楊虹 成靜 陳芳 高貽鈞 盧軍 王凌

(1武漢市第四醫(yī)院 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬普愛醫(yī)院急診科，湖北 武漢 430034；2華中農(nóng)業(yè)大學(xué))

心搏驟停(CA)是世界范圍內(nèi)主要急診死亡原因之一，每年有超過45萬人發(fā)生CA〔1〕。隨著心肺復(fù)蘇(CPR)術(shù)逐步得到推廣和普及，患者經(jīng)復(fù)蘇后自主循環(huán)恢復(fù)(ROSC)得到提高，但存活率依然很低〔2〕。CA后ROSC主要的病理生理變化是缺血再灌注損傷，造成全身炎癥反應(yīng)及凝血功能障礙，進(jìn)一步形成多器官損傷〔3～5〕，特別是腦損傷。丁苯酞(NBP)有抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗細(xì)胞凋亡、抑制心肌細(xì)胞肥大、對心臟內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)等廣泛藥理作用〔6〕，對急性腦缺血具有明顯的治療作用〔7，8〕，并已證明在一定程度上可減輕多器官損傷〔9〕。本研究欲探討NBP對老年兔CA復(fù)蘇后多器官的保護(hù)作用。

1 材料與儀器

1.1實(shí)驗(yàn)動物 選用30月齡體重為3.0～3.5 kg的清潔級健康家兔48只，性別不限，購于湖北逸摯誠生物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證SYXK(鄂)2016-0088。動物置于(25±1)℃，相對濕度為(50±10)%，白天黑夜各12 h的清潔級環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，自由進(jìn)食、飲水。

1.2主要試劑與實(shí)驗(yàn)儀器 NBP(石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H20100041，規(guī)格100 ml∶25 mg)，腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6、血清神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、S-100B酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(美國R&D公司)，DXC-800全自動生化分析儀(美國貝克曼庫爾特公司)，致顫儀及動物胸外按壓設(shè)備(由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)輔助研發(fā)，動物胸外按壓設(shè)備申請專利號：201820076129.4)，SAR-830A小動物呼吸機(jī)(美國CWE公司)，mindray BeneHeartD3除顫儀監(jiān)護(hù)儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)，一次性氣管插管導(dǎo)管及配套導(dǎo)絲(河南駝人醫(yī)療器械集團(tuán)有限公司)。

1.3動物準(zhǔn)備 所有實(shí)驗(yàn)動物耳緣靜脈穿刺置入24G Y型靜脈留置針，置管成功后注射3%戊巴比妥30 mg/kg予以麻醉。麻醉成功后將動物固定后行胸腹部備皮，連接三通開關(guān)，一端連接含有肝素(5 IU/ml)抗凝的生理鹽水輸液器，防止血液凝固，另一端經(jīng)換能器與心電監(jiān)護(hù)儀相連。將2.5號氣管插管導(dǎo)管自兔口角緩慢置入，導(dǎo)管遠(yuǎn)端到門齒的距離為11～12 cm。手術(shù)操作完成并穩(wěn)定后，記錄肛溫(T)、心率(HR)、呼吸頻率(RR)、平均動脈壓(MAP)、等容收縮期左心室內(nèi)壓力上升的最大速率(dp/dtmax)、等容舒張期左心室內(nèi)壓力下降的最大速率(-dp/dtmax)。

