劉樹義 李瑜 劉盛澤 劉碧波 蘭凱 陳德平 從長(zhǎng)春

(西安醫(yī)學(xué)院 1外科學(xué)教研室，陜西 西安 710021；2第二附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科；3廈門大學(xué)附屬福州第二醫(yī)院神經(jīng)外科)

椎管內(nèi)神經(jīng)鞘瘤(IS)是最常見的脊髓腫瘤。絕大多數(shù)腫瘤生長(zhǎng)于脊髓外硬脊膜下，但也可見部分腫瘤向椎管外侵犯，呈啞鈴狀生長(zhǎng)，極少數(shù)腫瘤生長(zhǎng)于髓內(nèi)。IS好發(fā)節(jié)段依次為腰骶段、胸段及頸段，常累及脊神經(jīng)感覺根，造成責(zé)任節(jié)段平面以下出現(xiàn)感覺異常等癥狀，嚴(yán)重者可出現(xiàn)尿便失禁。由于IS的發(fā)病機(jī)制尚未被闡明，藥物等非手術(shù)治療手段無法實(shí)施，因此，在顯微鏡下完成腫瘤全切或次全切成為該腫瘤唯一而有效的治療方法。然而，手術(shù)往往伴隨多種并發(fā)癥，在一定程度上影響了患者的預(yù)后和臨床治療滿意度〔1〕。研究表明，腫瘤的生物學(xué)行為受多種微小RNA(miR)的調(diào)控。miR是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性且具有調(diào)控功能的非編碼RNA，其大小為20～25個(gè)核苷酸。其作用機(jī)制主要是通過結(jié)合mRNA而實(shí)現(xiàn)降解或阻遏mRNA翻譯過程這一效應(yīng)〔2〕。研究表明，miR-17-92作為一個(gè)高度保守的基因簇與機(jī)體造血系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、消化系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)等腫瘤的生長(zhǎng)關(guān)系密切〔3～5〕。miR-17-92基因簇由6種成熟的miR組成，包括miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1，且對(duì)腫瘤調(diào)控作用表現(xiàn)為抑癌或促癌效應(yīng)〔6〕。本研究通過檢測(cè)IS組織中miR-17-92的表達(dá)情況，分析其作為生物治療靶點(diǎn)的可能性。

1 資料與方法

1.1臨床資料 收集2016年5月至2018年5月廈門大學(xué)附屬福州第二醫(yī)院收治的20例IS患者腫瘤組織標(biāo)本(實(shí)驗(yàn)組)。 其中男15例，女5例，平均年齡(50.40±10.65)歲。病變節(jié)段：頸段3例，胸段6例，腰段9例，骶段(S1)2例。腫瘤直徑<2.0 cm 5例，≥2.0 cm且<5.0 cm 14例，≥5.0 cm 1例。腫瘤位于髓外硬脊膜下15例，脊髓內(nèi)2例，硬脊膜兩側(cè)即啞鈴型3例。所有患者的首發(fā)癥狀表現(xiàn)為神經(jīng)根性疼痛伴感覺異常，未出現(xiàn)括約肌功能障礙。所有患者臨床資料完整，結(jié)合術(shù)前磁共振成像(MRI)(含增強(qiáng)影像)、術(shù)中確認(rèn)腫瘤起源及術(shù)后病理明確診斷(圖1，圖2)。對(duì)照組12例標(biāo)本取自截肢患者的神經(jīng)組織(主要為腓總神經(jīng))。本研究所有程序經(jīng)過廈門大學(xué)附屬福州第二醫(yī)院及西安醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并且告知患者相關(guān)權(quán)利和風(fēng)險(xiǎn)，由本人或其法定監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書。

1.2實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR) 將標(biāo)本分為兩部分：一部分腫瘤標(biāo)本送病理組織學(xué)檢查，另一部分置于液氮中保存。經(jīng)病理檢查確診為IS后，采用RT-qPCR分別檢測(cè)腫瘤組織及正常神經(jīng)組織中miR-17-92基因簇的表達(dá)水平。

1.2.1RNA提取 使用Invitrogen公司的TRIzol Reagent (目錄號(hào)：10296010)提取組織標(biāo)本總RNA，并在核算分析儀上檢測(cè)A260/A280，當(dāng)其值介于1.8～2.0時(shí)，可認(rèn)為總RNA質(zhì)量較佳。取1 μl RNA樣品，1%瓊脂糖凝膠電泳80 V×20 min，觀察總RNA的5 S、18 S和28 S rRNA條帶，3條條帶完整即證明總RNA抽提較完整。

1.2.2miR-17-92基因簇引物設(shè)計(jì)及合成 采用Oligo7.56軟件設(shè)計(jì)miR-17-92基因簇及內(nèi)參基因GAPDH引物序列，并委托上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見表1。

