戴文芝， 葉文峰， 何 原， 陳 燦， 黃石安， 雷 桅△， 郭 軍

(廣東醫(yī)科大學(xué) 1心血管疾病研究室， 2附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科中心， 廣東 湛江 524000； 3暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科， 廣東 廣州 510632)

缺血性心臟病是心血管系統(tǒng)中致死率和致殘率最高的疾病之一，臨床使用經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)疏通狹窄甚至閉塞的冠狀動(dòng)脈管腔，從而改善心肌血流灌注和阻止梗死面積擴(kuò)大，是治療缺血性心臟病的基本原則和有效方法[1]。然而心肌恢復(fù)血流過程會(huì)造成缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷，使治療效果減弱甚至加重心肌梗死[2]，因此I/R損傷的發(fā)生機(jī)制一直是心臟保護(hù)研究領(lǐng)域的重點(diǎn)和難點(diǎn)。目前導(dǎo)致心肌I/R損傷的途徑尚不清楚，一般認(rèn)為可能與以下機(jī)制有關(guān)：(1)細(xì)胞自噬(autophagy)，自噬在缺血缺氧等應(yīng)激狀態(tài)下能維持細(xì)胞的存活，但是過分激活會(huì)損傷細(xì)胞，目前研究充分表明I/R特別是再灌注期間自噬上調(diào)會(huì)損傷心肌細(xì)胞[3-4]；(2)細(xì)胞焦亡(pyroptosis)，當(dāng)心肌細(xì)胞發(fā)生I/R時(shí)，激活活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)系統(tǒng)和炎癥反應(yīng)，從而引起細(xì)胞的焦亡損傷[5]；(3)細(xì)胞凋亡(apoptosis)，在嚙齒動(dòng)物心肌I/R模型中，觀察到細(xì)胞凋亡在再灌注后顯著增加[6]。但是細(xì)胞自噬、細(xì)胞焦亡和細(xì)胞凋亡等不同途徑在I/R心肌損傷過程中是否同時(shí)發(fā)生未見報(bào)道，本研究建立人心肌AC16細(xì)胞的缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)細(xì)胞模型，探討不同復(fù)氧時(shí)間細(xì)胞自噬、細(xì)胞焦亡和細(xì)胞凋亡的作用，以期深入揭示I/R心肌損傷的發(fā)病過程和分子機(jī)制，從而為缺血性心臟病防治提供依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)試劑

人心肌AC16細(xì)胞株購(gòu)自ATCC。低糖DMEM培養(yǎng)基(HyClone)；無(wú)糖DMEM培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素、胎牛血清、0.25%胰酶-EDTA和PBS(Gibco)；CCK-8試劑盒、細(xì)胞裂解液、ECL發(fā)光試劑盒和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(南京碧云天生物技術(shù)研究所)；兔抗人LC-3、caspase-1、cleaved gasdermin D、cleaved caspase-3、Bax、Bcl2和α-tubulin多克隆抗體(CST)。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 采用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，每3 d更換1 次培養(yǎng)基，取3～5代生長(zhǎng)良好的AC16細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞隨機(jī)分為5組：空白對(duì)照(normal control, N)組，未做任何處理；缺氧組(0 h組)，無(wú)糖、無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞并置于37 ℃、含1% O2的培養(yǎng)箱中缺氧處理24 h；3個(gè)缺氧復(fù)氧組，缺氧處理后將培養(yǎng)基換成含10%胎牛血清的低糖DMEM，置于37 ℃、21% O2條件下分別復(fù)氧處理2 h(2 h組)、6 h(6 h組)和12 h(12 h組)。

