選定的特征離子,與全掃描模式相比,在相同的掃描周期內(nèi),SIM模式檢測每個離子的時間更多,檢測靈敏度提高了5～100倍,使得定量限(limit of quantification,LOQ)多達(dá)到ng/mL水平以下,這與生物樣品中PAEs及其代謝物的濃度基本匹配。Kim等[52]采用6 mL正己烷-乙醚(8∶2,v/v)提取2 mL尿液中的8種PAEs代謝物,濃縮、衍生化后用GC-MS分析,LOQ為0.1～0.5 ng/mL。相比常規(guī)GC-MS,氣相色譜-高分辨質(zhì)譜(gas chromatography-high resolution mass spectrometry,GC-HRMS)及氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜具有檢出限更低、抗干擾能力強和定性更準(zhǔn)確等優(yōu)點,也越來越多地應(yīng)用于PAEs生物標(biāo)志物的分析,尤其適用于一些長鏈PAEs同分異構(gòu)體代謝物的定量分析[20]。盡管GC-MS具有性能穩(wěn)定、重復(fù)性好、無離子抑制效應(yīng)等優(yōu)點,但存在衍生試劑毒性大、衍生化過程繁瑣耗時、需無水操作、分析時間長等不足,并不適合在大規(guī)模生物監(jiān)測中使用。

表2 文獻(xiàn)報道的人尿中PAEs代謝物的GC-MS分析方法Table2 GC-MS methods that have been described in literature for the analysis of phthalate metabolites in human urine

mPAEs:phthalate metabolites;ED:enzyme degradation;BSTFA:N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide;MCNTs:magnetic carbon nanotubes;LOD:limit of detection;LOQ:limit of quantification;Re:recoveries;MTBSTFA:N-methyl-N-(tert-butyldimethylsilyl)-trifluoroacetamide;HP-LPME:hollow fiber liquid-phase microextraction.

4.2 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法

LC-MS/MS結(jié)合了液相色譜有效分離熱不穩(wěn)定、難揮發(fā)極性化合物的分離能力和質(zhì)譜儀的高靈敏度優(yōu)勢,成為復(fù)雜樣品中痕量化合物分離分析的有效手段。目前,LC-MS/MS已經(jīng)成為生物樣品中PAEs代謝物檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法,可與多種前處理方法聯(lián)用,如液液萃取、磁固相萃取、手動固相萃取、固相微萃取等,而在線SPE-HPLC-MS/MS實現(xiàn)了集富集、凈化、分離、檢測于一體,極大地提高了分析速度,是目前最有前景的分析方法。該方法由美國疾病預(yù)防控制中心建立,并成功用于美國人體生物監(jiān)測項目。國內(nèi)曾建立了全自動固相萃取凈化后,LC-MS/MS測定人尿中10種PAEs代謝物的測定方法[34]。但因上述方法的固相萃取裝置在國內(nèi)普及率不高,導(dǎo)致方法推廣應(yīng)用時受到一定限制。

液相色譜柱的固定相材料種類繁多,為分離分析提供了多種選擇,但反相色譜柱依然占據(jù)絕對優(yōu)勢。PAEs代謝物分析常用的反相色譜柱有C18、苯基、苯基-己基柱等[48,55,56],其中苯基柱不僅提供疏水保留作用,還可以通過π-π作用對含有苯環(huán)的PAEs代謝物進(jìn)行選擇性保留,改善分離效果。Kato等[49]在各自的最佳條件下比較了Zorbax SB-CN、YMC ODS-AQ、Betasil Phenyl和Chromolith Performance RP-18e 4種不同類型色譜柱對尿液中16種PAEs代謝物的分離效果,盡管4種色譜柱都可以使鄰苯二甲酸單異丁酯與鄰苯二甲酸單正丁酯這對同分異構(gòu)體分離,但只有Betasil Phenyl能確保鄰苯二甲酸單(2-乙基-5-羥基己基)酯和鄰苯二甲酸單(2-乙基-5-酮基己基)酯的峰形良好。PAEs代謝物是一系列具有極性差異的羧基化合物,在中性或堿性條件下解離,導(dǎo)致疏水保留強度減弱。因此,在進(jìn)行液相色譜分離時,需要在流動相中加入適量酸(通常為0.1%(v/v)甲酸或乙酸水溶液)來抑制羧酸電離,這樣不僅增強了PAEs代謝物在色譜柱上的保留,而且基本消除了雜質(zhì)對早期流出的低相對分子質(zhì)量代謝物的干擾[57]。

大氣壓化學(xué)電離源(atmospheric pressure chemical ionization,APCI)和電噴霧電離源(electrospray ionization,ESI)是PAEs代謝物質(zhì)譜分析常用的兩種電離源。ESI負(fù)離子模式更適合強極性PAEs代謝物的電離,其離子化效率與靈敏度均高于APCI,故應(yīng)用更為普遍。但基質(zhì)效應(yīng)是ESI的一個主要瓶頸問題,因此,在分析之前必須對樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)膬艋幚?同時進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)評價,并利用同位素內(nèi)標(biāo)法來校正基質(zhì)效應(yīng)[44]。而選擇性質(zhì)相似的同位素作為內(nèi)標(biāo),能夠提供更準(zhǔn)確的定性和定量信息,校正方法誤差,從而顯著提高方法的準(zhǔn)確度和精密度。此外,PAEs代謝物測定一般采用多反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring,MRM)模式來采集信號,同時結(jié)合液相色譜保留時間及MRM特征離子對其進(jìn)行定性和定量。表3列出了一些尿液中PAEs代謝物分析的LC-MS/MS方法。

表3 文獻(xiàn)報道的尿液中PAEs代謝物的HPLC-MS/MS分析方法Table3 HPLC-MS/MS methods applied in the literature for the analysis of phthalate metabolites in human urine

* The percentage and ratio are based on volume;AA:acetic acid;FA:formic acid.

