居來(lái)提·艾買(mǎi)提 阿布都沙拉木·阿布都熱衣木 熱孜萬(wàn)古麗·吐?tīng)柡?/p>

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院 1干部二科，新疆 烏魯木齊 830000；2老年病科)

血管重構(gòu)是高血壓最為關(guān)鍵的病理變化，研究證明，高血壓患者的血管重構(gòu)幾乎影響所有組織器官，高血壓血管重構(gòu)一般為血管膠原重構(gòu)〔1,2〕。機(jī)體血管膠原重構(gòu)是血管對(duì)刺激的復(fù)雜的動(dòng)態(tài)反應(yīng)過(guò)程，最終使血管產(chǎn)生膠原結(jié)構(gòu)和數(shù)量變化〔3〕。研究證實(shí)姜黃素具有十分理想的心血管保護(hù)作用〔4〕。能顯著抑制膠原合成相關(guān)細(xì)胞的功能，大幅度控制膠原含量〔5〕。高血壓血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬水平紊亂與膠原水平存在相關(guān)性〔6〕。本研究觀察姜黃素對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的高血壓模型小鼠血管膠原重構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 采用野生型C57BL/6小鼠，共40只，雄性，鼠齡8 w，體重18～22 g。小鼠均置于有溫控(20～25℃)清潔通風(fēng)的動(dòng)物房中飼養(yǎng)。所有小鼠取材前禁食12 h，自由進(jìn)水。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑 姜黃素、血管緊張素Ⅱ購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、西羅莫司靶蛋白(mTOR)、Bax、Bcl-2及活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved Caspase)-3抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。磷酸化(p)-PI3K、p-AKT及p-mTOR抗體購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.3實(shí)驗(yàn)分組 小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只。對(duì)照組接受磷酸鹽緩沖液(PBS)微量泵注(劑量同血管緊張素Ⅱ組)；血管緊張素Ⅱ組接受血管緊張素Ⅱ微量泵注〔1 500 ng/(min·kg)，7 d〕建立高血壓模型〔7〕；姜黃素組接受姜黃素腹腔注射干預(yù)〔200 mg/(kg·d)，7 d〕〔6〕;雙干預(yù)組接受血管緊張素Ⅱ微量泵注〔1 500 ng/(min·kg)，7 d〕+姜黃素腹腔注射干預(yù)〔200 mg/(kg·d)，7 d〕。

1.4血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)高血壓模型 按照18～22 g體重小鼠灌泵7 d計(jì)算，微量泵釋放血管緊張素Ⅱ的速率為1 500 ng/(min·kg)，每只微量泵可容納90 μl的血管緊張素Ⅱ，計(jì)算出血管緊張素Ⅱ的濃度(288～320 μg/L)。使用異氟烷氣體麻醉小鼠，用干凈的眼科剪剪開(kāi)小鼠背部皮膚約2 mm小口，緩慢地將灌好血管緊張素Ⅱ和PBS的微量泵埋入小鼠皮下，使用眼科線縫合傷口。血管緊張素Ⅱ灌注術(shù)后第4天開(kāi)始監(jiān)測(cè)小鼠血壓，直到術(shù)后第7天，以確定血管緊張素Ⅱ灌注成功。術(shù)后第7天取材。

1.5蘇木素-伊紅(HE)染色 取小鼠主動(dòng)脈進(jìn)行石蠟切片，脫蠟至水干；蘇木素染色2 min；使用PBS沖洗浮色；0.5%鹽酸酒精分化，自來(lái)水沖洗。伊紅染色1 min，使用PBS沖洗浮色；乙醇梯度脫水；石蠟切片固定。中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下照片。HE染色后采用BI2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，40倍顯微鏡下測(cè)定各組小鼠胸主動(dòng)脈中膜厚度(MT)、管腔內(nèi)徑(LD)，按順時(shí)針?lè)较驕y(cè)12個(gè)平均值，并計(jì)算MT/LD。

1.6Masson染色方法 取小鼠主動(dòng)脈進(jìn)行石蠟切片，脫蠟至水干；5%天青石蘭染色5 min，使用PBS沖洗浮色。蘇木素染色3 min，使用PBS沖洗浮色。使用麗春紅∶酸性品紅=1∶2，染色20 min；1%光綠染色4 min；乙醇梯度脫水；石蠟切片固定。中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下照片。石蠟切片進(jìn)行Masson染色，采用BI2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)。

1.7Western印跡 取部分主動(dòng)脈血管組織，加入裂解液，2 h后加入稀釋過(guò)的相應(yīng)抗體(1∶500)，在4℃下過(guò)夜；然后加入二抗并在室溫下孵育1 h，加入發(fā)光底物，通過(guò)Gene Box成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光，并記錄反應(yīng)條帶的數(shù)目，用Quantity One軟件分析同一樣本中蛋白與內(nèi)參甘油醚-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)蛋白條帶的灰度值之比。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組血壓及膠原含量比較 與對(duì)照組相比，血管緊張素Ⅱ組血壓顯著升高(P<0.05)。雙干預(yù)組血壓增幅較低，高血壓進(jìn)展慢于血管緊張素Ⅱ組。姜黃素組血壓與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對(duì)照組相比，血管緊張素Ⅱ組主動(dòng)脈膠原含量顯著增加(P<0.05)。與血管緊張素Ⅱ組相比，雙干預(yù)組主動(dòng)脈膠原含量顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖1、表1。

