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        玉米肽對(duì)乙醇氧化損傷模型小鼠的抗氧化作用研究

        2019-07-30 06:33:20李雍林峰秦勇劉偉周雅琳李睿珺于蘭蘭許雅君
        食品研究與開發(fā) 2019年15期
        關(guān)鍵詞:全血抗氧化肝臟

        李雍,林峰,秦勇,劉偉,周雅琳,李睿珺,于蘭蘭,許雅君,4,

        (1.北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系,北京 100191;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,北京 100029;3.正生營(yíng)養(yǎng)研究院,新疆 昌吉 830000;4.食品安全毒理學(xué)研究與評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100191)

        近年來隨著我國(guó)酒類產(chǎn)量的不斷增加,飲酒率及酒精性肝病的發(fā)病率也在逐年增長(zhǎng)[1],而酒精的過量攝入及長(zhǎng)期低劑量攝入對(duì)人類身體健康都有極大危害。酒精性肝?。╝lcoholic liver disease,ALD)是指由于長(zhǎng)期大量攝入酒精而導(dǎo)致肝臟損害的一系列病變[2]。該病主要由促進(jìn)脂肪變性過程的酒精代謝副產(chǎn)物驅(qū)動(dòng),可導(dǎo)致脂肪性肝炎、纖維化、肝硬化、肝功能衰竭,甚至肝癌[3]?,F(xiàn)今,臨床上的很多治療肝損傷的藥物所帶來的毒副作用不容回避,而充分利用天然植物資源,開發(fā)具有保肝作用的植物資源,可以為新型保肝藥提供理論基礎(chǔ)。

        我國(guó)玉米資源豐富,生產(chǎn)淀粉一直以來都是其最大的商業(yè)開發(fā)途徑,而生產(chǎn)所得副產(chǎn)物——玉米麩質(zhì)粉中醇溶蛋白的高憎水性,限制了它在食品中的廣泛應(yīng)用[4],而將玉米蛋白水解制成的玉米肽當(dāng)前已被證明有著抗氧化、醒酒、降低血清中膽固醇濃度等多種保健食品的優(yōu)良特性,本研究采用新疆地區(qū)特有的粉質(zhì)型玉米品種,立足于該地區(qū)特色植物多肽的功效研究,著力為開發(fā)其特色玉米品種的保健應(yīng)用提供新思路,為該拓寬地區(qū)特色玉米的商業(yè)用途提供理論基礎(chǔ)的同時(shí),也為保肝護(hù)肝藥資源的開發(fā)提供了優(yōu)質(zhì)的天然植物資源,拉動(dòng)了新疆地區(qū)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展并促進(jìn)該地區(qū)維穩(wěn)工作的進(jìn)行。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        玉米肽以玉米黃粉為加工原料,經(jīng)蛋白分離純化、酶解、純化、干燥等步驟獲得。其相對(duì)分子質(zhì)量<1 000 D,由2~6 個(gè)氨基酸構(gòu)成,可不經(jīng)消化,直接吸收供組織利用。凝膠色譜圖見圖1。

        圖1 玉米肽凝膠色譜圖Fig.1 Corn peptide gel chromatogram

        酪蛋白(Sigma C5890):Sigma 公司。

        健康成年SPF 級(jí)ICR 雄性小鼠50 只,使用許可證號(hào):SCXX(京)2016-0010,體質(zhì)量(25.0±5.0)g;受試動(dòng)物由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供,動(dòng)物飼喂于屏障環(huán)境中。環(huán)境溫度為(23±2)℃,濕度50%~60%,明暗交替 12 h ∶12 h。

        谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)測(cè)試盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)測(cè)試盒、谷胱甘肽(glutathione,GSH)測(cè)試盒、總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)測(cè)試盒、蛋白質(zhì)羰基(protein carbonyl,PC)測(cè)試盒、蛋白定量測(cè)試盒:南京建成生物工程研究所;其他試劑均為分析純。

        1.2 儀器與設(shè)備

        AR1140 電子分析天平:奧豪斯國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司;FLUO star Omega 多功能酶標(biāo)儀:BMG LABTECH Inc.;BFX5-320 型低溫自動(dòng)平衡離心機(jī):白洋離心機(jī)廠;Allegra X-30R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī):BECKMAN COULTERTM;HH·S11-1 電熱恒溫水浴鍋:北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠。

