曾海英，毛佳怡，李勇，朱怡，石明，秦禮康，2，6

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省蕎麥工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽 550025；3.貴州省薏苡工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽 550025；4.貴州省植保植檢站，貴州 貴陽 550001；5.黔西南喀斯特區(qū)域發(fā)展研究院，貴州 興義 562400；6.西南藥食兩用資源開發(fā)利用技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，貴州 貴陽 550025）

蕎麥屬蓼科（Polygonaceae），蕎麥屬（Fagoprum），是雙子葉植物。蕎麥屬有兩個栽培種，即苦蕎和甜蕎[1]。苦蕎所含蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、微量元素等都普遍高于其他作物[2-3]?？嗍w兼具食用和藥用價值，在我國醫(yī)書《齊民要術(shù)》、《備急千金要方》、《群芳譜·谷譜》等著作中均有關(guān)于苦蕎治病、防病之說?，F(xiàn)代研究表明：苦蕎黃酮具有降血糖血脂、抗疲勞、抗缺血、抗氧化、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等多種保健作用[4-6]。

貴州地處西南，獨(dú)特的地理優(yōu)勢孕育著豐富的苦蕎資源，尤其是2016年國務(wù)院1 號文件把特色小雜糧作為糧食結(jié)構(gòu)改革和特色作物產(chǎn)業(yè)發(fā)展重點(diǎn)后，貴州作為苦蕎種植的三大基地之一，迎來了新的機(jī)遇，蕎麥產(chǎn)業(yè)已成為貴州精準(zhǔn)扶貧產(chǎn)業(yè)和大健康的特色優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)。據(jù)統(tǒng)計，截止2016年，貴州蕎麥種植面積近80 萬畝，年產(chǎn)量約10 萬噸，主要集中分布在畢節(jié)和六盤水等區(qū)域。黔苦5 號苦蕎是貴州省威寧縣農(nóng)科所選育，2010年通過全國小宗糧豆品種鑒定委員會鑒定（鑒定編號為國品種鑒雜2010010）的貴州特有苦蕎品種[7]，近年來在全省范圍內(nèi)被廣泛種植。然就其加工適應(yīng)性、營養(yǎng)品質(zhì)、功能組分活性及延伸產(chǎn)業(yè)鏈、開發(fā)精深加工產(chǎn)品缺乏科學(xué)、系統(tǒng)的理論與數(shù)據(jù)支撐。因此，本課題以黔苦5 號蕎麥為原料，生產(chǎn)貴州特色全麥?zhǔn)w茶為研究對象，對其營養(yǎng)品質(zhì)、抗氧化活性及免疫調(diào)節(jié)作用進(jìn)行綜合性評價，以期為黔苦5 號苦蕎品種開發(fā)應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐，助力貴州苦蕎產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黔苦5 號全麥?zhǔn)w茶（QB5T）以貴州黔苦5 號蕎麥為原料生產(chǎn)的貴州特色苦蕎茶產(chǎn)品，由貴州蕎麥生產(chǎn)企業(yè)提供，對照組（CK）為貴州黔苦1 號全麥?zhǔn)w茶。

KM 小鼠：6 周～8 周齡，雌雄各半，SPF 級，體重（20±2）g，重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動物合格證號為：SCXK（軍）2012-0011；IgG、IgM 測定試劑盒：上海鼓臣生物技術(shù)有限公司；雞紅細(xì)胞、補(bǔ)體（豚鼠血清）：貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制。

蘆丁、山奈酚、槲皮素、沒食子酸標(biāo)品：上海源葉生物科技有限公司；VC：湖南南化化學(xué)試劑廠；DPPH、ABTS：Sigma 公司；環(huán)磷酰胺：江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；2，4-二硝基氟苯 （2，4-dinitrofluorobenzene，DNFB）：成都西亞試劑有限公司；瑞氏染料：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。以上均為分析純。

