韓 璐, 張嘉美, 于嘉霖, 方 舒, 馬臣杰, 鄧光存, 吳曉玲
(西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 寧夏 銀川 750021)
結(jié)核病(tuberculosis,TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)感染引起的一種嚴(yán)重的人類呼吸道傳染病。據(jù)世界衛(wèi)生組織2017年的報(bào)告顯示,僅2016年全球感染結(jié)核病的就有1 040萬(wàn)例,且中國(guó)位于世界第3位[1]。由于結(jié)核病的致病機(jī)理較為復(fù)雜,加之多重耐藥菌株的出現(xiàn)以及與HIV共感染導(dǎo)致結(jié)核病的形式更加嚴(yán)峻。
結(jié)核分枝桿菌是一種典型的胞內(nèi)致病菌,當(dāng)結(jié)核分枝桿菌感染宿主細(xì)胞時(shí),機(jī)體會(huì)啟動(dòng)自身免疫調(diào)控機(jī)制來(lái)抵抗病原菌的侵染。一方面,巨噬細(xì)胞可通過(guò)細(xì)胞凋亡殺傷并清除病原菌;另一方面,結(jié)核分枝桿菌也可通過(guò)多種途徑逃避巨噬細(xì)胞的免疫清除,包括抑制細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激反應(yīng)等[2]。最終結(jié)核分枝桿菌的命運(yùn)與這一場(chǎng)角力息息相關(guān),此過(guò)程受到多種因素及蛋白調(diào)控。近期研究表明,受體相互作用蛋白3(receptor-interacting protein 3,RIP3)對(duì)細(xì)胞命運(yùn)具有關(guān)鍵性調(diào)控作用。
受體相互作用蛋白家族(receptor-interacting proteins,RIPs)是一類具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的蛋白[3]。迄今為止,該蛋白家族共發(fā)現(xiàn)7種蛋白受體相互作用蛋白,RIP3作為受體相互作用蛋白家族的一員,在細(xì)胞程序性死亡和細(xì)胞增殖等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起著重要的作用,尤為重要的是,RIP3是細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死的轉(zhuǎn)換器[4]。早前研究發(fā)現(xiàn),在293E細(xì)胞[5]、Phoenix-A細(xì)胞[6]和HeLa細(xì)胞[7]中外源過(guò)表達(dá)RIP3蛋白會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生Ⅰ型程序性死亡,即細(xì)胞凋亡,且RIP3過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡依賴于caspase的活化[8]。亦有大量研究發(fā)現(xiàn),RIP3在肝、腦、肺和心臟等正常組織中都有表達(dá),而在肝癌和肺癌組織中表達(dá)量卻非常低,這表明RIP3與腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能可能具有密切聯(lián)系[7]。但RIP3是否參與結(jié)核分枝桿菌感染后的細(xì)胞命運(yùn)尚未見系統(tǒng)報(bào)道,因此深入探究RIP3在結(jié)核分枝桿菌引發(fā)巨噬細(xì)胞凋亡中的作用對(duì)結(jié)核病的防治及靶向藥物研制具有重要意義。
本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)牛結(jié)核分枝桿菌減毒株卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin, BCG)感染巨噬細(xì)胞后細(xì)胞凋亡率增加,與此同時(shí),細(xì)胞內(nèi)RIP3表達(dá)量明顯上調(diào)[9]。為了探討RIP3是否參與了BCG誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程,本研究構(gòu)建了RIP3腺病毒干擾載體感染小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7,并結(jié)合BCG進(jìn)行感染,從而探討RIP3是否參與調(diào)控BCG感染后RAW264.7細(xì)胞的凋亡,進(jìn)而揭示RIP3在BCG感染小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7過(guò)程中對(duì)凋亡的調(diào)控作用。
小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7購(gòu)自中科院上海細(xì)胞研究所,保存于西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。牛結(jié)核分枝桿菌卡介苗購(gòu)自上海生物制品研究所有限公司。
DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco;胎牛血清購(gòu)自BI;MTT細(xì)胞活力及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒、Annexin VFITC/PI雙染試劑盒、細(xì)胞凋亡線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1)、活性氧(reactive oxygen species,ROS)檢測(cè)試劑盒、全蛋白提取試劑盒和蛋白測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;Western blot用 I 抗購(gòu)自Proteintech;熒光 II 抗購(gòu)自LI-COR;HRP化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自北京伯樂(lè)生物發(fā)展科技有限公司;其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。RIP3腺病毒干擾載體(shRIP3)由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。
