趙彥芬 趙峰 劉鵬森

(河南省中醫(yī)院河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科，河南 鄭州 450002)

目前，缺血性心臟病是世界范圍內(nèi)主要引起致死致殘的心血管疾病〔1〕。心肌缺血/再灌注(I/R)損傷引起的心肌細胞凋亡和壞死，是進一步加速心功能不全、心室重構(gòu)甚至心力衰竭的原因之一〔2〕。研究報道，抑制細胞凋亡可以減輕心肌損傷，減少心肌細胞的丟失，并改善由I/R引起的心室收縮功能障礙〔3〕。心肌缺血最典型的特征是嚴重缺氧，導(dǎo)致大量自由基產(chǎn)生，細胞內(nèi)鈣超載，炎癥增加，能量耗竭和離子穩(wěn)態(tài)失衡，最終導(dǎo)致心肌細胞死亡。再灌注也會產(chǎn)生大量氧化應(yīng)激產(chǎn)物，引發(fā)線粒體氧化應(yīng)激、鈣超載和線粒體膜去極化等，誘導(dǎo)促凋亡蛋白釋放，最終導(dǎo)致心肌細胞凋亡和死亡〔4，5〕。右美托咪定(Dex)是一種受體激動劑，在臨床上廣泛應(yīng)用于心血管疾病患者手術(shù)的鎮(zhèn)靜及鎮(zhèn)痛〔6〕。普遍認為Dex能夠通過降低心肌耗氧，抑制交感中樞活動，改善心肌供養(yǎng)平衡等對心肌起到保護作用〔7〕。研究表明，Dex通過抑制NOD樣受體家族CARD結(jié)構(gòu)域包含分子(NLRC)5基因缺陷性小鼠的炎癥和氧化應(yīng)激來預(yù)防肝臟I/R損傷〔8〕。研究指出，Dex通過調(diào)控相關(guān)分子及信號通路保護心肌細胞免受缺氧/復(fù)氧(H/R)損傷〔9，10〕。p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路是細胞中眾多信號通路的中轉(zhuǎn)站，參與細胞增殖、凋亡等多種生物學(xué)過程。研究顯示，p38MAPK信號通路在心肌發(fā)生I/R時被廣泛激活〔11〕。但Dex是否通過p38MAPK信號通路對H/R損傷心肌細胞起保護作用未見報道。本研究通過p38MAPK信號通路抑制劑觀察p38MAPK信號通路在Dex預(yù)處理保護心肌細胞H/R損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 大鼠心肌細胞H9c2購自上海中喬生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclon公司；胎牛血清購自上海依科賽生物制品有限公司；鹽酸Dex(200 μg/2 ml)購自江蘇恒瑞醫(yī)療有限公司；細胞計數(shù)試劑盒(CCK-8)細胞活力檢測試劑盒、p38MAPK信號通路特異性抑制劑SB203580購自碧云天生物技術(shù)研究所；Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；磷酸化(p)-p38MAPK一抗、細胞色素(Cyt)C一抗、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(酶切Caspase)-3一抗美國Santa Cruz公司；β-actin抗體、辣根過氧化物酶標記的二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2細胞培養(yǎng) 心肌細胞H9c2培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(含1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)中，置于5%CO2、95%空氣、37℃培養(yǎng)箱中，每隔1 d更換1次培養(yǎng)基，觀察細胞生長匯合度達85%～90%時進行傳代培養(yǎng)。

1.3細胞分組 對數(shù)生長期的H9c2細胞隨機分為5組：(1)空白對照組，不做任何處理，正常培養(yǎng)的細胞；(2)H/R組，將原培養(yǎng)基緩慢棄掉，以磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞3次，換成無血清培養(yǎng)基，將細胞置于95% N2和5% CO2環(huán)境中缺氧處理2 h，然后將培養(yǎng)基更換成含胎牛血清的正常培養(yǎng)基，置于常規(guī)培養(yǎng)箱中復(fù)氧處理4 h；(3)Dex預(yù)處理(Dex+H/R)組，Dex預(yù)處理6 h，再進行H/R處理；(4)抑制劑SB203580(H/R+SB)組，培養(yǎng)液中添加含終濃度為10 μmol/L SB203580進行處理；(5)Dex預(yù)處理+SB203580(Dex+H/R+SB)組，Dex預(yù)處理6 h，再進行H/R處理，同時在培養(yǎng)液中添加含終濃度為10 μmol/L SB203580處理。