1.2 儀器

TU-1810 紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；FW100 高速萬能粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；TGL20M 臺式高速冷凍離心機(jī)：長沙邁佳森儀器設(shè)備有限公司；SpectraMax 190 光吸收酶標(biāo)儀：美谷分子儀器（上海）有限公司；MoticAE31 倒置相差顯微鏡：麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；MB90 水分測定儀：奧豪斯儀器（常州）有限公司；JA1003 分析天平：上海精科儀表有限公司；1220 型液相色譜儀：美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 感觀評價

擬定詳細(xì)的感官評分標(biāo)準(zhǔn)及分值，評定組由食品專業(yè)人員10 人組成，男女比例為1 ∶1，感觀評分標(biāo)準(zhǔn)表如下。

表1 苦蕎茶感官評價指標(biāo)Table 1 Sensory evaluation index of tartary buckwheat tea

1.3.2 營養(yǎng)成分分析

蛋白質(zhì)的測定：GB 5009.6-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測定》；脂肪的測定：GB 5009.6-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪的測定》；碳水化合物的測定：采用“減差法”[8]；水分的測定：MB90 水分測定儀測定；灰分的測定：GB 5009.4-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中灰分的測定》。

1.3.3 功效成分分析

1.3.3.1 多酚測定

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精密稱取沒食子酸標(biāo)品10 mg，于10 mL 容量瓶中用60%乙醇溶解定容至刻度，搖勻。分別配制沒食子酸濃度為 0、4、8、16、24、32、40、48、56 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。精準(zhǔn)吸取每個濃度的待測液0.2 mL，分別加入3 mL 飽和碳酸鈉溶液和1 mL福林酚顯色劑，混勻，26 ℃避光反應(yīng)1 h。于765 nm 波長處測定其吸光度。以吸光度和沒食子酸質(zhì)量濃度求得回歸方程，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

多酚的測定：準(zhǔn)確稱取樣品2 g，加入一定乙醇溶液，水浴回流加熱提取，冷卻后于3 000 r/min 離心15 min，抽濾。用60%乙醇將澄清液定容至50 mL 即得到多酚待測液。取樣液0.2 mL，與標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的方法測定樣品中多酚總含量。

1.3.3.2 黃酮測定

參照李勇等[9]的方法。蘆丁、槲皮素、山奈酚等標(biāo)準(zhǔn)曲線制作略。

黃酮的測定：精稱粉碎干樣品1 g，60%乙醇20 mL，50 ℃超聲浸提30 min（超聲功率600 W，頻率40 kHz），離心取上清液，加60%乙醇5 mL 清洗3 次，離心合并上清液，于 50 mL 容量瓶中定容，搖勻，過 0.22 μm 微孔濾膜，即得到黃酮待測液。取待測液0.2 mL，與標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的方法測定樣品中黃酮含量。

色譜條件：Agilent C1（8150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇 ∶0.4 %磷酸溶液（體積比1 ∶1）；流速：1 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測波長：360 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

1.3.4 抗氧化能力測定

參照李海珊等[10]方法稍作修改，準(zhǔn)確稱取經(jīng)粉碎樣品 1 g，用 60 %的乙醇溶液，料液比 1 ∶25（g/mL），50 ℃超聲浸提30 min（超聲功率600 W，頻率40 kHz），離心取上清液，加60%乙醇溶液5 mL 清洗然后離心合并上清液重復(fù)3 次，于50 mL 容量瓶中定容備用。分別將苦蕎茶醇提物和VC配成濃度分別為0、25、50、100 μg/mL 的待測液。

1.3.4.1 清除DPPH 自由基能力測定

用甲醇稀釋DPPH 至517 nm 下吸光值為0.98±0.02 得DPPH 自由基工作液，置于陰暗處反應(yīng)40 min，4 ℃保存。取不同組別樣液100 μL 分別與DPPH 自由基工作液 3.9 mL 混合，反應(yīng) 30 min。用 100 μL 甲醇和3.9 mLDPPH 自由基工作液反應(yīng)作對照，用無水乙醇為空白調(diào)節(jié)分光光度計，于517 nm 處測定吸光度。

計算公式：清除率/%=（A對照-A樣品）/A對照×100

式中：A樣品為樣品液 100 μL 與 DPPH 自由基工作液 3.9 mL 混合吸光度，A對照為甲醇 100 μL 和 DPPH自由基工作液3.9 mL 混合吸光度。

