李愛華 孫瑋璇 李 萍 陶永勝* 梁艷英

（1 西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 陜西楊凌712100 2 西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院 陜西楊凌712100 3 寧夏出入境檢驗(yàn)檢疫局 銀川750001）

葡萄酒的典型香氣特征取決于葡萄漿果中的品種香氣成分， 這些品種香氣成分在葡萄果實(shí)中絕大多數(shù)以糖苷結(jié)合態(tài)的形式存在[1]。結(jié)合態(tài)芳香物質(zhì)不具有揮發(fā)性，無氣味，只有經(jīng)過釀酒過程中的酶促水解釋放出游離態(tài)的香氣成分， 才能表現(xiàn)出典型的香氣特征[2-3]。 香氣糖苷酶促水解過程中的關(guān)鍵酶是β-葡萄糖苷酶[4-6]。 葡萄漿果與釀酒酵母是釀酒過程中β-葡萄糖苷酶的兩大重要來源，其典型的釀酒環(huán)境，高糖、高酸、高酒精度、高含量多酚成分，對(duì)這兩個(gè)來源的β-葡萄糖苷酶活性有很強(qiáng)抑制作用， 因此釀造過程中大多數(shù)風(fēng)味前體物未被釋放[7-9]，尤其對(duì)于不完全成熟的原料。添加外源糖苷酶，促進(jìn)香氣糖苷的水解，受到釀酒師們的關(guān)注。

一些商業(yè)酶制劑被開發(fā)出來應(yīng)用于葡萄酒的釀造過程，主要用于提高出汁率、澄清、增加香氣等。 目前， 應(yīng)用于葡萄酒釀造的酶制劑主要從真菌、霉菌中分離提取，例如AR2000 糖苷酶制劑來源于黑曲霉。 商業(yè)糖苷酶制劑中β-葡萄糖苷酶是其關(guān)鍵酶， 然而它們?nèi)允且恍┓翘禺愋云暇厶敲傅幕旌衔铮诖龠M(jìn)香氣糖苷水解的同時(shí)，可能會(huì)水解色素糖苷， 少量存在的肉桂酸酯酶還會(huì)水解酚酸類糖苷，增加揮發(fā)性酚類含量，帶來不良?xì)馕禰10-11]。大量研究表明， 某些非釀酒酵母菌株 （non-Saccharomyces）具有高活性的β-葡萄糖苷酶，它們?cè)谄咸丫凭凭l(fā)酵過程中的活動(dòng)， 能夠調(diào)整活性香氣成分的含量，增加葡萄酒風(fēng)味的復(fù)雜性[2，11-15]。有關(guān)優(yōu)選非釀酒酵母菌株β-葡萄糖苷酶分離提取步驟的優(yōu)化研究鮮有報(bào)道， 影響了優(yōu)選非釀酒酵母菌株及其β-葡萄糖苷酶增香釀造特異性的理論分析。

本研究前期工作篩選獲得一株高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的葡萄汁有孢漢遜酵母， 其糖苷粗酶提取液具有很好的釀酒環(huán)境適應(yīng)性[16]。 本文研究該優(yōu)選菌株β-葡萄糖苷酶的提取與純化步驟，優(yōu)化設(shè)計(jì)一套優(yōu)選菌株β-葡萄糖苷酶的提取純化工藝，為研究該酶的酶學(xué)特性和釀造特性提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 優(yōu)選菌株

非釀酒酵母菌株為西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院釀造與風(fēng)味實(shí)驗(yàn)室篩選的葡萄汁有孢漢遜酵母， 中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏編號(hào)CCTCC NO：M 2013658。

1.2 儀器與試劑

儀器：UV-2450 紫外分光光度計(jì)、AUY220 電子分析天平，日本島津公司；HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋， 國(guó)華電器有限公司；5804R 臺(tái)式冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf 公司；RC5CPLUS 冷凍高速離心機(jī)，美國(guó)Sorvall 公司；pHS-3C 精密pH 計(jì)，上海雷磁儀器廠；HZQ-F160 全溫振蕩培養(yǎng)箱，哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；TH-500 梯度混合儀、1.6 cm×50 cm 和1.0 cm×40 cm 層析柱、HD-A 層析圖譜采集分析儀、HD-2 核酸蛋白檢測(cè)儀、BT-100 恒流泵，上海滬西分析儀器有限公司。