        1.3 方法

        1.3.1 動(dòng)物分組

        50 只雄性ICR 小鼠經(jīng)1 周適應(yīng)期后,稱重并按體重隨機(jī)分為5 組,分別為空白組、模型組、玉米肽低、中和高劑量組,每組各10 只。各組均給予維持飼料,自由進(jìn)食、飲用無菌去離子水。

        1.3.2 造模及給藥

        實(shí)驗(yàn)期間每天早上 8:00~10:00 對(duì)小鼠灌胃,對(duì)各劑量組灌胃給藥不同劑量受試樣品,其中低劑量組:0.4 g(/kg·bw)、中劑量組:0.8 g(/kg·bw)、高劑量組:1.6 g(/kg·bw),對(duì)照組和模型組給予等體積的酪蛋白1.6 g(/kg·bw),以灌胃容量0.1 mL/10 g 連續(xù)灌胃30 d,并根據(jù)體質(zhì)量來調(diào)整灌胃劑量,灌胃期間自由取食和飲水。實(shí)驗(yàn)時(shí)間30 d。間隔5 d 稱重并記錄其體重與攝食量。末次灌胃后除對(duì)照組外,其他4 組禁食16 h,然后一次性經(jīng)口灌胃給予50%乙醇12 mL(/kg·bw)。

        1.3.3 測(cè)試樣品制備及指標(biāo)檢測(cè)

        模型對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組灌胃乙醇6 h 后,摘眼球取血處死,血液分全血和血清兩部分進(jìn)行收集,其中一部分采用0.5 mL 離心管收集,3 000 r/min 離心10 min,取上清液備用(用于檢測(cè)血液T-SOD 和丙二醛含量),另一部分用1.5 mL 抗凝管收集全血備用(用于檢測(cè)血液 GSH-Px 和 GSH 含量)。

        解剖小鼠取肝臟并準(zhǔn)確稱取4 份0.1 g 的肝臟組織,其中3 份加入9 倍體積的生理鹽水(用于測(cè)肝臟GSH、T-SOD、GSH-Px、MDA),另外一份加入蛋白質(zhì)羰基含量測(cè)試盒試劑一(用于測(cè)肝臟蛋白質(zhì)羰基含量),制成10%的組織勻漿液后,2 500 r/min 離心10 min,取上清液備用。最后對(duì)小鼠的肝組織及血液中的指標(biāo)采用測(cè)試盒說明書要求進(jìn)行統(tǒng)一測(cè)定。

        1.4 數(shù)據(jù)處理

        本實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為連續(xù)變量,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。所有數(shù)據(jù)使用SPSS22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組間差異利用單因素方差分析(one-way ANOVA)處理,以p <0.05 作為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異判斷標(biāo)準(zhǔn)。采用最小顯著差數(shù)法(least significant difference,LSD)在方差齊時(shí)進(jìn)行兩兩比較;采用Tamhane’s 法在方差不齊時(shí)進(jìn)行比較。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 玉米肽對(duì)小鼠體重及食物利用率的影響

        實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)均無顯著性差異(p>0.05)。其體重及食物利用率在各組的變化結(jié)果見圖2和圖3。

        圖2 玉米肽對(duì)小鼠體重的影響Fig.2 The effect of corn peptide on the weight of mice

        圖3 玉米肽對(duì)小鼠食物利用率的影響Fig.3 Effect of corn peptide on the utilization rate of food in mice

        由圖2、圖3可得,小鼠的體重隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增長(zhǎng),各組的食物利用率及凈增體重?zé)o顯著性差異(p>0.05),各組動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)過程中無表現(xiàn)異常,這說明玉米肽在實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)對(duì)小鼠正常生長(zhǎng)無影響,玉米肽對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育無不良影響。

        2.2 玉米肽對(duì)小鼠抗氧化物質(zhì)GSH含量的影響

        小鼠體內(nèi)全血和肝臟抗氧化物質(zhì)GSH 含量結(jié)果如表1所示。

        表1 玉米肽對(duì)小鼠抗氧化物質(zhì)GSH 的影響(±SD,n=10)Table 1 The effect of corn peptide on mice in whole blood and liver tissue GSH(±SD,n=10)