1.3.4.2 清除ABTS+自由基能力測定

取 7 mmol/L ABTS 5.00 mL 和 140 mmol/L 過硫酸鉀88 μL，避光反應(yīng)16 h，將ABTS 溶液用乙醇稀釋至在734 nm 波長處吸光值為0.7±0.02，取ABTS+自由基工作液3.9 mL 與樣品液100 μL 混合，避光反應(yīng)15 min。用100 μL 乙醇和3.9 mL ABTS+自由基工作液反應(yīng)作對照，用無水乙醇為空白調(diào)節(jié)分光光度計，于734 nm處測定吸光度。

計算公式：清除率/%=（A對照-A樣品）/A對照×100

式中：A樣品為樣品液 100 μL 與 ABTS＋自由基工作液 3.9 mL 混合吸光度，A對照為乙醇 100 μL 和 ABTS＋自由基工作液3.9 mL 混合吸光度。

1.3.4.3 鐵離子還原能力（ferric reducing ability of plasma，F(xiàn)RAP 法）測定

用0.25 mol/L、pH 3.6 的乙酸緩沖液溶解TPTZ（10 mmol/L）和FeCl（320 mmol/L）配成FRAP 工作液。取樣品液 0.5 mL 與FRAP 工作液 3.5 mL 混合，在 37 ℃下孵育10 min，用無水乙醇作空白對照，于593 nm 處測其吸光值。以FeSO4作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 免疫調(diào)節(jié)能力測定

1.3.5.1 構(gòu)建小鼠免疫低下模型

參照宋金星等[11]方法稍作修改，KM 小鼠，隨機(jī)分為空白對照組、環(huán)磷酰胺對照組、苦蕎茶組高劑量組（TBH）、苦蕎茶組中劑量組（TBM）、苦蕎茶組低劑量組（TBL），高、中、低組灌胃劑量分別為600、300、150 mg/kg bw，每組10 只。各組小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺溶液，注射量為60 mg/kg bw，空白對照組腹腔注射等劑量的生理鹽水，連續(xù)3 d，構(gòu)建環(huán)磷酰胺所致小鼠免疫功能低下模型。小鼠免疫功能低下模型建立后，實(shí)驗(yàn)各組按照各自劑量灌胃，空白對照組及環(huán)磷酰胺對照組灌胃等劑量的生理鹽水。

1.3.5.2 脾臟和胸腺指數(shù)測定

連續(xù)灌胃9 d 后禁食不禁水；24 h 后頸椎脫臼處死小鼠，取小鼠脾臟、胸腺，稱重記數(shù)，計算脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)。脾臟指數(shù)＝脾臟質(zhì)量（mg）/體重（g），胸腺指數(shù)＝胸腺質(zhì)量（mg）/體重（g）。

1.3.5.3 耳腫脹率測定

連續(xù)灌胃6 d 后，于腹部涂抹8%的硫化鈉去毛，均勻涂抹5%DNFB 50 μL；3 d 后于小鼠左耳均勻涂抹 1%DNFB 20 μL，于右耳均勻涂抹 20 μL 丙酮溶液進(jìn)行對照；24 h 后頸椎脫臼處死，用打孔器取直徑8 mm 的耳片，稱重，計算腫脹率，腫脹率/%=[左耳質(zhì)量（mg）/右耳質(zhì)量（mg）-1]×100。

1.3.5.4 血清中IgG、IgM 含量測定

連續(xù)灌胃10 d 后摘眼球取血，1 500 r/min 離心10 min 取血清，按照IgG、IgM 測定試劑盒的使用說明書進(jìn)行測定。

1.3.5.5 血清溶血素水平測定

連續(xù)灌胃6 d 后，腹腔注射2%雞紅細(xì)胞混懸液0.2 mL；4 d 后摘眼球取血，1 500 r/min 離心 10 min，取血清，用生理鹽水稀釋至100 倍；取1 mL 加10%的雞紅細(xì)胞懸浮液0.5 mL、10%的補(bǔ)體1 mL，混合均勻于37 ℃水浴30 min，置0 ℃冰箱中終止反應(yīng)。1 500 r/min離心5 min，取上清液于540 nm 處測吸光度值。與不加血清的生理鹽水試管作對照。