1.4動物模型建立 將欲建模動物置入2個電極，一個置入皮下(位于心搏最強(qiáng)點(diǎn))，另一個置于食管內(nèi)，應(yīng)用致顫儀持續(xù)交流電(10 V，4 mA，2 min)經(jīng)食管致顫。致顫成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)：①電刺激后動脈收縮壓逐漸下降至25 mmHg以下；②血壓監(jiān)測的動脈搏動波形消失；③停止電刺激后心電監(jiān)護(hù)示心電圖波形為室顫。致顫成功后無處理心室顫動6 min后，開始應(yīng)用動物胸外按壓設(shè)備進(jìn)行機(jī)械胸外按壓，按壓部位為胸骨體正中，頻率為200次/min，按壓深度為胸廓前后徑的1/3，按壓/放松比為1/1，并同步機(jī)械通氣，盡早給予雙向波經(jīng)胸體外除顫。機(jī)械通氣接小型動物呼吸機(jī)。呼吸機(jī)初始參數(shù)設(shè)定頻率為45次/min，潮氣量10 ml/kg。開始CPR的即刻耳緣靜脈注射腎上腺素0.15 mg/kg，必要時每間隔3 min重復(fù)應(yīng)用。待除顫儀準(zhǔn)備完全后若為室顫，則予非同步雙相波10 J除顫，若不能轉(zhuǎn)復(fù)為自主心律則再繼續(xù)按壓2 min后再次予10 J除顫，直至ROSC。當(dāng)恢復(fù)竇性HR及MAP>40 mmHg并至少持續(xù)1 min以上視為復(fù)蘇成功。動物經(jīng)上述程序搶救30 min自主循環(huán)未能恢復(fù)者為復(fù)蘇失敗，對復(fù)蘇失敗者移除所在組別。對ROSC的動物進(jìn)行心電和血流動力學(xué)監(jiān)測，自主呼吸微弱者進(jìn)行機(jī)械通氣，自主呼吸恢復(fù)后拔除所有導(dǎo)管，放回籠中飼養(yǎng)，對于不能自主飲水、進(jìn)食的動物，在ROSC后每12 h經(jīng)耳緣靜脈緩慢補(bǔ)充5%葡萄糖氯化鈉溶液20 ml/kg，觀察終點(diǎn)為72 h。

1.5實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為①CA復(fù)蘇(CA)組(n=24)，將動物麻醉后，行氣管插管，心電監(jiān)護(hù)，有創(chuàng)血壓監(jiān)測，并致顫及CPR建模，建模及復(fù)蘇成功后觀察至72 h；②NBP干預(yù)(NBP)組(n=24)，將動物麻醉后，行氣管插管，心電監(jiān)護(hù)，有創(chuàng)血壓監(jiān)測，并致顫及CPR建模成功后立即耳緣靜脈注射NBP 5 ml/d。建模及復(fù)蘇成功并注射藥物后觀察至72 h。

1.6標(biāo)本的采集檢測和神經(jīng)功能學(xué)評分 CA組及NBP組完成預(yù)設(shè)處理后，分別于CA前、ROSC后12 h、24 h、72 h采血和進(jìn)行神經(jīng)功能評分。血清NSE、S-100B的水平按ELISA試劑盒說明進(jìn)行檢測。血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌鈣蛋白(cTn)I的水平用全自動生化分析儀檢測。神經(jīng)功能評分由2名非本實(shí)驗(yàn)組成員，參照J(rèn)ia等〔9〕神經(jīng)功能學(xué)評分(NDS)方法，從意識、基本反射、運(yùn)動、行為等方面對存活兔在ROSC后各時間點(diǎn)進(jìn)行神經(jīng)功能評定，總分0～80分，評分越低，代表腦神經(jīng)功能越差。0分為腦死亡，80分為正常。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0進(jìn)行重復(fù)測量方差分析。

2 結(jié) 果

2.1兩組基礎(chǔ)參數(shù)和誘導(dǎo)室顫情況 在誘導(dǎo)室顫前，兩組兔的體重、HR、血流動力學(xué)參數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。 見表1。

本實(shí)驗(yàn)中的48只家兔全部誘發(fā)室顫成功。在電刺激開始后，動脈血壓迅速下降到25 mmHg以下，搏動波形消失。電刺激結(jié)束時室顫發(fā)生率為100%(48/48)，無無脈性電活動及CA發(fā)生。4例室顫轉(zhuǎn)為無脈性電活動，在CPR開始時心電圖表現(xiàn)為室顫的比例為87.5%(42/48)，無脈性電活動比例為12.5%(6/48)。