試劑：考馬斯亮藍(lán)G-250，美國(guó)USB 公司；丙烯葡聚糖凝膠S-200 HR、二乙基氨乙基高流速離子型瓊脂糖凝膠（DEAE -Sepharose-FF），上海源葉生物科技有限公司；溴甲酚綠、對(duì)硝基苯-β-D-葡萄糖苷、對(duì)硝基苯酚，美國(guó)Sigma 公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris）、聚乙二醇20000（PEG），北京索萊寶科技有限公司；酵母浸粉、蛋白胨、葡萄糖、氯化鋇、瓊脂、吐溫8.0、碳酸氫鈉、氯化鐵、硫酸錳、無水碳酸鈉、氯化鈣、鹽酸、一水合檸檬酸、無水乙醇、氫氧化鈉、十二水磷酸氫二鈉、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）、磷酸、氯化鈉、氯化鉀、乙酸鈉、乙酸、甲醇、硫酸鎂、硝酸銨、磷酸二氫鉀等常規(guī)試劑，購(gòu)于天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

1.3 酶活的細(xì)胞定位

優(yōu)選菌株在YEPD 液體培養(yǎng)基[17]上活化擴(kuò)增后，接入未加吐溫的YEP 培養(yǎng)基[18]中培養(yǎng)72 h，取2 mL 菌液離心10 min（4 ℃，10 000 r/min）得到菌體和菌液上清液。 菌體用0.15 mol/L 氯化鈉溶液清洗2 次得到完整細(xì)胞。 將完整細(xì)胞懸浮在2 mL PBS buffer（NaCl 140 mmol/L， KCl 2.7 mmol/L， Na2HPO410 mmol/L， KH2PO4 1.8 mmol/L，pH 7.4）中，振幅為80 的超聲波下破碎20 min，后離心10 min（4 ℃，10 000 r/min）得破碎上清液和破碎沉淀，β-葡萄糖苷酶活性采用pNPG 法測(cè)定[19]。

1.4 菌株發(fā)酵培養(yǎng)和粗酶液制備

用YEPD 培養(yǎng)基28 ℃、140 r/min 條件下振蕩擴(kuò)增培養(yǎng)72 h 后的菌液接入YEP 培養(yǎng)基，分別用8 層紗布和封口膜封口，28 ℃，150 r/min 條件下?lián)u床培養(yǎng)，每24 h 進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并測(cè)定酶活，觀察144 h，研究通氧和厭氧條件下菌體增殖及產(chǎn)酶量的差異，確定最佳培養(yǎng)時(shí)間。

將優(yōu)化培養(yǎng)條件下發(fā)酵得到的菌液進(jìn)行離心處理， 收集的上清液， 對(duì)離心處理?xiàng)l件中溫度（4℃和20 ℃）、時(shí)間（10 min 和20 min）和轉(zhuǎn)速（8 000 r/min 和10 000 r/min）3 個(gè)因素各設(shè)置2 個(gè)水平，將上清液酶活性作為評(píng)價(jià)指標(biāo)， 確定最佳的提取條件。其中，離心處理組1 的離心條件為20 ℃、10 min、8 000 r/min； 離心處理組2 的離心條件為20℃、10 min、10 000 r/min； 離心處理組3 的離心條件為20 ℃、20 min、8 000 r/min； 離心處理組4 的離心條件為20 ℃、20 min、10 000 r/min； 離心處理組5 的離心條件為4 ℃、10 min、8 000 r/min；離心處理組6 的離心條件為4 ℃、10 min、10 000 r/min；離心處理組7 的離心條件為4 ℃、20 min、8 000 r/min； 離心處理組8 的離心條件為4 ℃、20 min、10 000 r/min。

1.5 硫酸銨鹽析沉淀

確定pH 值：取6 個(gè)離心管，每管裝粗酶液4 mL，調(diào)整各管的pH 值分別為3.0～8.0，4 ℃冰箱放置2 h，10 000 r/min 條件下離心10 min，等體積檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液溶解沉淀， 測(cè)定各管酶活，確定粗酶液最適pH 值。

確定鹽析濃度：取8 個(gè)離心管加入粗酶液10 mL， 分別加入硫酸銨使其飽和度達(dá)到20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，4 ℃下靜置過夜，離心（4 ℃，10 000 r/min，10 min）分別收集上清液和沉淀，沉淀用等體積最適pH 值的乙酸-乙酸鈉緩沖液溶解，測(cè)定上清液和沉淀的β-葡萄糖苷酶活性和蛋白質(zhì)含量（考馬斯亮藍(lán)法），確定最佳鹽析濃度。