        表1 玉米肽對(duì)小鼠抗氧化物質(zhì)GSH 的影響(±SD,n=10)Table 1 The effect of corn peptide on mice in whole blood and liver tissue GSH(±SD,n=10)

        注:#、*表示較之正常對(duì)照組/模型對(duì)照組p<0.05,差異顯著;**表示較之正常對(duì)照組/模型對(duì)照組p<0.01,差異極顯著。

        組別全血/(g/L)肝臟/(mg/gprot)空白對(duì)照組 0.23±0.04 1.42±0.35模型對(duì)照組 0.19±0.04# 0.71±0.07#玉米肽低劑量組 0.23±0.04* 0.77±0.08玉米肽中劑量組 0.23±0.04* 1.00±0.24*玉米肽高劑量組 0.22±0.025** 1.25±0.23

        模型組全血和肝臟中GSH 的含量顯著低于空白對(duì)照組(p<0.05);全血中的GSH 含量在各劑量組中均較之模型組顯著提升(p<0.05),同時(shí)中劑量組肝組織的GSH 含量較之模型組也表現(xiàn)出了顯著上升(p<0.05)。

        2.3 玉米肽對(duì)小鼠抗氧化酶SOD活力的影響

        小鼠血清和肝組織SOD 含量見表2。

        表2 玉米肽對(duì)小鼠抗氧化酶SOD 活力的影響(±SD,n=10)Table 2 Effect of corn peptide on mice in serum and liver tissue SOD(±SD,n=10)

        表2 玉米肽對(duì)小鼠抗氧化酶SOD 活力的影響(±SD,n=10)Table 2 Effect of corn peptide on mice in serum and liver tissue SOD(±SD,n=10)

        注:#、*表示較之正常對(duì)照組/模型對(duì)照組p<0.05,差異顯著;##、**表示較之正常對(duì)照組/模型對(duì)照組p<0.01,差異極顯著。

        組別血清/(U/mL)肝臟/(U/mgprot)空白對(duì)照組 104.32±7.11 248.50±24.57模型對(duì)照組 95.52±5.38# 202.80±13.84##玉米肽低劑量組 101.72±2.96 217.40±17.19##玉米肽中劑量組 103.40±4.00* 220.00±11.96##*玉米肽高劑量組 98.97±7.35 231.61±20.56#**

        模型組較之空白對(duì)照組血清和肝組織中的SOD活性顯著降低(p<0.05);而各劑量組與模型組比較,中劑量組在血清SOD 酶活性有顯著提升(p<0.05),肝臟中SOD 酶活性的顯著提升也在中、高劑量組有所體現(xiàn)(p<0.05)。

        2.4 玉米肽對(duì)小鼠抗氧化酶GSH-Px活力的影響

        小鼠全血和肝組織中GSH-Px 酶含量結(jié)果見表3。

        表3 玉米肽對(duì)小鼠抗氧化酶GSH-Px 活力的影響(±SD,n=10)Table 3 Effect of corn peptide on mice in whole blood and liver tissue GSH-Px(±SD,n=10)

        表3 玉米肽對(duì)小鼠抗氧化酶GSH-Px 活力的影響(±SD,n=10)Table 3 Effect of corn peptide on mice in whole blood and liver tissue GSH-Px(±SD,n=10)

        注:#、*表示較之正常對(duì)照組/模型對(duì)照組p<0.05,差異顯著;##、**表示較之正常對(duì)照組/模型對(duì)照組p<0.01,差異極顯著。

        肝臟/(U/mgprot)空白對(duì)照組 573.70±43.53 584.68±35.13模型對(duì)照組 444.65±46.41## 420.32±25.81##玉米肽低劑量組 526.04±38.41#** 461.87±56.52##玉米肽中劑量組 607.74±28.88** 467.40±66.09##*玉米肽高劑量組 594.39±48.61** 563.16±67.10**組別 全血/(U/mL)

        較之正常對(duì)照組,模型對(duì)照組全血和肝組織中的GSH-Px 活性顯著降低(p<0.01);全血中各劑量組提升GSH-Px 酶活性效果顯著(p<0.01),而肝臟中玉米肽中、高劑量組也表現(xiàn)出了顯著的差異(p<0.05)。