2.2兩組腦損傷指標(biāo)變化及NDS評分比較 CA組ROSC后12 h、24 h、72 h血清NSE、S-100B的水平顯著高于CA前，NDS評分顯著低于CA前(P<0.05)。NBP組ROSC后12 h、24 h、72 h NSE、S-100B均比CA組同時間點(diǎn)明顯降低,NDS評分比CA組同時間點(diǎn)明顯升高(P<0.05)。見表2。

2.3兩組器官損傷指標(biāo)變化比較 CA組ROSC后12 h、24 h、72 h血清Cr、BUN、ALT、AST、cTnI的水平顯著高于CA前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CA組ROSC后12 h、24 h血清CK-MB的水平顯著高于CA前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而ROSC后72 h血清CK-MB的水平與CA前比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。NBP組ROSC后12 h、24 h、72 h血清Cr、BUN、ALT、AST的水平均顯著低于同時間點(diǎn)CA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。NBP組ROSC后12 h、24 h血清CK-MB、cTnI水平比同時間點(diǎn)CA組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而NBP組ROSC后72 h血清CK-MB、cTnI水平與同時間點(diǎn)CA組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

組別體重(kg)體溫(℃)HR(次/min)MAP(mmHg)RR(次/min)dp/dtmax-dp/dtmaxCA組2.17±0.7238.53±0.35238±1090±937±45 156±712-3 373±378NBP組2.07±0.6838.24±0.32235±1192±738±65 097±702-3 385±348

指標(biāo)組別CA前ROSC后12 hROSC后24 hROSC后72 hNSE(pg/ml)CA組7.28±0.9522.01±2.211)32.33±1.941)19.67±1.881)NBP組8.35±1.1018.65±0.982)21.68±1.522)14.02±1.622)S-100B(pg/ml)CA 組7.23±2.0217.11±3.681)12.66±2.431)8.24±1.861)NBP組8.66±1.9212.03±1.692)8.63±2.132)7.18±1.622)NDS(分)CA組80.0±0.053.8±3.91)56.8±3.81)68.2±2.51)NBP組80.0±0.065.6±3.52)68.5±4.02)75.3±2.22)

與CA前比較：1)P<0.05；與同時間點(diǎn)CA組比較：2)P<0.05；下表同

不同時間點(diǎn)組別Cr(μmol/L)BUN(μmol/L)ALT(U/L)AST(U/L)CK-MB(U/L)cTnI(μg/L)CA前CA組53.17±4.726.74±1.9343.23±4.2637.92±2.06486.43±39.814.75±0.82NBP組54.68±5.126.57±1.7644.32±4.4739.25±2.54493.68±55.844.54±0.75ROSC 12 h CA組117.28±6.231)13.53±2.821)68.14±5.651)55.64±3.421)722.35±203.121)27.34±2.681)NBP組85.74±3.432)8.67±2.142)51.42±4.152)43.16±3.622)556.63±54.182)13.02±2.472)ROSC 24 h CA組133.42±3.321)22.34±1.691)92.74±4.211)75.43±4.011)2 353.67±443.671)42.05±3.291)NBP組112.39±2.962)14.95±0.992)72.01±3.932)56.46±4.362)1 569.47±113.662)31.05±3.652)ROSC 72 h CA組156.08±4.121)28.65±3.181)186.24±3.651)152.20±3.851)519.88±57.1516.65±2.131)NBP組133.28±4.352)20.45±1.962)150.16±5.552)120.13±3.482)505.50±59.2410.08±1.80

