方曉琳， 楊海波， 李 憲， 胡 濤， 張一諾， 孫廣平

(吉化集團(tuán)公司總醫(yī)院 1內(nèi)分泌科， 2血液中毒科， 吉林 吉林 132021)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常見(jiàn)、最嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥之一，是引起慢性腎功能衰竭的主要原因，隨著人們生活方式、生活水平等的改變，全球糖尿病的患病率快速升高，嚴(yán)重威脅人類健康[1]。大量研究表明，DN的早期主要特征是腎小管上皮細(xì)胞凋亡[2]；高糖可抑制腎小管上皮細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)凋亡[3]。因此，深入探究引起腎小管上皮細(xì)胞凋亡機(jī)制具有重要意義。高遷移率族蛋白A2(high mobility group protein A2，HMGA2)是HMGA家族的一個(gè)成員，其基因是近些年的受到關(guān)注的癌基因之一，其異常表達(dá)與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4-5]。HMGA2在DN的研究較少。有研究表明，HMGA2的單核苷酸多態(tài)性與糖尿病有關(guān)[6]；微小RNA-23b(microRNA-23b, miR-23b)可通過(guò)靶向抑制HMGA2減弱DN的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-me-senchymal transition，EMT)[7]。Notch信號(hào)通路是一條重要的信號(hào)途徑，近些年研究發(fā)現(xiàn)，該信號(hào)途徑與多種腎臟疾病密切相關(guān)[8]。因此，本研究通過(guò)RNA干擾(RNA interfering, RNAi)技術(shù)抑制腎小管上皮細(xì)胞HMGA2表達(dá)，觀察HMGA2表達(dá)對(duì)腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響，并進(jìn)一步探究對(duì)Notch信號(hào)的調(diào)控。

材 料 和 方 法

1 試劑和儀器

人近端腎小管上皮細(xì)胞系HK-2購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。DMEM/F12培養(yǎng)基、胰酶和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)均購(gòu)自Gibco；D-葡萄糖和DAPT購(gòu)自Sigma；抗HMGA2、Notch1、Hes1、Bcl-2和Bax抗體均購(gòu)自Abcam；活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成；細(xì)胞凋亡率試劑盒購(gòu)自江蘇凱基。流式細(xì)胞儀購(gòu)自BD。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) HK-2細(xì)胞用含10% FBS及青鏈霉素的低糖DMEM/F12培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，24 h后，待細(xì)胞充分貼壁，每隔1 d換液1次，約3～5 d細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底時(shí)進(jìn)行傳代，細(xì)胞傳代采用胰酶-EDTA消化法。實(shí)驗(yàn)為生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的細(xì)胞。

2.2基因轉(zhuǎn)染和細(xì)胞干預(yù) 將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的HK-2細(xì)胞以2×108/L濃度接種于6孔板，每孔加2 mL細(xì)胞懸液，培養(yǎng)過(guò)夜。參照LipofectamineTM2000說(shuō)明將設(shè)計(jì)合成的HMGA2特異性siRNA(si-HMGA2)序列及陰性對(duì)照組siRNA(negative control siRNA, NC)序列轉(zhuǎn)染細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置空白組，轉(zhuǎn)染后將6孔板放入培養(yǎng)箱，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)5 h，換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，同步24 h后加30 mmol/L D-葡萄糖刺激細(xì)胞48 h。

胰酶消化生長(zhǎng)至80%融合的HK-2細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，接種于6孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%融合時(shí)進(jìn)行干預(yù)試驗(yàn)。D-葡萄糖刺激濃度選擇：采用5、10、20 和30 mmol/L的D-葡萄糖刺激HK-2細(xì)胞2 h，通過(guò)Western blot檢測(cè)HMGA2蛋白的表達(dá)；然后用30 mmol/L的D-葡萄糖刺激HK-2細(xì)胞0 min、10 min、60 min和120 min，通過(guò)Western blot檢測(cè)HMGA2蛋白的表達(dá)。