A:MRI T2W矢狀位顯示腫瘤位于C1～C2節(jié)段(紅色箭頭)；B:術(shù)中可見腫瘤起源于神經(jīng)，且少部分腫瘤已長(zhǎng)入椎間孔(白色箭頭)；C:纖維鏡下完整切除腫瘤，大小為4.5 cm×3.5 cm×1.8 cm，質(zhì)地較軟，包膜完整，色澤灰白圖1 椎管內(nèi)神經(jīng)鞘瘤

A:鏡下可見部分腫瘤細(xì)胞呈束狀緊密排列，形成Antoni A結(jié)構(gòu)(紅色箭頭)，而部分細(xì)胞則呈稀疏紊亂排列，形成Antoni B結(jié)構(gòu)(黑色箭頭，HE染色×200)；B：免疫組織化學(xué)顯示S-100可使腫瘤細(xì)胞呈棕褐色(×200)圖2 術(shù)后病理情況

基因名稱引物名稱引物序列(5'-3')長(zhǎng)度(bp)退火溫度(℃)miR-17-92正向CTGTCGCCCAATCAAACTG24660反向GTCACAATCCCCACCAAACGAPDH正向GGGTGTGAACCATGAGAAGT14260正向GGCATGGACTGTGGTCATGA

1.2.3cDNA合成及PCR擴(kuò)增 cDNA合成體系：采用Promega公司莫洛尼鼠白血病病毒(M-MLV)逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(目錄號(hào)：M3681)，建立25 μl反應(yīng)體系：M-MLV RT 5×反應(yīng)緩沖液5 μl，脫氧腺苷三磷酸(dATP，10 mmol/L)1.25 μl，脫氧胞苷三磷酸(dCTP，10 mmol/L)1.25 μl，脫氧鳥苷三磷酸(dGTP，10 mmol/L)1.25 μl，脫氧胸苷三磷酸(dTTP，10 mmol/L)1.25 μl，M-MLV RT 1 μl，焦碳酸二乙酯水補(bǔ)至總體積為25 μl。PCR在25 μl體系進(jìn)行：DNA模板100 ng/μl，正、反向引物各1 μl(10 μmol/L)，2×Taq Plus PCR MasterMix 12.5 μl，雙蒸水補(bǔ)至25 μl。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。ABI SimpliAmp 熱循環(huán)儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min。取5 μl PCR產(chǎn)物，以2.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行結(jié)果檢測(cè)。

1.2.4相對(duì)定量分析 RT-qPCR采用相對(duì)定量法，以GAPDH為內(nèi)參，校正每個(gè)樣品的Ct值，得△Ct。目標(biāo)基因表達(dá)水平可利用2-△△Ct法獲得，△△Ct =各組(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)-對(duì)照組(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)=X，2-△△Ct=各組基因表達(dá)量/對(duì)照組基因表達(dá)量。結(jié)果表示，各組樣本內(nèi)目標(biāo)基因的表達(dá)水平為對(duì)照組樣本內(nèi)的2-X倍。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1患者術(shù)后及預(yù)后 實(shí)驗(yàn)組中17例術(shù)后癥狀緩解，順利出院，3例(15%)出現(xiàn)并發(fā)癥，包括腦脊液漏、切口感染、急性血腫及上肢感覺功能減退等。采取加強(qiáng)硬脊膜縫合、抗感染等治療措施后康復(fù)出院，平均住院(8.46±3.84)d。

2.2miR-17-92基因簇表達(dá) 對(duì)照組miR-17-92基因簇表達(dá)水平(1.414±0.152)顯著高于實(shí)驗(yàn)組(1.048±0.168，t=3.582，P<0.05)。

2.3miR-17-92基因簇表達(dá)上調(diào)與未上調(diào)兩組間一般資料比較 miR-17-92基因簇表達(dá)上調(diào)與未上調(diào)兩組間年齡及腫瘤大小差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 miR-17-92基因簇表達(dá)上調(diào)與未上調(diào)患者間年齡、腫瘤直徑的比較

3 討 論

神經(jīng)鞘瘤是一種可發(fā)生于全身任何部位的腫瘤，25%～45%腫瘤分布在頭頸區(qū)域，29%分布于椎管內(nèi)，還有部分可見于外周神經(jīng)、腹膜后、椎旁肌肉等〔7，8〕。其中IS絕大多數(shù)屬于良性腫瘤，是最常見的椎管內(nèi)腫瘤〔9〕。其生物特性主要表現(xiàn)為生長(zhǎng)均勻緩慢，部分腫瘤在生長(zhǎng)過程中可停滯甚至萎縮。在發(fā)病早期一般無任何臨床癥狀，當(dāng)腫瘤增大到一定程度后，可壓迫與之毗鄰的脊髓和(或)神經(jīng)根而出現(xiàn)神經(jīng)源性疼痛，嚴(yán)重者可致癱瘓。研究表明，IS年發(fā)病率為(0.4～1.5)/10萬，呈逐年上升趨勢(shì)，且發(fā)病人群越來越廣泛〔10〕。目前，關(guān)于神經(jīng)鞘瘤發(fā)病機(jī)制的研究鮮有報(bào)道，且尚無統(tǒng)一結(jié)論，成為非手術(shù)治療神經(jīng)鞘瘤的瓶頸，特別是對(duì)只能實(shí)施腫瘤次全切除術(shù)的患者，術(shù)后腫瘤存在復(fù)發(fā)或惡變的可能性。

