丁文飛， 宋 磊， 劉海蕓， 秦建華， 曹 靈， 高利超， 歐三桃， 吳蔚樺△

(1西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腎病內(nèi)科， 四川 瀘州 646000； 江西省人民醫(yī)院 2腎病內(nèi)科, 3檢驗科， 江西 南昌 330006)

腎組織纖維化是常見慢性腎臟疾病發(fā)生的基礎(chǔ)，其主要以腎小管間質(zhì)纖維化和腎小球硬化為主要特征[1]。腎小管上皮細胞損傷是腎纖維化發(fā)生的基礎(chǔ)，轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)具有促進腎小管上皮細胞分泌纖維化因子的作用[2]，是腎組織纖維化發(fā)生的關(guān)鍵誘導(dǎo)因子之一。轉(zhuǎn)化生長因子β激活激酶1(TGF-β activated kinase 1，TAK1)是一種典型的蘇氨酸/絲氨酸蛋白激酶，經(jīng)TGF-β的刺激而激活，參與胰島素敏感、糖脂代謝和中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等生理過程[3-4]。TAK1參與炎癥、免疫反應(yīng)和纖維化等相關(guān)疾病的發(fā)生，TAK1還可以通過調(diào)控細胞內(nèi)多種信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因的轉(zhuǎn)錄表達發(fā)揮多種生物學(xué)作用[5]。目前的研究顯示，TAK1在腎組織纖維化發(fā)生時表達上調(diào)，并能夠促進p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases，p38 MAPK)信號通路的激活[6-7]。為了探討TAK1在腎小管上皮細胞纖維化過程中的作用，本研究用TGF-β1刺激腎小管上皮HK-2細胞模擬構(gòu)建腎小管上皮細胞纖維化模型，檢測腎小管上皮細胞纖維化因子的表達情況，為明確腎組織纖維化發(fā)生機制提供依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

腎小管上皮細胞HK-2購自中國上海中科院細胞庫。細胞培養(yǎng)液用含10%胎牛血清的DMEM/F12，細胞密度為90%時，用0.25%的胰蛋白酶消化傳代，細胞在37 ℃、飽和濕度、5% CO2條件下培養(yǎng)。反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega；ECL顯色試劑盒購自Perkin-Elmer Life Sciences；抗TAK1抗體和抗磷酸化TAK1Ser412(p-TAK1Ser412)抗體購自Jackson；I型膠原檢測試劑盒和III型膠原檢測試劑盒購自上海玉博生物科技有限公司 ；抗α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)抗體和抗結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)抗體和抗p38 MAPK抗體購自PeproTech；抗磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPKThr 180/Tyr 182)抗體購自Santa Cruz；TGF-β1購自R&D Systems。

2 方法

2.1實驗分組 HK-2細胞用含終濃度為10 μg/L和0 μg/L TGF-β1的細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，記為TGF-β1處理組和對照(control)組，以real-time PCR和Western blot方法檢測細胞中TAK1表達的變化。

2.2Real-time PCR檢測TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細胞TAK1 mRNA的表達 收集HK-2細胞，在細胞中添加TRIzol裂解液，提取細胞中總RNA。以總RNA作為模板，合成cDNA，體系包括 0.5 μL AMV reverse transcriptase、0.5 μL random primer、1 μL dNTP mixture、2 μL sample RNA、2 μL RT buffer和0.5 μL RNase inhibitor，添加RNase free H2O至3.5 μL，按照42 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min進行逆轉(zhuǎn)錄。qPCR的反應(yīng)體系為2.5 μL 10×PCR buffer、0.5 μL dNTP mixture、0.5 μL引物、0.5 μL Taq mix DNA polymerase、2.5 μL cDNA，添加RNase free H2O至25 μL。TAK1的上游引物序列為5’-ATTCCACAGATACAATGGCTC-3’，下游引序列為5’-TGTAGTAACAATGCGATTTGCC-3’；GAPDH的上游引物序列為5’-AGGGCATCTTGGGCTACAC-3’，下游引物的序列為5’-TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3’； 由南京金斯瑞公司合成。擴增條件為94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，72 ℃ 5 min，共35個循環(huán)。內(nèi)參照為GAPDH，根據(jù)反應(yīng)的Ct值計算TAK1的表達水平。