轉(zhuǎn)染細(xì)胞分組：含10% FBS的低糖DMEM/F12完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)HK-2細(xì)胞，細(xì)胞達(dá)80%貼壁時(shí)，不含血清培養(yǎng)基同步細(xì)胞24 h，將細(xì)胞隨機(jī)分為4個(gè)處理組，即正常葡萄糖(normal glucose, NG)組(5 mmol/L葡萄糖)、高糖(high glucose HG)組(30 mmol/L葡萄糖)、HG+si-HMGA2組(轉(zhuǎn)染si-HMGA2+30 mmol/L葡萄糖)和HG+NC組(轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA+30 mmol/L葡萄糖)，處理48 h，收集細(xì)胞用于后續(xù)研究。

2.3Western blot實(shí)驗(yàn) 收集干預(yù)后的細(xì)胞，加裂解液在冰上反應(yīng)30 min，刮取細(xì)胞，離心，上清液即為提取的總蛋白。BCA法定量蛋白。取50 μg總蛋白，加5×加樣緩沖液，在100 ℃煮沸變性5 min，離心后上樣，經(jīng)10% SDS-PAGE，電泳后電轉(zhuǎn)PVDF膜，5% BSA在37 ℃條件下封閉1 h，加 I 抗(HMGA2、Notch1、Hes1、Bcl-2和Bax抗體，稀釋比例均為1∶500)，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌，加HRP標(biāo)記的 II 抗(稀釋比例1：2 000)，室溫孵育2 h，TBST洗膜，ECL顯色劑滴加至PVDF膜，在凝膠成像儀內(nèi)顯影。通過(guò)Quantity One計(jì)算各個(gè)條帶灰度值。以GAPDH為內(nèi)參照，以目的蛋白與GAPDH灰度值比值代表各個(gè)目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 收集干預(yù)后的細(xì)胞，加胰酶-EDTA消化細(xì)胞，鏡下觀察細(xì)胞變圓、飄起后，加含血清的完全培養(yǎng)基終止消化，離心，棄上清，預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞，離心，結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，取100 μL細(xì)胞懸液，加5 μL Annexin V-FITC及5 μL PI，混勻，室溫避光反應(yīng)15～20 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。HK-2細(xì)胞用HG、HG+DAPT(DAPT為Notch信號(hào)抑制劑，10 μmol/L)及HG+si-HMGA2+DAPT處理，48 h后通過(guò)Annexin V-FITC/ PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5ROS含量的檢測(cè) 取按照2.2方法干預(yù)后的細(xì)胞，采用DCFH-DA活性氧檢測(cè)方法檢測(cè)各組細(xì)胞ROS含量。操作參照ROS檢測(cè)試劑盒說(shuō)明，使用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組差異比較采用單因素方差分析并用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行各組均數(shù)間的兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 D-葡萄糖對(duì)HK-2細(xì)胞HMGA2表達(dá)的影響

不同濃度的D-葡萄糖處理HK-2細(xì)胞，HMGA2蛋白表達(dá)隨D-葡萄糖濃度增加而增加，10、20 和30 mmol/L的D-葡萄糖處理組的HMGA2蛋白表達(dá)均明顯高于5 mmol/L D-葡萄糖對(duì)照組(P<0.05),見(jiàn)圖1A。30 mmol/L的D-葡萄糖處理HK-2細(xì)胞10 min、60 min和120 min，HMGA2蛋白表達(dá)隨時(shí)間增加而增加，且與0 min對(duì)照組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1B。

Figure 1.The effect of D-glucose on the expression of HMGA2 in the HK-2 cells. A: the results of Western blot for determining the relative protein expression of HMGA2 in the HK-2 cells treated with D-glucose at different concentrations; B: the results of Western blot for determining the relative protein expression of HMGA2 in the HK-2 cells treated with D-glucose at different time points. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs5 mmol/L D-glucose group;#P<0.05vs0 min group.