3.1細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮中取出凍存的RAW264.7細(xì)胞于37 ℃水浴中快速攪拌至細(xì)胞懸液完全溶解,將細(xì)胞懸液移至加有1 mL(含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)培養(yǎng)液的離心管中,1 000 r/min離心5 min,棄掉上清,加入1 mL完全培養(yǎng)液將細(xì)胞輕輕重懸后移入細(xì)胞培養(yǎng)皿中,于37 ℃,含5% CO2的恒溫、恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng),1~2 d傳代1次,取3代以后的RAW264.7細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
3.2菌株培養(yǎng) BCG菌株采用Middlebrook 7H10對(duì)BCG進(jìn)行復(fù)蘇,靜置于37 °C培養(yǎng)箱中,每3個(gè)周傳代 1 次。
3.3實(shí)驗(yàn)分組 取于37 ℃、含5% CO2的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)超過(guò)24 h且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn),以1×106個(gè)接種于6孔板中,每孔加培養(yǎng)液2 mL,設(shè)立4個(gè)處理組:對(duì)照(control)組、BCG組、shRIP3組及shRIP3結(jié)合BCG感染組。待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定后,進(jìn)行病毒感染(MOI=1∶100),空載腺病毒感染control組和BCG組,RIP3干擾腺病毒感染shRIP3組和shRIP3結(jié)合BCG組;病毒感染24 h后最后一組再用BCG感染細(xì)胞,細(xì)胞與細(xì)菌之比為1∶10;繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
3.4MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的RAW264.7細(xì)胞按1×103個(gè)接種于96孔板中,每孔加培養(yǎng)液200 μL,根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求設(shè)計(jì)處理組和對(duì)照組,每孔設(shè)計(jì)5個(gè)復(fù)孔,培養(yǎng)結(jié)束后,每孔加入50 μL的1×MTT溶液,培養(yǎng)箱37 ℃繼續(xù)撫育4 h,4 h后小心吸掉培養(yǎng)液,每孔加入150 μL DMSO,37 ℃平板搖床撫育30 min,于490 nm處檢測(cè)每孔的吸光度(A)值。
3.5Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好RAW264.7細(xì)胞以1×106個(gè)接種于6孔板,按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)處理后,用Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。除實(shí)驗(yàn)組還需設(shè)計(jì)3個(gè)對(duì)照組,分別為Annexin V-FITC單染、PI單染和不染組,將各組細(xì)胞消化后用預(yù)冷的PBS洗滌1遍,1 000 r/min離心5 min,棄上清,加入400 μL 1×Binding buffer重懸細(xì)胞,各處理組細(xì)胞分別加入Annexin V-FITC 5 μL,混勻后加入PI染色液5 μL,輕輕混勻,室溫,避光撫育20 min。1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè),細(xì)胞凋亡率為Annexin V-FITC陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比。
3.6RAW264.7細(xì)胞ROS水平的測(cè)定 根據(jù)ROS試劑盒說(shuō)明書,將RAW264.7細(xì)胞以1×106個(gè)接種于6孔板培養(yǎng)皿中,按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)處理后,用DCFH-DA熒光探針檢測(cè)細(xì)胞活性氧含量。無(wú)血清的DMEM配置終濃度為10 μmoL/L的DCFH-DA工作液,細(xì)胞消化后用預(yù)冷的PBS洗滌,1 000 r/min,離心5 min,棄上清,1 mL DCFH-DA工作液重懸細(xì)胞,37 ℃避光撫育30 min。PBS洗滌2次,500 μL PBS重懸細(xì)胞。1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
3.7RAW264.7細(xì)胞線粒體膜電位的檢測(cè) 將RAW264.7細(xì)胞以1×106個(gè)接種于6孔板,按試驗(yàn)設(shè)計(jì)處理后,采用細(xì)胞凋亡線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1)檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位。取500 μL 1×Incubation Buffer加入1 μL JC-1,渦旋混勻配成 JC-1 工作液。取500 μL JC-1工作液混勻細(xì)胞,37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中撫育20 min,離心,棄上清。用1×Incubation Buffer清洗細(xì)胞,吸取500 μL 1×Incubation Buffer 重懸細(xì)胞,1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