1.4CCK-8檢測細胞活力 將心肌細胞H9c2接種于96孔板中，接種密度為6×103，置37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h，按照上述處理方法分組處理細胞后，棄去舊培養(yǎng)基，用PBS清洗3次，分別在每孔細胞中加入100 μl無血清培養(yǎng)基和10 μl CCK-8試劑，置37℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)2 h，用酶標儀檢測波長為450 nm處各孔細胞吸光度(OD)值。細胞活力(%)=(實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.5檢測培養(yǎng)液中LDH、CK含量 收集實驗后各組培養(yǎng)液，參照LDH和CK檢測試劑盒操作說明書分別檢測培養(yǎng)液中LDH和CK含量。

1.6測定細胞中MDA、SOD和GSH-Px活性 按照上述方法對H9c2細胞分組處理，實驗結(jié)束后收集各組細胞，采用反復(fù)凍融法破碎細胞，離心收集上清，分別按照MDA、SOD和GSH-Px測定試劑盒說明書進行操作，采用分光光度計檢測OD值，分別計算各組細胞中MDA、SOD和GSH-Px活性。

1.7各組細胞凋亡率檢測 收集各組處理后的H9c2細胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細胞2次，用1倍結(jié)合緩沖液重懸細胞，調(diào)整細胞密度為5×108個/L。分別加入Annexin Ⅴ-FITC和PI各5 μl，混勻后避光孵育15 min。再添加1倍結(jié)合緩沖液500 μl，上流式細胞儀檢測，統(tǒng)計各組細胞凋亡率。

1.8Western印跡檢測細胞中p-p38MAPK、CytC和酶切Caspase-3蛋白表達水平 收集各組處理后的H9c2細胞，加入RIPA蛋白裂解液，提取細胞中總蛋白。聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法對蛋白進行定量，以聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，以半干法將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉中封閉2 h，分別加入一抗雜交，其中p-p38MAPK一抗1∶500稀釋，CytC一抗1∶500稀釋，酶切Caspase-3一抗1∶800稀釋，4℃過夜反應(yīng)。TBST洗膜3次后加入辣根過氧化酶標記的二抗1∶2 000稀釋，室溫反應(yīng)1 h。TBST洗膜3次后以化學(xué)發(fā)光法(ECL)檢測。掃描后以Quantity One圖像分析軟件分析，以β-actin標化，以二者的比值表示各組細胞中p-p38MAPK、CytC和酶切Caspase-3蛋白表達水平。

1.9統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析及SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組H9c2細胞活力比較 與空白對照組(100.00%)相比，H/R組心肌H9c2細胞活力(21.23%±1.86%)顯著降低(P<0.05)；與H/R組比，Dex+H/R組、H/R+SB組細胞活力(53.27%±3.69%、47.31%±4.03%)顯著升高(P<0.05)；與Dex+H/R組和H/R+SB組比，Dex+H/R+SB組細胞活力(89.49%±6.55%)顯著升高(P<0.05)。

2.2各組心肌細胞凋亡率比較 與空白對照組H9c2細胞凋亡率〔(8.65±0.91)%〕相比，H/R組〔(37.26±4.02)%〕顯著升高(P<0.05)；與H/R組相比，Dex+H/R組〔(19.33±1.84)%〕和H/R+SB組〔(21.01±2.62)%〕明顯降低(P<0.05)；與Dex+H/R組和H/R+SB組比，Dex+H/R+SB組〔(10.16±0.97)%〕明顯降低(P<0.05)，見圖1。

圖1 流式細胞儀檢測各組H9c2細胞凋亡情況

2.3各組LDH、CK比較 與空白對照組比較，H/R組LDH和CK含量顯著升高(P<0.05)；與H/R組比較，Dex+H/R組和H/R+SB組明顯減少(P<0.05)；與Dex+H/R組和H/R+SB組比較，Dex+H/R+SB組顯著減少(P<0.05)，見表1。

表1 各組LDH和CK含量比較

1)與空白對照組、2)與H/R組、3)與Dex+H/R組、4)與H/R+SB組比較：均P<0.05；同表2，表3

2.4各組MDA含量及SOD、GSH-Px活性比較 與空白對照組比較，H/R組H9c2細胞中MDA含量顯著升高，SOD和GSH-Px活性顯著降低(P<0.05)；與H/R組比較，Dex+H/R組和H/R+SB組MDA含量顯著降低，SOD和GSH-Px活性顯著升高(P<0.05)；與Dex+H/R組和H/R+SB組比較，Dex+H/R+SB組MDA含量顯著降低，SOD和GSH-Px活性顯著升高(P<0.05)，見表2。