1.3.5.6 單核-巨噬細(xì)胞吞噬能力測定

連續(xù)灌胃6 d 后，每只小鼠腹腔注射4%的淀粉肉湯1 mL，以引誘體內(nèi)的巨噬細(xì)胞向腹腔聚集；間隔2 h 后，每只小白鼠注射1%的雞紅細(xì)胞懸液1 mL。再間隔2 h，頸椎脫臼處死，放置于27 ℃環(huán)境下避免尸體僵硬，剪開腹壁皮膚，腹腔注射生理鹽水2 mL，用手輕柔5 min，吸取腹液1 mL 均勻涂于載玻片上，立即37 ℃孵育30 min，用生理鹽水緩慢沖洗1 min，吹干，染色進(jìn)行觀察。計數(shù)：油鏡下觀察，以巨噬細(xì)胞數(shù)200 個為記數(shù)范圍，同時記數(shù)其中吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)，記錄結(jié)果，計算吞噬率，吞噬率/%=吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞/200×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 感觀、營養(yǎng)及功效成分分析

黔苦1 號全麥?zhǔn)w茶、黔苦5 號全麥?zhǔn)w茶感官、營養(yǎng)及功效成分測定結(jié)果見表2。

表2 QB5T 及QB1T 感官、營養(yǎng)及功效活性組分測定結(jié)果Table 2 Determination results of sensory，nutrient and bioactivity components of QB5T and QB1T

從表2感官評分及沖飲特性上分析，QB5T 與QB1T 差異顯著（P＜0.05），QB5T 茶湯更明亮，色金黃，有濃烈的麥香，夾帶焦香，無異味。常規(guī)營養(yǎng)指標(biāo)上，兩者無顯著差異，但QB5T 蛋白質(zhì)含量達(dá)20.12%，較趙鑫[12]研究的11 個全麥苦蕎茶蛋白高，可作為植物蛋白的良好來源[13-14]。QB5T 碳水化合物含量為69.50%，但苦蕎比小麥含有更多的抗性淀粉和膳食纖維，因此苦蕎引起糖尿病人血糖指數(shù)增加比小麥等谷物均低[15]。故此，蕎茶在能滿足糖尿病人對糖喜好及能量需求下，又能保持血糖穩(wěn)定性，是糖尿病人的理想飲品之一。

QB5T 與QB1T 的黃酮組分高效液相色譜圖見圖1。

圖1 QB5T 與QB1T 的黃酮組分高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatography of QB5T and QB1T

與QB1T 相比，QB5T 總黃酮及多酚含量豐富，分別為20.21 mg/g 和27.70 mg/g，顯著高于 QB1T（P＜0.05）。全麥?zhǔn)w茶黃酮組分主要為蘆丁、山奈酚及槲皮素，由圖1可知，QB5T 所含黃酮組分，其中蘆丁為主成分，占黃酮含量的90.20%，含量為18.23 mg/g；山奈酚和槲皮素分別為 660.00 μg/g 和 412.33 μg/g。

2.2 醇提物的抗氧化活性

QB1T、QB5T 抗氧化活性評價結(jié)果見表3。

QB5T 醇提物的還原力及 ABTS＋·、DPPH·清除率結(jié)果見圖2。

表3 QB5T 及QB1T 的抗氧化活性評價Table 3 Evaluation of antioxidant activity of QB5T and QB1T ethanol extract