3.8Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá) 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的RAW264.7細(xì)胞以1×106個(gè)接種于6孔板培養(yǎng)皿中,按試驗(yàn)設(shè)計(jì)處理后,按蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞全蛋白,根據(jù)需要測(cè)定的蛋白大小調(diào)整分離膠的濃度,將各組蛋白上樣,SDS-PAGE 2 h,用濕轉(zhuǎn)法將蛋白樣品從膠轉(zhuǎn)至 PVDF膜,5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h, 加入相應(yīng)的 I 抗,4 ℃過(guò)夜,以β-actin作為內(nèi)參照,次日TBST緩沖液洗掉殘留的 I 抗,加入相應(yīng)的 II 抗,室溫?fù)嵊? h,TBST緩沖液洗掉膜上殘留的 II 抗,顯影,曝片。結(jié)果用 ImageJ 軟件分析各組條帶的灰度值。
所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行分析,兩組均數(shù)比較采用LSD-t法,多組均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),分析結(jié)果經(jīng)過(guò)Bonferroni法矯正,以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
采用MTT法對(duì)BCG感染不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞活力進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組相比,BCG處理后的細(xì)胞活力顯著降低(P<0.01),且隨著BCG感染時(shí)間的增加,細(xì)胞活力呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì),見圖1。
Figure 1.The effect of BCG on the viability of RAW264.7 cells at different time points. Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol (0 h) group.
圖1 BCG感染后對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率的影響
采用Western blot技術(shù)對(duì)RIP3蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。與空白對(duì)照組相比,BCG感染RAW264.7細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)RIP3表達(dá)量顯著增加 (P<0.01),見圖2A。為了驗(yàn)證RIP3的上調(diào)是否參與BCG誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,我們構(gòu)建了RIP3腺病毒干擾載體進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,與空載腺病毒載體組相比,RIP3腺病毒干擾載體組RIP3的蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.01),見圖2B,表明RIP3腺病毒干擾載體構(gòu)建成功。
本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步采用Annexin V-FITC/PI染色液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色,用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)RIP3對(duì)BCG感染后RAW264.7細(xì)胞凋亡率的影響,結(jié)果表明,BCG感染后RAW264.7細(xì)胞凋亡率與空白對(duì)照組相比顯著上升(P<0.01),但是RIP3干擾結(jié)合BCG感染處理組與BCG組相比細(xì)胞凋亡率顯著下降(P<0.05),見圖3。這表明BCG誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是由于RIP3上調(diào)所導(dǎo)致,當(dāng)RIP3被干擾后其凋亡率顯著下降。
Figure 2.The effect ofRIP3adenovirus interference vector transfection on the protein expression of RIP3 in the RAW264.7 cells with or without BCG infection was detected by Western blot. A: the expression of RIP3 after BCG infection; B: the validation ofRIP3adenovirus interference vector transfection. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol;P<0.01vsvector group.