2.2CCK-8法檢測(cè)心肌細(xì)胞活力 每組AC16細(xì)胞設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，每孔加入含10 μL CCK-8的培養(yǎng)基 100 μL，并設(shè)置調(diào)零孔，置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育2 h。450 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)細(xì)胞液的吸光度(A)值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3Western blot法檢測(cè)相關(guān)蛋白的水平 細(xì)胞分組處理后，用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定各組蛋白濃度。90 ℃使蛋白變性，取相同質(zhì)量蛋白上樣，進(jìn)行SDS-PAGE， 60 V、60 min和90 V、60 min條件下電泳，結(jié)束后用濕轉(zhuǎn)法90 V、120 min將蛋白從凝膠上轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%脫脂牛奶封閉1 h，加I 抗4 ℃搖床孵育過夜(LC-3 1∶1 000、caspase-1 1∶500、cleaved gasdermin D 1∶500、cleaved caspase-3 1∶1 000、Bax 1∶1 000、Bcl2 1∶1 000和α-tubulin 1∶1 000)。相應(yīng)的HRP標(biāo)記 II抗(1∶2 000)常溫孵育1 h，用TBST 洗膜5次，每次5 min,ECL 發(fā)光，顯影，Tanon 5200成像系統(tǒng)檢測(cè)目的蛋白并拍照，ImageJ軟件分析目的蛋白灰度值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用GraphPad Prism5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 缺氧復(fù)氧后心肌AC16細(xì)胞活力下降

與空白對(duì)照組比，缺氧組細(xì)胞活力下降(P<0.01)，復(fù)氧2 h組、復(fù)氧6 h組和復(fù)氧12 h組的細(xì)胞活力均比缺氧組進(jìn)一步降低(P<0.05)，且復(fù)氧6 h組比復(fù)氧2 h組的細(xì)胞活力低，但隨著復(fù)氧時(shí)間延長(zhǎng)至12 h，其細(xì)胞活力與復(fù)氧6 h組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖1。

Figure 1.The cell vitality from each group determined by CCK-8 assay. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsN group;#P<0.05，##P<0.01vs0 h group.

圖1 CCK-8法測(cè)定各組細(xì)胞的活力

2 AC16細(xì)胞自噬隨復(fù)氧時(shí)間延長(zhǎng)而減弱

與空白對(duì)照組比，缺氧組、復(fù)氧2 h組、復(fù)氧6 h組和復(fù)氧12 h組的AC16細(xì)胞LC3-Ⅱ/-I比值增加，表明細(xì)胞自噬水平顯著上調(diào)(P<0.01)。然而，與缺氧組AC16細(xì)胞相比，復(fù)氧6 h組和復(fù)氧12 h組細(xì)胞自噬水平則顯著下降(P<0.05)，見圖2。

3 缺氧復(fù)氧后心肌 AC16細(xì)胞發(fā)生焦亡

與空白對(duì)照組相比，缺氧組AC16細(xì)胞的pro-caspase-1蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)，但cleaved caspase-1和cleaved gasdermin D未見明顯變化。當(dāng)復(fù)氧6 h和12 h時(shí)，AC16細(xì)胞的焦亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-1和cleaved gasdermin D蛋白水平均顯著增加(P<0.05)，從而提示缺氧復(fù)氧6 h后AC16心肌細(xì)胞焦亡被激活，見圖3。

4 缺氧復(fù)氧致心肌 AC16細(xì)胞凋亡

缺氧及復(fù)氧處理2 h和6 h后，AC16細(xì)胞的凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3表達(dá)量和Bax/Bcl2比值與空白對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，當(dāng)復(fù)氧處理12 h后，cleaved caspase-3表達(dá)量和Bax/Bcl2 比值明顯上調(diào)(P<0.05)，說明此時(shí)心肌 AC16細(xì)胞啟動(dòng)凋亡程序，見圖4。

Figure 2.The LC3-Ⅱ/-Ⅰ ratio in the AC16 cells after hypoxia/reoxygenation treatments for different times. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsN group;#P<0.05,##P<0.01vs0 h group.

圖2 缺氧復(fù)氧處理后AC16細(xì)胞LC3-Ⅱ/-I變化

Figure 3.The protien levels of pro caspase-1, cleaved caspase-1 and cleaved gasdermin D in the AC16 cells after hypoxia/reoxygenation treatments for different tmes. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsN group;#P<0.05,##P<0.01vs0 h group.