流行病學(xué)研究表明，神經(jīng)鞘瘤發(fā)病具有遺傳傾向性，其遺傳易感基因主要是神經(jīng)纖維瘤Ⅱ型(NF2)基因〔11〕。在雙側(cè)聽神經(jīng)瘤患者中，90%以上都存在NF2基因突變，臨床將其作為明確的診斷指標(biāo)之一〔12〕。在周圍神經(jīng)鞘瘤中，約70%發(fā)病與NF2基因突變有關(guān)〔13〕。雖然IS多為散發(fā)，且尚未找到遺傳學(xué)相關(guān)證據(jù)，但先前的研究表明，NF2基因在IS中也存在突變，這種突變使其編碼的Merlin蛋白失去活性，進(jìn)而喪失腫瘤抑制作用〔14〕。在miR研究方面，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為miR是非編碼小分子RNA，在機(jī)體發(fā)育、生理、病理過程及腫瘤發(fā)生、進(jìn)展等環(huán)節(jié)中起著重要的調(diào)節(jié)作用。郭建新等〔15〕發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)鞘瘤中，miR-10b啟動(dòng)子甲基化水平下降，進(jìn)而引起該基因持續(xù)高表達(dá)，致使第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因靶向表達(dá)受到抑制。隨著研究的深入，miR分子被證實(shí)參與了腫瘤進(jìn)展的調(diào)控。在眾多被揭示的miR分子中，miR-17-92基因簇?zé)o疑是最具代表性的分子之一，參與了全身多種實(shí)體腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，包括甲狀腺癌、生殖系統(tǒng)腫瘤、血液系統(tǒng)腫瘤、消化系統(tǒng)腫瘤及神經(jīng)源性腫瘤等〔16,17〕。本研究揭示了miR-17-92基因簇可能參與了IS的發(fā)生、發(fā)展，對(duì)后續(xù)進(jìn)一步研究該腫瘤發(fā)病機(jī)制及尋找非手術(shù)治療方法具有重要意義。

目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)IS的研究主要聚焦于如何更加微創(chuàng)地完成腫瘤全切除，減少并發(fā)癥，卻忽略了對(duì)該腫瘤發(fā)病機(jī)制的研究及非手術(shù)治療途徑的探索?？赡苁怯捎诮^大多數(shù)臨床醫(yī)生認(rèn)為，90%以上的IS都可以經(jīng)手術(shù)切除，且預(yù)后較好。然而手術(shù)并不能解決一切問題。Formo等〔18〕研究表明，即使顯微鏡下微創(chuàng)切除IS是一種安全、有效的治療方法，但術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生率卻高達(dá)11%，包括腦脊液漏、術(shù)區(qū)淺表感染、神經(jīng)功能減退等。本研究中1例術(shù)后12 h出現(xiàn)肢體癱瘓、感覺功能減退，經(jīng)MRI證實(shí)為急性血腫形成，及時(shí)予以血腫清除后，患者肢體運(yùn)動(dòng)和感覺功能恢復(fù)。此外，對(duì)高頸段啞鈴型IS而言，由于腫瘤往往包繞著椎動(dòng)脈，很難完成腫瘤全切，殘余的腫瘤又會(huì)造成復(fù)發(fā)、惡變等問題〔19〕。當(dāng)前治療IS的主流術(shù)式是經(jīng)后路全椎板或半椎板切除+顯微鏡下腫瘤切除〔20〕。然而，此種入路破壞了脊柱的穩(wěn)定性，造成脊柱出現(xiàn)滑脫、前凸或后凸畸形等問題。Cusick等〔21〕研究發(fā)現(xiàn)，切除一側(cè)關(guān)節(jié)突，在屈曲或負(fù)重的情況下，脊柱的強(qiáng)度可下降31.6%。由此可見，手術(shù)雖然能夠有效治療IS，但在治療的過程中給患者帶來了新的問題。

綜上，IS雖然是一種良性腫瘤，外科干預(yù)能夠取得較為滿意的治療效果，但手術(shù)畢竟是一種有創(chuàng)性的治療手段，隨之帶來的近期或遠(yuǎn)期并發(fā)癥給患者造成了極大的心理、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，生存質(zhì)量下降，因此，探究IS的發(fā)病機(jī)制、調(diào)控機(jī)制是十分必要的。本研究不足之處在于尚未找到miR-17-92基因簇所調(diào)控的靶基因及其下游分子的調(diào)控機(jī)制。在未來的研究中將致力于尋找有效的生物治療靶點(diǎn)，為非手術(shù)治療椎管內(nèi)神經(jīng)鞘瘤提供參考。