由表3可知，QB5T 醇提物在 ABTS＋·、DPPH·自由基清除率和鐵還原力方面均顯著強(qiáng)于QB1T（P＜0.05），可能與其黃酮、多酚等物質(zhì)含量較高有關(guān)。QB5T 與VC相比，兩者抗氧化活性均隨著質(zhì)量濃度的增加而增加，且呈現(xiàn)量效關(guān)系。QB5T 對ABTS·+和DPPH·的IC50分別為 90.76 μg/mL 和 79.61 μg/mL，僅次于 VC的 71 μg/mL和 65.24 μg/mL；當(dāng) QB5T 質(zhì)量濃度為 100 μg/mL 時，其最大清除率分別達(dá)59.53%、75.02%，自由基清除活性良好，這與B?aszczak W 等[16]的研究結(jié)果一致。相同濃度水平下QB5T 醇提物的FRAP 值相對高于 VC，且FRAP 值隨著質(zhì)量濃度的增加而增大，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到100 μg/mL 時，QB5T 醇提物的 FRAP 值達(dá) 255.24 μg FeSO·47H2O eq/mL，VC為 231.72 μg FeSO·47H2O eq/mL，表明QB5T 醇提物具有較好的還原能力且強(qiáng)于VC。

圖2 QB5T 醇提物的還原力及ABTS+·、DPPH·清除率Fig.2 Reducing power and free radical scavenging rate of ABTS+·and DPPH·of QB5T ethanol extract

2.3 苦蕎茶醇提物的免疫調(diào)節(jié)活性

QB5T 醇提物的免疫調(diào)節(jié)活性見圖3。

由圖3可知，小鼠免疫低下模型成立（空白對照組與模型對照組差異極顯著P＜0.01）。QB5T 醇提物各劑量組，灌胃免疫低下小鼠，小鼠各項(xiàng)免疫指標(biāo)均顯著或極顯著高于模型對照組，且呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。QB5T醇提物高劑量組（TBH）免疫調(diào)節(jié)活性最強(qiáng)，表現(xiàn)在胸腺指數(shù)增加顯著（P＜0.05），脾臟指數(shù)增加極顯著（P＜0.01），分別為4.98 mg/g 和7.77 mg/g，表明QB5T 醇提物能修復(fù)小鼠脾臟和胸腺或促進(jìn)其發(fā)育[17]；IgG、IgM 含量增加極顯著（P＜0.01），分別為 1092.71、168.75 mg/100 mL，較模型組分別提高2.36 倍和1.91 倍，表明QB5T 醇提物可提高血清中IgG、IgM 含量水平，提升體液免疫能力[18]；血清溶血素水平提高極顯著（P＜0.01），OD450值為0.49，表明QB5T 醇提物可提高血清溶血素水平，進(jìn)而提高機(jī)體體液免疫能力[19]；耳腫脹率增加極顯著（P＜0.01），耳腫脹率為122.09%，較模型組提高64.69%，表明QB5T 醇提物可提高細(xì)胞免疫功能；吞噬率增加極顯著（P＜0.01），吞噬率為 49.20 %，表明 QB5T 醇提物可提高機(jī)體非特異性免疫功能[20]。

圖3 QB5T 醇提物的免疫調(diào)節(jié)活性Fig.3 Immunoregulation activity of QB5T ethanol extract

3 結(jié)論

貴州苦蕎資源豐富，作為主要產(chǎn)區(qū)之一，衍生出眾多苦蕎企業(yè)與苦蕎產(chǎn)品。黔苦5 號蕎麥生產(chǎn)的全麥?zhǔn)w茶是地方優(yōu)育品種生產(chǎn)的具有代表性的一類蕎茶產(chǎn)品，其品質(zhì)優(yōu)良，營養(yǎng)豐富，多酚（27.70 mg/g）、總黃酮含量（19.83 mg/g）等功能活性組分含量高，醇提物具有較好的ABTS+·、DPPH·清除能力和還原能力，且濃度為100 μg/mL 時自由清除率分別為59.53%、75.02%，其自由清除率僅次于VC，而FRAP 值為255.24 μg FeSO4·7H2O eq/mL，高于VC，表現(xiàn)出較好的抗氧化活性。黔苦5 號全麥?zhǔn)w茶醇提物各劑量組均可提高免疫低下小鼠的胸腺和脾臟指數(shù)、血清中IgG、IgM 含量、血清血溶素水平、耳腫脹率及單核-巨噬細(xì)胞吞噬率，且高劑量組效果極顯著（P＜0.05），呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系，表現(xiàn)出較好的免疫調(diào)節(jié)作用。