圖1 D-葡萄糖對(duì)HK-2細(xì)胞HMGA2表達(dá)的影響

2 si-HMGA2轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞的效果

HG組HMGA2蛋白表達(dá)明顯高于NG組，而HG+si-HMGA2組HMGA2蛋白表達(dá)明顯低于HG組(P<0.05)，HG+NC組和HG組間HMGA2蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)，見(jiàn)圖2。這提示抑制HMGA2表達(dá)的模型建立成功。

3 si-HMGA2降低高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡

通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)si-HMGA2對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示，HG組細(xì)胞凋亡率明顯高于NG組，而HG+si-HMGA2組細(xì)胞凋亡率明顯低于HG組(P<0.05)，HG+NC組和HG組間細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖3。

Figure 2.The protein expression of HMGA2 after si-HMGA2 was transfected into the HK-2 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNG group;#P<0.05vsHG group.

圖2 Western blot檢測(cè)si-HMGA2轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞后HMGA2蛋白的表達(dá)

Figure 3.Flow cytometry was used to analyze the effect of si-HMGA2 on apoptosis of HK-2 cells induced by high glucose (HG). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNG group;#P<0.05vsHG group.

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)si-HMGA2對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡的影響

4 si-HMGA2降低高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞ROS水平

ROS含量的的檢測(cè)結(jié)果顯示，HG組的ROS含量明顯高于NG組，HG+si-HMGA2組的ROS含量明顯低于HG組(P<0.05)，HG+NC組和HG組間的ROS含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)，見(jiàn)圖4。

5 si-HMGA2下調(diào)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞Notch信號(hào)通路

Western blot檢測(cè)si-HMGA2對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞Notch信號(hào)通路Notch1和Hes1及下游凋亡相關(guān)的Bcl-2和Bax的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，與NG組比較，HG組的Notch1和Hes1表達(dá)明顯升高，而B(niǎo)cl-2/Bax的表達(dá)明顯降低(P<0.05)；與HG組比較，HG+si-HMGA2組的Notch1和Hes1表達(dá)明顯降低，而B(niǎo)cl-2/Bax的表達(dá)明顯升高(P<0.05)。HG+NC組和HG組檢測(cè) Notch1、Hes1和Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)，見(jiàn)圖5。

6 si-HMGA2降低高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)si-HMGA2對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞Notch信號(hào)通路的調(diào)控作用，結(jié)果顯示，HG+DAPT組的細(xì)胞凋亡率明顯低于HG組，而HG+si-HMGA2+DAPT組的細(xì)胞凋亡率明顯低于HG+DAPT組(P<0.05)，見(jiàn)圖6。

Figure 4.The effect of si-HMGA2 on ROS content in the HK-2 cells induced by high glucose (HG). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNG group;#P<0.05vsHG group.

圖4 si-HMGA2對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞ROS含量的影響

討 論

近些年越來(lái)越多的研究表明，腎小管間質(zhì)損傷是DN病理改變的主要特征，尤其是小管上皮細(xì)胞凋亡和損傷已引起廣泛關(guān)注[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可能通過(guò)抑制活性氧的生成和上調(diào)Nrf-2表達(dá)保護(hù)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡[10]；高糖培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞miRNA-503上調(diào)表達(dá)，可通過(guò)抑制靶蛋白Bcl-2，活化線粒體凋亡途徑，激活caspase酶，誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡[11]，以上研究提示抑制高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮損傷可對(duì)DN損傷起拮抗作用。 作為一個(gè)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子，HMGA2可對(duì)包括細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)基因在內(nèi)的大量基因轉(zhuǎn)錄和活化進(jìn)行調(diào)節(jié)[12]。在正常組織中HMGA2不表達(dá)或低表達(dá)，而在多種惡性腫瘤中HMGA2明顯上調(diào)表達(dá)[13-14]。

Figure 5.The effect of si-HMGA2 on Notch signaling pathway in the HK-2 cells induced by high glucose (HG). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNG group;#P<0.05vsHG group.