圖3 缺氧復(fù)氧處理后AC16細(xì)胞pro-caspase-1、cleaved caspase-1和cleaved gasdermin D的蛋白水平比較

討 論

缺血再灌注對(duì)心肌細(xì)胞造成嚴(yán)重?fù)p傷，再灌注過程中發(fā)生的細(xì)胞自噬、細(xì)胞焦亡、細(xì)胞凋亡與心肌梗死面積大小和心梗后左心重塑密切相關(guān)[7-9]，揭示細(xì)胞損傷途徑在不同再灌注時(shí)間的啟動(dòng)時(shí)間和狀態(tài)，有利于探討更有效的心肌保護(hù)方法。

AC16細(xì)胞是來源于人胚胎的心肌細(xì)胞，不能發(fā)生搏動(dòng)，但與人心肌細(xì)胞有相似的功能和特性。本研究采用心肌 AC16細(xì)胞建立缺氧復(fù)氧模型，模擬人體心肌缺血再灌注過程，并設(shè)置不同的復(fù)氧時(shí)間，來探討不同復(fù)氧時(shí)間細(xì)胞自噬、焦亡和凋亡的激活狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)隨著復(fù)氧時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞活力下降，證實(shí)復(fù)氧會(huì)對(duì)心肌細(xì)胞造成劇烈損傷。而觀察不同復(fù)氧時(shí)間心肌細(xì)胞狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)缺氧組心肌細(xì)胞自噬水平升高，復(fù)氧時(shí)間增加時(shí)自噬水平下降，但與空白對(duì)照組相比，細(xì)胞自噬水平仍處于較高程度。因此缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞自噬，復(fù)氧則抑制自噬。Sandanger等[10]提出細(xì)胞焦亡在小鼠缺血再灌注后的心肌組織中被上調(diào)，然而本研究發(fā)現(xiàn)缺氧并不會(huì)引起細(xì)胞焦亡的發(fā)生，僅在復(fù)氧6 h后啟動(dòng)細(xì)胞焦亡，但細(xì)胞凋亡出現(xiàn)在復(fù)氧12 h，從而表明在缺氧復(fù)氧過程中心肌 AC16細(xì)胞焦亡早于凋亡，且復(fù)氧12 h后細(xì)胞開始遭受多途徑的復(fù)合損傷。

Figure 4.The protein levels of cleaved caspase-3, Bax and Bcl2 in the AC16 cells after hypoxia/reoxygenation treatments for different times. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 h group.

圖4 缺氧復(fù)氧處理后AC16細(xì)胞cleaved caspase-3、Bax和Bcl2蛋白水平的比較

本課題為研究缺血性心臟病發(fā)生的病理過程和細(xì)胞分子機(jī)制提供一種思路，同時(shí)也存在一定局限性。首先，人心肌 AC16細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型無(wú)法完全還原體內(nèi)心肌缺血再灌注狀態(tài)，人體復(fù)雜的心血管系統(tǒng)會(huì)受到其他多重因素的影響；其次，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生焦亡時(shí)會(huì)釋放促炎細(xì)胞因子如IL-1和IL-18等，造成細(xì)胞炎性損傷[11-12]。Taabazuing等[13]發(fā)現(xiàn)在單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中細(xì)胞凋亡和細(xì)胞焦亡存在雙向串?dāng)_，但在缺氧復(fù)氧模型中細(xì)胞凋亡與焦亡之間是否存在關(guān)聯(lián)，以及細(xì)胞自噬、細(xì)胞焦亡和細(xì)胞凋亡的激活是否存在網(wǎng)絡(luò)化協(xié)同作用還有待進(jìn)一步探討。

綜上所述，心肌 AC16細(xì)胞缺氧復(fù)氧導(dǎo)致的細(xì)胞自噬、焦亡和凋亡并非同時(shí)激活，缺氧啟動(dòng)心肌細(xì)胞自噬，但是在復(fù)氧過程中細(xì)胞自噬水平逐漸下降，而焦亡和凋亡水平升高，且焦亡早于凋亡發(fā)生。因此心肌缺血性損傷的干預(yù)和保護(hù)策略也應(yīng)該針對(duì)不同時(shí)期和不同損傷機(jī)制進(jìn)行相應(yīng)處理才能取得最佳效果。