2.3Western blot檢測TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細胞TAK1蛋白的表達 將HK-2細胞收集以后，在細胞中添加PBS洗滌2次，加入含有PMSF的RIPA裂解溶液，反復(fù)吹打混合后，將細胞放在冰上混合孵育30 min。采用BCA法進行定量檢測以后，將蛋白同1/5體積的loading buffer混合，100 ℃煮沸變性。將蛋白樣品加入到上樣孔中，每孔中添加30 μg蛋白樣品，以120 V的電壓電泳約2 h后，將凝膠從玻璃板中間取出。把PVDF膜放在甲醇中孵育10 s后轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜在4 ℃中進行。把PVDF膜放在新配置的5%牛血清白蛋白中，室溫結(jié)合2 h。將抗TAK1和p-TAK1抗體按照1∶600稀釋，將PVDF膜放在稀釋的I抗反應(yīng)液中，置于搖床上反應(yīng)過夜。將 II 抗按照1∶2 000稀釋后，將PVDF膜放置于其中，在室溫中孵育2 h。以ECL法發(fā)光以后，掃描圖像。用ImageJ分析條帶的灰度值。GAPDH為內(nèi)參照。

2.4慢病毒感染 HK-2細胞按照每孔加入5×104個細胞接種到6孔板中，放在培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)，細胞融合度為40%左右時，按照MOI=20添加慢病毒載體，同時添加適量的polybrene(終濃度為5 mg/L)，混合培養(yǎng)12 h以后，把舊培養(yǎng)液吸除，添加新鮮的細胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，觀察熒光表達情況，用1 mg/L的嘌呤霉素篩選穩(wěn)定感染的細胞系。把穩(wěn)定感染陰性對照慢病毒(sh-NC)和TAK1 shRNA慢病毒(sh-TAK1)的HK-2細胞用含終濃度為10 μg/L TGF-β1的細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，分別記為TGF-β1+sh-NC組和TGF-β1+sh-TAK1組。以real-time PCR和Western blot方法檢測TGF-β1、TGF-β1+sh-NC和TGF-β1+sh-TAK1各組HK-2細胞培養(yǎng)24 h后TAK1表達水平的變化。同時，采用Western blot方法檢測HK-2細胞中α-SMA、CTGF、p-p38MAPKThr 180/Tyr 182和p38 MAPK的蛋白水平。陰性對照慢病毒和TAK1 shRNA慢病毒由上海翊圣生物科技有限公司構(gòu)建。

2.5細胞分泌I型膠原和III型膠原水平的檢測 取各組HK-2細胞，培養(yǎng)24 h以后按照ELISA法檢測培養(yǎng)液上清中I型膠原和III型膠原含量，步驟同試劑盒說明書。

2.6p38 MAPK通路激動劑anisomycin對下調(diào)TAK1的腎小管上皮細胞纖維化的影響 取穩(wěn)定感染TAK1 shRNA的HK-2細胞，以含有p38 MAPK通路激動劑anisomycin (10 μmol/L)和TGF-β1 (10 μg/L)的細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，記為TGF-β1+sh-TAK1+anisomycin組，培養(yǎng)24 h后，ELISA法檢測培養(yǎng)液上清中I型膠原和III型膠原含量，Western blot方法檢測各組細胞中α-SMA、CTGF、p-p38 MAPKThr 180/Tyr 182和p38 MAPK蛋白的水平。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 21.0軟件分析實驗數(shù)據(jù)。所有實驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)按照均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組數(shù)據(jù)間比較用t檢驗，多組差異比較用單因素方差分析，各組均數(shù)間的兩兩比較用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 TGF-β1促進HK-2細胞中TAK1表達