近年來,超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)不僅有助于提高分析通量,而且能夠在很大程度上減少試劑和樣品的消耗,也開始逐步應(yīng)用于PAEs代謝物的分析。中國疾病預(yù)防控制中心建立了一種人尿中9種PAEs代謝物的離線SPE-UPLC-MS/MS測定方法[41]。該方法將2 mL尿液樣本酶解2 h后,經(jīng)Oasis MAX固相萃取柱凈化處理,選用Waters ACQUITY UPLC BEH Phenyl色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm),以0.1%(v/v)乙酸乙腈和0.1%(v/v)乙酸水溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫,在負(fù)離子電噴霧及MRM模式下進(jìn)行測定。該方法操作簡便,結(jié)果準(zhǔn)確,靈敏度高,重現(xiàn)性好,能有效分離多種同分異構(gòu)體,為今后開展人體生物監(jiān)測項目奠定了良好的實驗基礎(chǔ)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),側(cè)鏈有8個或更多碳原子的PAEs化合物多是由同分異構(gòu)體組成的復(fù)雜混合物(如DiNP、DiDP)。由于復(fù)雜的代謝過程,大部分代謝產(chǎn)物至今還沒有被識別[61]。目前,利用LC-MS/MS對這類同分異構(gòu)體化合物進(jìn)行分離和定量仍然是一個艱巨的挑戰(zhàn)。

4.3 質(zhì)量控制

為了確保數(shù)據(jù)質(zhì)量,尿液中PAEs代謝物的分析過程中必須實施嚴(yán)格的質(zhì)量控制,具體措施主要涉及以下幾個方面:(1)全程序空白實驗:實驗過程中所用的儀器、試劑、環(huán)境及人為干擾等都有可能引入外源性污染,為了監(jiān)測這些因素的綜合影響,每批樣品分析時都要做空白實驗,一般選用模擬尿樣作為空白進(jìn)行相同的提取分析[45];(2)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的測定:質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是專門用于質(zhì)量控制目的、已知濃度的標(biāo)本或溶液。每進(jìn)行一定數(shù)目的樣品分析后,便插入一個質(zhì)控樣品,將結(jié)果與之前比較,唯有變動符合質(zhì)控要求,方可進(jìn)行下一個樣品的分析。目前,美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院(National Institute of Standards and Technology,NIST)提供有關(guān)PAEs代謝物分析的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)NIST SRMs 3672/3673[62];(3)加標(biāo)回收率的測定:加標(biāo)回收率是實驗室內(nèi)經(jīng)常用以自控的一種質(zhì)量控制技術(shù)。進(jìn)行PAEs代謝物分析時,通常選取模擬尿樣作空白基質(zhì),進(jìn)行一定濃度水平的加標(biāo)回收實驗,也可在實際尿液中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液來測定加標(biāo)回收率;此外還可以通過平行樣測定來判斷檢測精密度狀況或是否受控。

5 人體PAEs暴露評估

借助尿液代謝產(chǎn)物的檢測方法,國外學(xué)者在人群PAEs暴露評估方面開展了大量工作[29,35],國內(nèi)關(guān)于這方面的研究報道不多,必須建立適合我國國情的分析方法,同時進(jìn)一步篩選、鑒定PAEs暴露的生物標(biāo)志物,以用于大規(guī)模人群的監(jiān)測。需要注意的是,進(jìn)行尿液中PAEs代謝物測定時,我們還需要考慮暴露時間與采樣時間的間隔。盡管尿液中PAEs代謝物的濃度存在一些日間或月間變異,但研究表明,檢測單份隨機尿樣可代表3～6個月內(nèi)PAEs的平均暴露水平[63,64]。尿液是測定人群PAEs暴露時使用率最高的樣品,但是由于個體生活習(xí)慣的不同,導(dǎo)致尿液排泄體積差別很大,這就導(dǎo)致同樣暴露量時所獲尿液濃度不一致。為了消除不同尿量對代謝物濃度的影響,常用的校正方法有肌酐校正法和比重校正法[17,65]。肌酐代謝量受年齡、性別、飲食習(xí)慣、種族等多種因素影響,所以肌酐代謝量的個體差異比較大,尤其是處在生理發(fā)育期的兒童。而尿液比重受年齡、性別等差別變異性小,能夠更簡單方便地對尿液中的代謝產(chǎn)物濃度進(jìn)行校正[9]。

6 總結(jié)與展望

盡管大量研究發(fā)現(xiàn)PAEs對人體具有生殖毒性和發(fā)育毒性,并且還會增加其他患病風(fēng)險,但是長期暴露于PAEs對健康的影響尚不完全明了。尿液中PAEs代謝物的測定在采樣、前處理及檢測過程中均不易受到外源性污染、空白值低,并且具有采樣無創(chuàng)傷、采樣量足等優(yōu)勢,成為目前人體PAEs暴露評估的最佳手段。鄰苯二甲酸單酯和次級代謝物分別是短鏈和長鏈PAEs暴露最為常用的生物標(biāo)志物。相對分子質(zhì)量越大的PAEs其代謝物越復(fù)雜,濃度范圍越寬,必須發(fā)展先進(jìn)的檢測方法為發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物提供可能,從而能夠更好地理解這些化合物對人體健康的影響途徑,為毒理學(xué)研究提供幫助。在線SPE-HPLC-MS/MS技術(shù)因分析速度快、準(zhǔn)確度高、靈敏度高等優(yōu)點,已成功用于發(fā)達(dá)國家的人體生物監(jiān)測項目,并將在PAEs代謝物發(fā)現(xiàn)、分析中發(fā)揮越來越重要的作用。