圖2 BCG感染RAW264.7細(xì)胞后RIP3表達(dá)水平變化及shRIP3效率的驗(yàn)證
Figure 3.The effects of RIP3 expression on the apoototic rate of RAW264.7 cells infected with BCG. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsBCG group.
圖3 RIP3表達(dá)水平對(duì)BCG感染后RAW264.7細(xì)胞凋亡率的影響
流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示,BCG感染后RAW264.7細(xì)胞的活性氧水平與空白對(duì)照組相比顯著上升(P<0.01),但是BCG感染結(jié)合RIP3干擾處理組細(xì)胞活性氧水平與BCG組相比顯著下降(P<0.01),見圖4。由此可知,RIP3可上調(diào)BCG感染后RAW264.7細(xì)胞的活性氧水平。
Figure 4.The effect of RIP3 expression on the level of ROS in the RAW264.7 cells infected with BCG. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsBCG group.
圖4 RIP3表達(dá)水平對(duì)BCG感染后RAW264.7細(xì)胞ROS水平的影響
流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示,BCG感染后RAW264.7細(xì)胞線粒體膜電位與空白對(duì)照組相比顯著降低,線粒體低電位細(xì)胞數(shù)顯著增加(P<0.01),但是BCG感染RIP3干擾處理組細(xì)胞線粒體膜電位與BCG處理組相比顯著升高,線粒體低電位細(xì)胞數(shù)顯著下降(P<0.01),見圖5。由此可知,RIP3通過(guò)下調(diào)BCG感染后RAW264.7細(xì)胞線粒體膜電位而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
Figure 5.The effect of RIP3 on the mitochondrial membrane potential of RAW264.7 cells infected with BCG. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsBCG group.
圖5 RIP3對(duì)BCG感染后RAW264.7細(xì)胞線粒體膜電位的影響
與對(duì)照組相比,BCG感染后RAW264.7細(xì)胞促凋亡蛋白Bax和cleaved caspase-3的蛋白水平上升,抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)量下調(diào);與BCG組相比,RIP3干擾結(jié)合BCG感染組Bax和cleaved caspase-3蛋白水平下調(diào),Bcl-2的表達(dá)量上調(diào)(P<0.01)。由此可見,在BCG誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞凋亡過(guò)程中,RIP3通過(guò)增加促凋亡蛋白Bax的表達(dá)量,下調(diào)抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá),最終激活caspase-3,從而促進(jìn)了細(xì)胞凋亡,見圖6。
Figure 6.The effect of RIP3 on the protein levels of apoptosis-related molecules in the RAW264.7 cells after BCG infection. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsBCG group.
圖6 RIP3對(duì)BCG感染后RAW264.7細(xì)胞凋亡相關(guān)分子蛋白水平的影響
結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞后,細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)3種形式的死亡:細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬及細(xì)胞壞死。細(xì)胞凋亡是一種由基因控制自動(dòng)結(jié)束生命的過(guò)程,對(duì)生物個(gè)體的發(fā)育及維持機(jī)體自穩(wěn)的平衡都起到極其重要的作用[10]。目前認(rèn)為,細(xì)胞凋亡的途徑主要有3種:線粒體途徑、死亡受體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑。但結(jié)核分枝桿菌感染后誘發(fā)巨噬細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制十分復(fù)雜。