表2 各組MDA含量及SOD、GSH-Px活性比較

2.5各組p-p38MAPK、CytC和酶切Caspase-3蛋白表達水平比較 與空白對照組比較，H/R組心肌H9c2細胞中p-p38MAPK、CytC和酶切Caspase-3蛋白表達水平顯著上調(diào)(P<0.05)；與H/R組比較，Dex+H/R組和H/R+SB組均明顯降低(均P<0.05)；與Dex+H/R組和H/R+SB組比，Dex+H/R+SB組均明顯下調(diào)(均P<0.05)，見圖2，表3。

圖2 各組p-p38MAPK、CytC和酶切Caspase-3蛋白水平

組別p-p38MAPKCytC酶切Caspase-3空白對照組0.40±0.050.31±0.030.46±0.05H/R組1.11±0.091)1.13±0.081)1.08±0.081)Dex+H/R組0.78±0.082)0.66±0.072)0.75±0.072)H/R+SB組0.73±0.072)0.64±0.052)0.71±0.082)Dex+H/R+SB組0.52±0.063)4)0.44±0.053)4)0.55±0.053)4)

3 討 論

心臟缺血再灌注是制約缺血性心臟病等心血管疾病患者治療和預(yù)后的主要因素〔12〕。研究表明，Dex可減輕心肌I/R損傷，對心肌起到保護作用〔13〕。本研究結(jié)果提示Dex預(yù)處理能夠緩解H/R誘導(dǎo)的細胞損傷。此外，本研究發(fā)現(xiàn)Dex預(yù)處理的H9c2細胞培養(yǎng)液中LDH和CK漏出量減少，細胞中MDA含量減少，SOD和GSH-Px活性升高。其中LDH和CK是細胞內(nèi)酶，心肌細胞受損可導(dǎo)致LDH和CK漏出，因此LDH和CK的漏出量可在一定程度上反映細胞受損程度〔14〕。本實驗結(jié)果表明，Dex能夠減輕心肌細胞H/R損傷。有證據(jù)表明，氧化應(yīng)激有助于心肌I/R損傷的發(fā)展〔15，16〕。內(nèi)源性防御系統(tǒng)主要是抗氧化酶系統(tǒng)(涉及SOD和GSH-Px)，對于減輕I/R引起的損傷至關(guān)重要〔17〕。心肌I/R損傷后SOD和GSH-Px的活性顯著降低〔18〕。MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，并且在心肌I/R損傷后心肌組織中增加〔19〕。本研究顯示Dex在H/R后抑制H9c2細胞中的氧化應(yīng)激。因此，Dex的抗氧化活性有助于對心肌I/R損傷保護。

細胞凋亡是一種活躍的基因?qū)蚣毎劳龅倪^程，其在心肌再灌注損傷中起關(guān)鍵作用。Caspase-3是一種半胱氨酸蛋白酶，在細胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用〔20〕。CytC是一種導(dǎo)致線粒體凋亡的相關(guān)蛋白，介導(dǎo)細胞內(nèi)死亡信號，誘導(dǎo)細胞經(jīng)內(nèi)源性凋亡途徑發(fā)生細胞凋亡〔21〕。H/R已被證明可引起心肌細胞凋亡，誘導(dǎo)CytC表達上調(diào)，同時激活Caspase-3〔22〕。本研究顯示，Dex的抗凋亡活性可能有助于對心肌I/R的損傷保護。心肌I/R與MAPK活化有關(guān)。Walshe等〔23〕研究報道，膿毒癥通過MAPK依賴機制保護心肌和其他器官免受隨后的I/R損傷。有研究表明，在I/R損傷后，p38MAPK的靶向抑制減少了心肌細胞凋亡并改善了心臟功能〔24〕。使用p38抑制劑SB203580預(yù)處理可改善I/R后大鼠心臟功能，施加木犀草素能夠增強大鼠心臟和心肌細胞I/R期間的收縮/舒張功能〔25〕。本研究表明，Dex可以通過抑制H9c2細胞中的p38MAPK信號傳導(dǎo)途徑起到心臟保護作用。