3 討 論

NBP是人工合成的左旋芹菜甲素的消旋體，是臨床用于急性缺血性腦卒中的常用藥物〔7,8〕。心臟驟停4～6 min后便可發(fā)生神經(jīng)元不可逆的損傷〔10〕，Zhang等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)用NBP治療大鼠心搏驟停時能有效提高海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的存活率，它的潛在治療機(jī)制包括內(nèi)皮細(xì)胞免受氧化應(yīng)激、線粒體損傷和隨后的細(xì)胞死亡、增加血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子和缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α的表達(dá)、改善腦微血管、抑制炎癥反應(yīng)、維持神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和形態(tài)，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)〔7，8〕，本研究通過比較CA組和NBP組兩組兔在心搏驟停后不同時間點(diǎn)的NDS評分，也支持上述觀點(diǎn)。NSE和S100B是多種疾病腦損傷的指標(biāo)，可用于準(zhǔn)確地評估CPR后患者的腦損傷嚴(yán)重程度〔12～14〕。本實(shí)驗(yàn)中CA組血清中NSE、S-100B的水平顯著增高，NSE于復(fù)蘇后24 h達(dá)高峰，而S-100B于復(fù)蘇后12 h達(dá)高峰。而在NBP組中，復(fù)蘇后各時間點(diǎn)上述指標(biāo)水平顯著低于CA組，提示NBP對兔心搏驟停后的腦損傷有治療作用。

缺血/再灌注損傷廣泛存在于心搏驟停自主循環(huán)恢復(fù)后心、腦、肝、腎、胃腸道等器官，發(fā)病過程涉及多個凋亡相關(guān)基因〔15，16〕。NBP對凋亡途徑中關(guān)鍵的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3 蛋白發(fā)揮抑制作用，同時NBP還可能通過降低花生四烯酸含量，提高腦血管內(nèi)皮 PGI2 的水平，抑制谷氨酸釋放，降低細(xì)胞內(nèi)鈣濃度，抑制自由基和提高抗氧化酶活性，進(jìn)而阻斷多個缺血/再灌注病理環(huán)節(jié)，進(jìn)而達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的目的。Wang等〔17〕研究結(jié)果表明兔經(jīng)心搏驟停復(fù)蘇后，血清Cr、ALT水平隨復(fù)蘇后時間的推移逐步升高，復(fù)蘇后72 h達(dá)頂峰，與本實(shí)驗(yàn)中Cr、ALT增長趨勢一致。本研究結(jié)果顯示，兔心搏驟停復(fù)蘇后血清Cr、BUN、ALT、AST的水平隨復(fù)蘇后時間的推移逐步升高，在本研究設(shè)置的觀察點(diǎn)中，復(fù)蘇后72 h的水平最高。但并不能因此認(rèn)為復(fù)蘇后72 h是頂峰值，可能在72 h之后的時間里出現(xiàn)頂峰值，而在本研究中因時間點(diǎn)的有限并不能觀察到。本研究中，兔心搏驟停經(jīng)復(fù)蘇后血清CK-MB水平于24 h達(dá)高峰，72 h與CA前無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，cTnI水平于24 h達(dá)峰值，72 h仍未恢復(fù)正常，此兩者變化趨勢與人體無異。NBP干預(yù)組，血清Cr、BUN、ALT、AST水平在復(fù)蘇后12 h、24 h、72 h較之CA組顯著降低，血清CK-MB、cTnI水平在復(fù)蘇后12 h、24 h較CA組顯著降低，與Wang 等〔17〕報道大鼠心肌梗死模型NBP 改善心臟血流動力學(xué)功能和減少心臟梗死面積的結(jié)果較為一致。因此，推斷NBP能夠改善心搏驟停復(fù)蘇后家兔肝腎心的損傷。

本研究受到NBP治療腦梗死取得良好效果的啟發(fā)，在兔心搏驟停復(fù)蘇模型的基礎(chǔ)上，應(yīng)用NBP對其進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示，預(yù)防應(yīng)用NBP對復(fù)蘇后腦、心、肝、腎等多器官損傷具有一定保護(hù)作用，可能是一種潛在的治療心搏驟停和復(fù)蘇的策略。其可能的機(jī)制包括提高缺血區(qū)血流量; 抗氧化減少細(xì)胞凋亡; 改善線粒體腫脹和空泡化〔18〕。雖然本研究的思路是創(chuàng)新性的，但僅抽取血液指標(biāo)和NDS評分來評估NBP對心搏驟停復(fù)蘇后家兔的影響，其行為功能、器官組織形態(tài)是否有所改善，需進(jìn)一步研究。