與對照組相比，HK-2細胞經(jīng)過TGF-β1處理以后，細胞中TAK1的mRNA和蛋白表達水平及p-TAK1Ser412的蛋白水平均升高(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.TGF-β1 induced TAK1 expression at mRNA and protein levels in the renal tubular epithelial HK-2 cells. A: the mRNA levels of TAK1 were determined by real-time PCR; B:the protein levels of TAK1 and p-TAK1Ser412were determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖1 TGF-β1誘導(dǎo)腎小管上皮細胞TAK1表達

2 TAK1 shRNA對TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細胞纖維化相關(guān)蛋白表達的影響

在HK-2細胞中感染TAK1 shRNA慢病毒后，經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)處理，細胞中的p-TAK1Ser412蛋白、TAK1蛋白和mRNA均降低(P<0.05)。TAK1 shRNA能夠下調(diào)TGF-β1刺激下HK-2細胞中TAK1的mRNA和蛋白水平。HK-2細胞經(jīng)過TGF-β1誘導(dǎo)處理以后，細胞分泌的I型膠原和III型膠原水平均升高，細胞中α-SMA和CTGF表達水平升高(P<0.05)；下調(diào)TAK1可以明顯降低TGF-β1誘導(dǎo)處理的HK-2細胞分泌I型膠原和III型膠原，抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細胞中α-SMA和CTGF蛋白表達和p38 MAPK磷酸化，見圖2、圖3A和表1。

3 p38 MAPK激活劑anisomycin對腎小管上皮HK-2細胞膠原合成及α-SMA和CTGF蛋白表達的作用

Figure 2.The effects ofTAK1knock-down by shRNA on the collagen secretion and phosphorylated TAK1 expresion in renal tubular epithelial HK-2 cells with TGF-β1 stimulation. Mean±SD.n=3.#P<0.05vsTGF-β1 group;*P<0.05vscontrol group.

圖2 TAK1 shRNA對TGF-β1刺激下腎小管上皮HK-2細胞分泌膠原和TAK1磷酸化的影響

Figure 3.A: the effects ofTAK1knock-down by shRNA on the phosphorylation of p38 MAPK and the protein expression of α-SMA and CTGF in the renal tubular epithelial HK-2 cells with TGF-β1 stimulation. B: the effects of p38 MAPK activation on the protein expression of α-SMA and CTGF in the renal tubular epithelial HK-2 cells withTAK1knock-down.

圖3 腎小管上皮HK-2細胞的p38 MAPK磷酸化及α-SMA和CTGF蛋白的表達

以p38 MAPK激活劑anisomycin處理敲減TAK1表達的腎小管上皮HK-2細胞，細胞中的p-p38 MAPK、 α-SMA和CTGF蛋白表達水平升高(P<0.05),見圖3B和表2；細胞分泌的I型膠原、III型膠原增多(P<0.05)，見圖4。

表1 敲減TAK1表達對TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮HK-2細胞中α-SMA、CTGF和磷酸化p38 MAPK蛋白水平的影響

Table 1.The effect ofTAK1knock-down by shRNA on the phosphorylation of p38 MAPK and the protein expression of α-SMA and CTGF in the renal tubular epithelial HK-2 cells with TGF-β1 stimulation (Mean±SD.n=3)

Groupα-SMACTGFp-p38 MAPKThr 180/Tyr 182p38 MAPKControl0.21±0.030.29±0.040.23±0.040.59±0.05TGF-β10.51±0.06?0.56±0.05?0.45±0.06?0.61±0.08TGF-β1+sh-NC0.47±0.050.57±0.070.44±0.080.60±0.04TGF-β1+sh-TAK10.38±0.03#0.42±0.06#0.31±0.03#0.59±0.07

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsTGF-β1 group.

Figure 4.The effects of p38 MAPK activation on the collagen type I and collagen type III synthesis in the renal tubular epithelial HK-2 cells withTAK1knock-down. Mean±SD.n=3.#P<0.05vsTGF-β1+sh-TAK1 group.