圖5 si-HMGA2對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞Notch信號(hào)通路的影響

目前對(duì)HMGA2的研究多集于腫瘤方法，在DN中研究較少。本研究首先檢測(cè)不同濃度D-葡萄糖處理HK-2細(xì)胞及D-葡萄糖處理HK-2細(xì)胞不同時(shí)間HMGA2表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)D-葡萄糖可呈現(xiàn)劑量及時(shí)間依賴性上調(diào)HMGA2表達(dá)，提示HMGA2可能是引起DN的一個(gè)因素。有研究發(fā)現(xiàn)，RNA干擾抑制HMGA2表達(dá)可減弱AGEs誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞EMT[15]；miR-23b可通過(guò)靶向抑制HMGA2減弱DN的EMT[7]。本研究試圖證實(shí)HMGA2對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡影響。RNAi是由雙鏈RNA所引起的序列特異性基因沉默，是一項(xiàng)高效、高特異性的基因封閉技術(shù)，目前已在基因功能研究、基因治療等方面有廣泛應(yīng)用[16-17]。本研究結(jié)果顯示，通過(guò)RNAi技術(shù)抑制HMGA2基因表達(dá)可減弱高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡， 提示通過(guò)抑制HMGA2基因表達(dá)可對(duì)DN損傷起拮抗作用。

為了研究HMGA2基因?qū)δI小管上皮細(xì)胞凋亡機(jī)制，我們進(jìn)一步觀察沉默HMGA2基因?qū)?xì)胞氧化應(yīng)激的影響。研究表明，高血糖所引起的高濾過(guò)，可導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞糖負(fù)荷增加、回吸收增加，引起腎小管氧耗增加，導(dǎo)致腎小管發(fā)生缺氧，最終引起腎臟氧化應(yīng)激[18-19]。研究表明，高糖環(huán)境下，QDPR基因高表達(dá)能降低NRK-52E細(xì)胞氧化應(yīng)激，沉默QDPR基因能增加NRK-52E細(xì)胞氧化應(yīng)激[20]；ROS可參與誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡[21]。本研究結(jié)果顯示，抑制HMGA2基因表達(dá)可降低高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞ROS含量，提示降低ROS水平可能是HMGA2抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。

Figure 6.The effects of si-HMGA2 on apoptosis of HK-2 cells induced by high glucose (HG). The results of flow cytometry analysis were showed. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsHG group;#P<0.05vsHG+DAPT group.

圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)si-HMGA2對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡的影響

Notch信號(hào)通路是一條在進(jìn)化上相對(duì)保守的信號(hào)途徑，在脊椎動(dòng)物及非脊椎動(dòng)物中廣泛存在，參與多種基因的發(fā)生發(fā)展[22]。近些年來(lái)腎臟病領(lǐng)域研究證實(shí)，Notch信號(hào)通路與DN和腎小球硬化等多種腎臟疾病有關(guān)[23-24]。高糖可以上調(diào)系膜細(xì)胞Notch信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)，Notch信號(hào)通路的活化可以上調(diào)TGF-β和FN，可能導(dǎo)致腎臟纖維化和DN的發(fā)生[25]。TGF-β1在DN高表達(dá)，高糖能抑制HK-2的存活，促進(jìn)凋亡，沉默TGF-β1能減弱高糖誘導(dǎo)HK-2活力抑制及凋亡誘導(dǎo)作用，可能與Notch信號(hào)通路調(diào)控有關(guān)[26]。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族的抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白，Bcl-2/Bax比例可衡量細(xì)胞是否凋亡，其比例升高時(shí)細(xì)胞凋亡率降低[27]。本研究結(jié)果顯示，抑制HMGA2基因表達(dá)可下調(diào)Notch信號(hào)通路Notch1和Hes1表達(dá)，上調(diào)Bcl-2表達(dá)和下調(diào)Bax表達(dá)，提示下調(diào)HMGA2基因表達(dá)可能通過(guò)抑制Notch信號(hào)通路降低高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步研究HMGA2基因?qū)otch信號(hào)通路調(diào)控，發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)通路抑制劑DAPT可降低高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡，而下調(diào)HMGA2和DAPT同時(shí)處理細(xì)胞后，凋亡率明顯低于單獨(dú)用DAPT處理組，說(shuō)明下調(diào)HMGA2基因表達(dá)是通過(guò)抑制Notch信號(hào)通路降低高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡。

綜上所述，下調(diào)HMGA2基因表達(dá)可通過(guò)調(diào)控Notch信號(hào)通路而降低細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生并抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡。本研究可能為HMGA2在DN研究提供了一定的理論依據(jù)，提示HMGA2可能是DN治療的一個(gè)有效靶點(diǎn)，但還需更深入研究。