        2.5 玉米肽對(duì)小鼠過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物MDA含量的影響

        小鼠血清和肝臟組織中的MDA 含量結(jié)果見表4。

        模型組肝組織中MDA 含量較之空白對(duì)照組提升顯著(p<0.01)。高劑量組血清MDA 含量顯著低于模型組(p<0.05),而肝臟中雖然各劑量組相對(duì)于模型組MDA 含量均有減少趨勢(shì),但無顯著差異(p>0.05)。

        表4 玉米肽對(duì)小鼠脂質(zhì)過氧化物MDA 含量的影響(±SD,n=10)Table 4 Effect of corn peptide on mice in serum and liver tissue MDA(±SD,n=10)

        表4 玉米肽對(duì)小鼠脂質(zhì)過氧化物MDA 含量的影響(±SD,n=10)Table 4 Effect of corn peptide on mice in serum and liver tissue MDA(±SD,n=10)

        注:*表示較之模型對(duì)照組p<0.05,差異顯著;##表示較之正常對(duì)照組p<0.01,差異極顯著。

        組別血清/(nmol/mL)肝臟/(nmol/mgprot)空白對(duì)照組 5.05±2.55 2.57±0.56模型對(duì)照組 6.68±2.00 6.40±0.64##玉米肽低劑量組 5.95±2.49 6.35±1.47##玉米肽中劑量組 5.19±2.02 6.00±1.69##玉米肽高劑量組 4.40±0.99* 5.59±0.83##

        2.6 玉米肽對(duì)小鼠肝臟中PC含量的影響

        機(jī)體PC 含量可以間接說明玉米肽抗氧化損傷的能力,結(jié)果見表5。

        表5 玉米肽對(duì)小鼠肝臟蛋白質(zhì)羰基含量的影響(±SD,n=10)Table 5 Effect of corn peptide on mice in liver tissue protein carbonyl(±SD,n=10)

        表5 玉米肽對(duì)小鼠肝臟蛋白質(zhì)羰基含量的影響(±SD,n=10)Table 5 Effect of corn peptide on mice in liver tissue protein carbonyl(±SD,n=10)

        注:*表示較之模型對(duì)照組p<0.05,差異顯著;##表示較之正常對(duì)照組p<0.01,差異極顯著。

        組別PC/(nmol/mgprot)空白對(duì)照組 2.89±0.58模型對(duì)照組 5.51±1.16##玉米肽低劑量組 3.72±1.41*玉米肽中劑量組 3.61±1.89*玉米肽高劑量組 3.61±1.40*

        較之正常對(duì)照組,模型組肝組織中的蛋白質(zhì)羰基含量升高(p<0.01)。各劑量組肝組織中PC 含量顯著(p<0.01)低于模型組。

        3 討論與結(jié)論

        通過脫氫酶代謝乙醇轉(zhuǎn)變?yōu)橐胰┖罄^續(xù)代謝成乙酸鹽,導(dǎo)致煙酰胺腺嘌呤二核苷酸產(chǎn)生,脂肪酸氧化抑制和脂肪積累,乙醇代謝后還原型輔酶Ⅰ(nicotinamide adenine dinucleotide,NADH)的生成增多,會(huì)增強(qiáng)呼吸鏈的活動(dòng),故氧化應(yīng)激是酒精肝毒性的一個(gè)特征,同時(shí)也在酒精性肝病的發(fā)展中起重要作用[5]。本研究以小鼠肝臟和血液中的GSH、MDA 含量以及抗氧化酶系SOD、GSH-Px 的活性與肝組織蛋白質(zhì)羰基(protein carbonyl,PC)含量為檢測(cè)指標(biāo),探究玉米肽對(duì)小鼠乙醇氧化損傷模型的抗氧化程度。結(jié)果顯示各指標(biāo)模型組較之空白組均有顯著差異,提示本實(shí)驗(yàn)造模成功,分析各指標(biāo)可得,非酶類抗氧化劑GSH 和抗氧化酶系SOD 與GSH-Px 均在血清和肝臟中表現(xiàn)出顯著的差異(p<0.01),此外肝組織PC 在各劑量組中均顯示出了顯著差異(p<0.05),而MDA 僅在高劑量組血清中有顯著性差異(p<0.05),肝臟中未有任何顯著性差異(p>0.05)。