圖4 激活p38 MAPK對敲減TAK1的腎小管上皮細胞I型膠原和III型膠原水平的影響

討 論

腎組織纖維化是誘導(dǎo)終末期腎病發(fā)生的重要原因之一，腎組織纖維化發(fā)生時，腎小管上皮細胞功能異常，腎小管上皮細胞分泌的α-SMA和CTGF等纖維化因子及I型膠原和III型膠原等細胞外基質(zhì)水平升高，導(dǎo)致腎臟中纖維化組織大量增生，破壞腎小管正常結(jié)構(gòu)[8]。目前對于腎小管組織纖維化的發(fā)生機制研究尚不透徹，其中TGF-β1是腎組織纖維化發(fā)生的細胞因子之一，其在腎組織纖維化發(fā)生時含量升高，是一種纖維化促進因子[9-10]。本實驗結(jié)果顯示，TGF-β1處理后的腎小管上皮細胞分泌的I型膠原和III型膠原含量增多，細胞中α-SMA和CTGF蛋白水平升高，構(gòu)建了TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞纖維化模型。

TAK1最早是在人MAPK通路研究中發(fā)現(xiàn)的蘇氨酸/絲氨酸蛋白激酶，其屬于MAP3K蛋白家族成員，因其可以被TGF-β1等細胞因子激活而得名，TAK1蛋白由606個氨基酸構(gòu)成，其羧基端是一個調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，氨基端是一個激酶活性區(qū)域，此外，TAK1還含有一個ATP結(jié)合位點，能夠調(diào)控TAK1酶活性[11-12]。TAK1與機體炎癥和應(yīng)激等有關(guān)，在人體不同組織中的表達水平不同，TAK1與人體正常胚胎發(fā)育和神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)等有關(guān)[13-14]。近年來的研究表明，TAK1在腎組織纖維化中表達上調(diào)，福辛普利在減輕腎間質(zhì)纖維化大鼠纖維化程度的同時可以下調(diào)TAK1的表達水平，TAK1可能在腎組織纖維化中發(fā)揮促進作用[7, 15-16]。本實驗研究表明，TGF-β1處理后的腎小管上皮HK-2細胞中TAK1表達水平升高，并且敲減TAK1的表達可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮HK-2細胞纖維化因子表達和合成，這證實了TAK1在腎小管上皮HK-2細胞纖維化中的作用。

表2 激活p38 MAPK對敲減TAK1的腎小管上皮HK-2 細胞中α-SMA和CTGF蛋白水平影響

Table 2.The effect of p38 MAPK activition on the protein levels of α-SMA and CTGF in the renal tubular epithelial HK-2 cells after knock-down ofTAK1expression (Mean±SD.n=3)

Groupα-SMACTGFp-p38 MAPKThr 180/Tyr 182p38 MAPKTGF-β1+sh-TAK10.36±0.050.39±0.040.38±0.050.69±0.07TGF-β1+sh-TAK1+anisomycin0.75±0.09#0.68±0.05#0.52±0.06#0.70±0.08

#P<0.05vsTGF-β1+sh-TAK1 group.

目前對于TAK1生物學(xué)功能相關(guān)機制的研究表明，TAK1可以通過三級激酶激活下游p38 MAPK信號通路，基因敲除TAK1的小鼠中p38 MAPK信號被抑制，RNAi技術(shù)下調(diào)人視網(wǎng)膜色素上皮細胞中TAK1的表達可以抑制細胞中p38 MAPK的磷酸化[17-18]。p38 MAPK是MAPK信號通路中功能最為廣泛的分支之一，其在人體組織中廣泛存在，參與調(diào)控細胞生長、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激等過程[19-21]。p38 MAPK與纖維化疾病的發(fā)生有關(guān)，其在腎組織纖維化中過度激活，具有促進腎組織纖維化的作用[22-23]。本實驗表明，TGF-β1處理后的腎小管上皮HK-2細胞中p38 MAPK磷酸化水平升高，下調(diào)TAK1可以降低腎小管上皮HK-2細胞中p38 MAPK磷酸化水平，并且p38 MAPK激活劑可以逆轉(zhuǎn)敲減TAK1表達對腎小管上皮HK-2細胞纖維化的抑制作用，敲減TAK1表達通過抑制p38 MAPK信號發(fā)揮抗腎小管上皮細胞纖維化的作用。