圖1 各組主動(dòng)脈Masson染色(×40)

組別收縮壓(mmHg)舒張壓(mmHg)膠原纖維含量對(duì)照組99.0±5.070.0±6.013.1±2.2血管緊張素Ⅱ組123.0±9.01)87.0±8.01)32.5±6.51)姜黃素組95.0±6.02)67.0±5.02)19.6±6.72)雙干預(yù)組111.0±12.01)2)89.0±7.01)15.8±3.22)

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與血管緊張素Ⅱ組比較：2)P<0.05；下表同

2.2各組主動(dòng)脈MT、LD及MT/LD比值比較 與對(duì)照組相比，血管緊張素Ⅱ組MT、LD及MT/LD比值顯著升高(P<0.05)。與血管緊張素Ⅱ組比較雙干預(yù)組MT、LD及MT/LD比值顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表2，圖2。

2.3各組自噬相關(guān)蛋白磷酸化水平比較 雙干預(yù)組PI3K、AKT及mTOR表達(dá)含量與血管緊張素Ⅱ組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，p-PI3K、p-AKT及p-mTOR表達(dá)顯著低于血管緊張素Ⅱ組(P<0.05)。見(jiàn)表3、圖3。

2.4姜黃素影響血管自噬終末事件 與對(duì)照組比較，血管緊張素Ⅱ Bcl-2含量顯著增加(P<0.05)，Bax和Cleaved Caspase-3的含量顯著降低(P<0.05)；與血管緊張素Ⅱ組比較，雙干預(yù)組顯著增加Bax和Cleaved Caspase-3的含量(P<0.05)，顯著減少Bcl-2含量(P<0.05)。見(jiàn)表3、圖4。

表2 各組主動(dòng)脈MT、LD及MT/LD比較

圖2 各組主動(dòng)脈染色(HE，×40)

組別PI3KAKTmTORp-PI3Kp-AKTp-mTORBcl-2BaxCleaved Caspase-3對(duì)照組1.6±0.61.3±0.51.2±0.40.9±0.40.5±0.20.4±0.20.6±0.21.2±0.41.4±0.3血管緊張素Ⅱ組1.5±0.81.2±0.41.1±0.31.4±0.51)1.1±0.31)0.9±0.31)1.2±0.51)0.2±0.11)0.2±0.11)姜黃素組1.7±0.51.4±0.31.3±0.51.1±0.42)0.7±0.32)0.1±0.12)0.8±0.32)0.7±0.32)1.1±0.32)雙干預(yù)組1.6±0.71.3±0.41.2±0.20.8±0.22)0.6±0.22)0.3±0.22)0.7±0.12)1.1±0.52)1.2±0.42)

圖3 各組Western印跡法檢測(cè)各組自噬相關(guān)蛋白磷酸化水平

圖4 Western印跡檢測(cè)各組主動(dòng)脈Bax、Cleaved Caspase-3及Bcl-2蛋白

3 討 論

本研究證實(shí)姜黃素能夠顯著降低高血壓病程中的血管膠原重構(gòu)水平，姜黃素干預(yù)改善了包括血管內(nèi)徑及膠原含量在內(nèi)的多項(xiàng)高血壓血管重構(gòu)等相關(guān)指標(biāo)，且姜黃素能夠通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT相關(guān)自噬通路減緩高血壓血管膠原病變。

研究提示，姜黃素低劑量生活干預(yù)能夠調(diào)控患者晝夜血壓節(jié)律，輕度降低血壓及減少高血壓風(fēng)險(xiǎn)〔7,8〕。姜黃素能夠顯著縮小高血壓所致的血管管徑病變。研究雖然提示姜黃素能夠保護(hù)血管系統(tǒng)的穩(wěn)定性，但多數(shù)研究局限于內(nèi)皮功能，本研究補(bǔ)充了姜黃素對(duì)于血管整體穩(wěn)定性的作用，這對(duì)于高血壓治療十分重要〔9,10〕。

主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞自噬水平異常會(huì)直接導(dǎo)致內(nèi)皮功能紊亂，進(jìn)而加劇高血壓病變程度，而靶向敲除自噬相關(guān)基因能夠有效穩(wěn)定血壓〔11,12〕。研究報(bào)道自噬通路分子的低磷酸化可顯著抑制膠原合成〔13〕。本研究發(fā)現(xiàn)姜黃素不能影響PI3K、AKT、mTOR等非磷酸化蛋白表達(dá)，導(dǎo)致該現(xiàn)象的可能原因有：姜黃素劑量不足；高血壓模型建立后干預(yù)時(shí)間較短(7 d)。因此，我們對(duì)自噬下游事件的分子標(biāo)志物進(jìn)行了驗(yàn)證，并發(fā)現(xiàn)姜黃素可增加Bax和Cleaved Caspase-3的含量，并減少Bcl-2的含量，從而證實(shí)了：盡管中等劑量姜黃素干預(yù)僅影響高血壓病變血管的自噬磷酸化水平，但已經(jīng)足夠影響自噬終末事件，從而最終改善血供膠原重構(gòu)水平。

綜上，姜黃素具有高血壓防治潛力，能夠通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT自噬通路的磷酸化水平改善高血壓病變血管的膠原重構(gòu)水平。