1.6 層析純化

上述蛋白的鹽析沉淀用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液（pH 5.0）溶解后裝入透析袋，采用0.05 mol/L 乙酸-乙酸鈉溶液（pH 5.0）4 ℃下透析除鹽，每隔2 h 更換透析液，用硫酸鋇檢測(cè)脫鹽效果。 脫鹽酶液用PEG20000 濃縮至2 mL， 加入DEAESepharose-FF 層析柱 （pH 6.5 緩沖溶液平衡），首先用5 倍柱體積的緩沖液洗脫至基線平穩(wěn)， 然后用含0～1mol/L 氯化鈉的同種緩沖液梯度洗脫，流速為1.0 mL/min， 待檢測(cè)有蛋白峰出現(xiàn)時(shí)收集洗脫液，每5 min 收集1 管，測(cè)定各管β-葡萄糖苷酶活性，酶活性較高的部分合并，用PEG20000 再次濃縮至2 mL。 加到緩沖溶液平衡好的Sephacry1 S-200 葡聚糖凝膠層析柱中，緩沖溶液洗脫，流速為0.4 mL/min，待有蛋白峰出現(xiàn)時(shí)開始收集，5 min收集1 管。測(cè)定各蛋白峰的酶活，最高峰即為目的蛋白。

1.7 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)的圖表分析采用Excel 2007 軟件（Microsoft Office 2007 辦公軟件， 美國(guó)微軟）處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 β-葡萄糖苷酶活性定位

目前有關(guān)微生物提取純化β-葡萄糖苷酶的研究大多集中在霉菌、乳酸菌、酒酒球菌和釀酒酵母上，有關(guān)非釀酒酵母的報(bào)道很少[1，20-22]，直接對(duì)β-葡萄糖苷酶進(jìn)行活性定位的報(bào)道更少， 相關(guān)報(bào)道均是通過離心獲取粗酶液， 間接表達(dá)其為胞外酶[1，5，8]。本試驗(yàn)利用超聲波破碎法對(duì)葡萄汁有孢漢遜酵母所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶進(jìn)行初步定位，結(jié)果如圖1 所示， 菌液上清液中的酶活明顯高于其他樣品， 說明在葡萄汁有孢漢遜酵母產(chǎn)生的絕大部分β-葡萄糖苷酶都分泌到胞外，該酶是胞外酶，可通過離心提取粗酶液， 試驗(yàn)結(jié)果與目前運(yùn)用離心取上清液提取釀酒酵母及非釀酒酵母中的β-葡萄糖苷酶的主流方法一致。 相比通過細(xì)胞破碎獲取酒酒球菌[6，22]、乳酸菌[1，5]及霉菌[20-21]所產(chǎn)胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶的方法，葡萄汁有孢漢遜酵母所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的提取條件及所需設(shè)備更為簡(jiǎn)便， 更適于工業(yè)生產(chǎn)。

圖1 葡萄汁有孢漢遜酵母β-葡萄糖苷酶酶活定位Fig.1 Enzyme localization of H.uvarum

2.2 β-葡萄糖苷酶最佳培養(yǎng)及提取條件

試驗(yàn)利用封口膜和紗布分別為葡萄汁有孢漢遜酵母營(yíng)造厭氧和通氧的培養(yǎng)條件， 培養(yǎng)結(jié)果見圖2。由圖2（a）可知，紗布組與封口膜組細(xì)胞數(shù)變化規(guī)律基本相同，不同之處在于紗布組48 h 達(dá)最大值，而封口膜組在72 h 達(dá)最大值，紗布組達(dá)最大值后細(xì)胞數(shù)減少比封口膜組緩慢。圖b 可見，兩組酶活變化規(guī)律也基本相同，均在72 h 達(dá)到酶活最大值， 但紗布組最大值明顯高于封口膜組。 因此，選用紗布封口（即通氧條件）更適于葡萄汁有孢漢遜酵母發(fā)酵培養(yǎng)，最佳培養(yǎng)時(shí)間為72 h。

圖2 厭氧、通氧條件下葡萄汁有孢漢遜酵母細(xì)胞生長(zhǎng)（a）和酶活變化（b）曲線Fig.2 Cell growth curve （a）and β-glucosidase activity curve （b）of H. uvarum at anaerobic and oxygenation conditions