        本實(shí)驗(yàn)中的玉米肽平均相對(duì)分子質(zhì)量低于1 000 D,由2~6 個(gè)氨基酸構(gòu)成,可不經(jīng)消化,直接吸收供組織利用,相關(guān)研究顯示,水解玉米蛋白粉并經(jīng)過正交試驗(yàn)后可獲得抗氧化性大幅提升的玉米肽,其抗氧化活性與其相對(duì)分子質(zhì)量具有相關(guān)性。DPPH 自由基的清除能力與其分子量顯著相關(guān),相對(duì)分子質(zhì)量在5 000 D以下,隨著相對(duì)分子質(zhì)量的上升而下降[6]。結(jié)果表明玉米肽對(duì)乙醇誘導(dǎo)的氧化損傷模型小鼠具有抗氧化作用,這可能是通過提升其體積內(nèi)抗氧化酶系活性、清除體內(nèi)自由基等途徑實(shí)現(xiàn)的。

        乙醇誘導(dǎo)肝損傷中的氧化應(yīng)激和自由基損傷作用一直被認(rèn)為是極為重要的途徑[7]。一旦出現(xiàn)促氧化劑和抗氧化劑之間的不平衡,作為氧化代謝的副產(chǎn)物產(chǎn)生的活性氧(reactive oxygen species,ROS)就會(huì)損害細(xì)胞大分子,例如DNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)。研究表明乙醇攝入增加了脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物如MDA 的形成[7]。為了抵消這種氧化應(yīng)激,細(xì)胞同時(shí)具有多種抗氧化酶系,其中主要是SOD 和GSH-Px,是細(xì)胞遭受氧化應(yīng)激時(shí)進(jìn)行抵御的重要酶系。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得,MDA 含量在小鼠血清中降低顯著(p<0.05),同時(shí)抗氧化酶系SOD 和GSH-Px 在小鼠體內(nèi)均表現(xiàn)出了顯著的活力提升(p<0.01),這表明玉米肽一方面可以激活體內(nèi)抗氧化酶系,結(jié)合其氧化損傷后的自由基,同時(shí)可以通過自身直接結(jié)合自由基,來降低乙醇對(duì)肝臟的損害,降低膜脂損害后產(chǎn)生的大量MDA,進(jìn)而在機(jī)體中起到抗氧化的作用。實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明,GSH 是Nrf2 的靶關(guān)鍵解毒酶,Nrf2 是抗氧化反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子,在預(yù)防乙醇誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和脂質(zhì)積聚方面發(fā)揮著重要作用[8]。植物化學(xué)物質(zhì)可以通過直接結(jié)合Keap1 激活Nrf2 共價(jià)連接,誘導(dǎo)解毒酶和相關(guān)蛋白,在保護(hù)細(xì)胞免受ROS 施加的自由基應(yīng)激中起關(guān)鍵作用[9-10]。據(jù)此可以解釋本實(shí)驗(yàn)中在GSH 含量上顯示的顯著(p<0.01)提高。除抗氧化酶系和膜脂受損的評(píng)價(jià)指標(biāo)外,蛋白質(zhì)作為功能繁多的生物大分子存在于體內(nèi),也是受到自由基攻擊的主要目標(biāo),其側(cè)鏈氨基酸的氧化是生命系統(tǒng)的重要信號(hào),蛋白質(zhì)受損的一個(gè)重要標(biāo)志也就是蛋白質(zhì)側(cè)鏈羰基的形成。因此蛋白質(zhì)羰基含量的測(cè)定是對(duì)衡量自由基對(duì)機(jī)體的損傷程度有著實(shí)際意義的指標(biāo)[11]。本實(shí)驗(yàn)中玉米肽各劑量組均顯著低于空白對(duì)照組(p<0.05),提示玉米肽可以自身結(jié)合自由基,在一定程度上防護(hù)機(jī)體蛋白質(zhì)受自由基損害。

        本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在一定劑量下,由新疆地區(qū)特色粉質(zhì)型玉米所研發(fā)的玉米肽具有抗氧化功能,這為該地區(qū)玉米開發(fā)具有保肝護(hù)肝及抗氧化功能產(chǎn)品提供了一定的理論依據(jù),并拓展了該地區(qū)特色玉米品種的商業(yè)用途。

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