本研究結(jié)果顯示,BCG感染巨噬細(xì)胞后細(xì)胞存活率降低,且具有時(shí)間依賴性。該死亡過(guò)程可能有多種蛋白參與,近期研究發(fā)現(xiàn)RIPs激酶家族在細(xì)胞程序性死亡過(guò)程中起到舉足輕重的作用。迄今為止,RIPs有RIP1~RIP7共7種蛋白。RIPs作為重要的細(xì)胞應(yīng)激傳感器,被證明不僅在炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用,而且在細(xì)胞程序性死亡的過(guò)程中也扮演著重要的角色[11]。在TNF誘導(dǎo)NF-κB激活的過(guò)程中,RIP是不可缺失的[12]。此外,RIP基因缺失的小鼠在出生1~3 d內(nèi)就會(huì)發(fā)生死亡,該狀況是由于小鼠脂肪組織和淋巴細(xì)胞過(guò)度凋亡而導(dǎo)致的[13]。除此之外亦有研究揭示RIP3在多種疾病中對(duì)宿主細(xì)胞凋亡的調(diào)控過(guò)程都起著至關(guān)重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)BCG感染巨噬細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)RIP3的表達(dá)量發(fā)生明顯上調(diào),為了探討B(tài)CG誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是否與RIP3的上調(diào)相關(guān),通過(guò)構(gòu)建RIP3的干擾載體并驗(yàn)證其干擾功能。研究結(jié)果顯示,RIP3干擾結(jié)合BCG感染組 RAW264.7細(xì)胞的凋亡率與BCG單獨(dú)感染組相比顯著下降,這表明RIP3的上調(diào)參與了BCG誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。有報(bào)道表明,在人類乳腺癌細(xì)胞中外源性過(guò)表達(dá)RIP3會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS的積累[14],胞內(nèi)ROS的積累會(huì)引發(fā)細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷,最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn),在BCG感染小鼠巨噬細(xì)胞的過(guò)程中RIP3可上調(diào)胞內(nèi)活性氧水平。已有研究表明,ROS的過(guò)量積累會(huì)導(dǎo)致線粒體膜損傷,從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),BCG感染巨噬細(xì)胞后,細(xì)胞線粒體膜電位顯著下降,且RIP3干擾結(jié)合BCG組與BCG處理組相比線粒體膜電位顯著上升。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明RIP3對(duì)BCG誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞凋亡的調(diào)控是通過(guò)線粒體途徑實(shí)現(xiàn)的,有研究證明,在RIP3過(guò)表達(dá)的HeLa細(xì)胞中,RIP3所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程中細(xì)胞caspase被激活,且RIP3可能位于Bcl-2的上游[7]。Bcl-2家族是線粒體途徑的主要調(diào)控者。Bax是Bcl-2家族中的促凋亡成員,若Bax表達(dá)量升高,則進(jìn)一步激活caspase-3,促進(jìn)細(xì)胞凋亡;Bcl-2作為Bcl-2家族中的抑凋亡蛋白,若Bcl-2表達(dá)量升高,則阻斷了caspase的激活,抑制了細(xì)胞凋亡[16]。本研究發(fā)現(xiàn),在BCG感染RAW264.7細(xì)胞的過(guò)程中,RIP3參與了BCG誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞的凋亡,且該過(guò)程可能是通過(guò)ROS調(diào)控線粒體介導(dǎo)的凋亡實(shí)現(xiàn)的。
細(xì)胞程序性死亡是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程,除了凋亡外還有自噬和壞死。本實(shí)驗(yàn)室前期已證明BCG感染巨噬細(xì)胞后細(xì)胞會(huì)發(fā)生凋亡、壞死及自噬。本研究證實(shí)RIP3參與了BCG感染引起的細(xì)胞凋亡,但RIP3是否參與了BCG感染后巨噬細(xì)胞的壞死及自噬有待進(jìn)一步的研究。該研究的繼續(xù)推進(jìn)將為進(jìn)一步揭示結(jié)核病的致病機(jī)理提供新的思路。
本研究結(jié)果揭示,BCG可導(dǎo)致巨噬細(xì)胞RAW264.7活力降低并上調(diào)RIP3的表達(dá)量;RIP3干擾結(jié)合BCG感染組與BCG處理組相比,細(xì)胞凋亡率下降,活性氧水平下調(diào),線粒體膜電位上升,且凋亡蛋白Bax與cleaved capase-3的蛋白水平降低,抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量上升,表明RIP3參與了BCG感染小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7后細(xì)胞的凋亡,且該過(guò)程可能是通過(guò)線粒體途徑實(shí)現(xiàn)的。