從培養(yǎng)時(shí)間看， 葡萄汁有孢漢遜酵母在72 h時(shí)達(dá)到培養(yǎng)液中最大的β-葡萄糖苷酶酶活，比文獻(xiàn)中其他菌種的培養(yǎng)時(shí)間明顯縮短[5-8，21，23]。 雖然YEPD 培養(yǎng)基中釀酒酵母最大β-葡萄糖苷酶酶活的培養(yǎng)時(shí)間與非釀酒酵母相似[3，12]，但其所產(chǎn)糖苷酶在典型釀酒環(huán)境下的活性較低。 不同離心條件下β-葡萄糖苷酶的相對(duì)酶活關(guān)系如圖3 所示，可見不同處理的酶活相差很大，處理6（4 ℃、10 000 r/min，10 min）所得酶液中β-葡萄糖苷活性最高，即為該酶的最佳提取條件。

2.3 β-葡萄糖苷酶純化

圖4 所示不同pH 值緩沖液下酶液中β-葡萄糖苷酶的活性，可見優(yōu)選酵母分泌的β-葡萄糖苷酶的最適pH 值為5.0（見圖4），所以確定硫酸銨沉淀所用緩沖液pH 值為5.0。 而后進(jìn)行硫酸銨濃度梯度試驗(yàn)，確定沉淀所需最佳硫酸銨飽和度，由圖5 可知， 當(dāng)硫酸銨的飽和度達(dá)80%時(shí)沉淀中的β-葡萄糖苷酶活性最高， 確定用80%硫酸銨進(jìn)行初步沉淀。

圖3 不同離心條件下β-葡萄糖苷酶酶活Fig.3 Enzyme activity at different centrifuge conditions

硫酸銨溶液沉淀的β-葡萄糖苷酶通過兩次不同的層析進(jìn)一步純化， 由圖6a 可見，DEAESepharose-FF 離子交換層析的整個(gè)洗脫過程出現(xiàn)3 個(gè)主要的酶活變化峰，當(dāng)洗脫液中氯化鈉濃度達(dá)到0.45 mol/L 時(shí)，2 號(hào)峰對(duì)應(yīng)餾分中β-葡萄糖苷酶的活性最高。 Sephacry1 S-200 葡聚糖凝膠層析純化結(jié)果如圖6b 所示，整個(gè)洗脫過程有2 個(gè)酶活變化峰，2 號(hào)峰對(duì)應(yīng)餾分的酶活最高， 因此該峰對(duì)應(yīng)的餾分為純化的β-葡萄糖苷酶酶液。

圖4 pH 對(duì)β-葡萄糖苷酶活影響Fig.4 The effect of pH on β-glucosidase activity

圖5 硫酸銨飽和度對(duì)β-葡萄糖苷酶沉淀的影響Fig.5 Effect of ammonium sulfate saturation on enzyme precipitation

圖6 β-葡萄糖苷酶離子交換層析（a）和葡聚糖凝膠層析（b）Fig.6 Ion-exchange chromatography （a）and gel filtration （b）of β-glucosidase

經(jīng)純化所得β-葡萄糖苷酶的酶液在各步驟中的純化收得率分析見表1，與粗酶液相比，純化酶液中β-葡萄糖苷酶的酶活提高了24.56 倍，酶的回收率為6.91%。 本試驗(yàn)結(jié)果比Dong M[22]、Guo Y[23]、Gao L[24]等的純化效果較好，但本試驗(yàn)中β-葡萄糖苷酶的回收率只有6.91%， 有待進(jìn)一步研究提高。

表1 純化收得率表Table 1 Purification protocol for the β-glucosidase

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以優(yōu)選葡萄汁有孢漢遜酵母β-葡萄糖苷酶為試驗(yàn)對(duì)象， 利用超聲波破碎法對(duì)其進(jìn)行活性定位， 并對(duì)提取純化各步進(jìn)行摸索確定最佳條件。 結(jié)果顯示，葡萄汁有孢漢遜酵母β-葡萄糖苷酶為胞外酶，可通過離心直接提取。其最佳培養(yǎng)及提取工藝為： 紗布封口發(fā)酵培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)72 h，在4 ℃，10 000 r/min 條件下離心10 min。 該酶經(jīng)過80%硫酸銨鹽析、 陰離子交換層析與凝膠層析三步純化，β-葡萄糖苷酶活性提高了24.56倍，酶的回收率為6.91%。