鄧青山, 王 東, 張 超, 吳 蛟, 王 翰, 邱 俊, 陶裕川, 周世軍, 易 勇
(四川省宜賓市第二人民醫(yī)院神經(jīng)外科, 四川 宜賓 644000)
阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)是最常見的引起癡呆的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,主要表現(xiàn)為進(jìn)行性的記憶缺失和認(rèn)知功能障礙,嚴(yán)重影響患者日常生活水平,已躍居成為導(dǎo)致老年人群晚年精神行為障礙和危及生命的首要因素[1]。本病從明確診斷到患者死亡通常只有3~9年的時間[2]。盡管最近數(shù)十年對AD發(fā)病機(jī)理的認(rèn)識不斷深入,但始終沒有十分確切有效的早期防治方法,仍以對癥治療為主。因此,探尋有效的臨床預(yù)防和治療方式具有重要意義。
AD的主要病理特征為細(xì)胞外β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein,Aβ)沉積和細(xì)胞內(nèi)過量的tau蛋白磷酸化形成神經(jīng)纖維纏結(jié),從而引起氧化應(yīng)激和慢性炎癥性損傷,導(dǎo)致突觸功能障礙和異常神經(jīng)元丟失等[3-4]。淀粉蛋白假說指出,腦內(nèi)過多的Aβ肽,尤其是Aβ42的存在是引起老年斑形成、神經(jīng)纖維纏結(jié)、突觸功能障礙和丟失、神經(jīng)元死亡的主要原因[5-6];乏氧則加速這一病理過程的進(jìn)展,在AD發(fā)病中起著重要促進(jìn)作用[7]。因此,根據(jù)AD的淀粉蛋白假說,靶向于Aβ的治療,如減少Aβ產(chǎn)生和聚積,促進(jìn)Aβ清除,以改善Aβ誘導(dǎo)的繼發(fā)損傷,是治療AD的重要手段[8]。在眾多的藥物治療策略中,鈣調(diào)磷酸酶(calcineurin)、膽堿酯酶抑制劑和谷氨酸受體拮抗劑等藥物具有良好的耐受性和低毒性,并可顯著改善AD模型小鼠的記憶功能和神經(jīng)病理表現(xiàn)[9-11]。然而,這些藥物靶點(diǎn)單一,作用效果只能局限于某些方面,與AD復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制和多種神經(jīng)遞質(zhì)改變的特性相差甚遠(yuǎn),只能暫時緩解AD的癥狀,而不能完全改善和逆轉(zhuǎn)AD的退行性神經(jīng)病理過程。
高壓氧(hyperbaric oxygen,HBO)是指在超過1個大氣壓的環(huán)境中,呼吸的氧分壓大于1.0絕對大氣壓 (atmosphere absolute, ATA)。HBO治療能明顯地改變機(jī)體對氧的攝取和利用,提高血氧分壓,增強(qiáng)血氧彌散能力。目前HBO作為一種治療手段廣泛應(yīng)用于臨床,其治療疾病的機(jī)理被認(rèn)為是高壓氧使血液中物理溶解的氧含量增加,提高血氧分壓,增強(qiáng)血氧彌散能力,明顯改善缺血、缺氧組織血供,改善組織炎癥反應(yīng),增強(qiáng)微循環(huán)功能。然而許多療效并不能用上述機(jī)理完全闡釋清楚,因此人們一直在為探尋高壓氧治療疾病的更深層次的機(jī)理而不懈努力。
高壓氧作為目前糾正腦組織缺氧唯一有效的物理因素,可以通過增加血管的氧容量并增強(qiáng)血管通透性,增加進(jìn)入腦組織的氧含量從而起到改善腦組織缺氧微環(huán)境的狀況。既往諸多體外、體內(nèi)研究均已證明高壓氧作為輔助治療對腦損傷、腦缺血等有顯著的神經(jīng)保護(hù)與功能恢復(fù)作用,然而關(guān)于高壓氧作為單一因素是否對中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病如AD等具有顯著影響,目前缺少相關(guān)研究報道。因此,本研究希望通過探討HBO對AD病理改變及認(rèn)知功能的影響,從而為高壓氧用于AD的治療提供一些科學(xué)依據(jù)。
APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠和同窩來源的野生型C57BL/6J小鼠均從南京大學(xué)動物模式研究所購買;3月齡的雄性AD模型鼠30只,野生型鼠15只,體重平均約20 g,動物合格證號為201702666。所有小鼠分籠飼養(yǎng),每籠5只,飼養(yǎng)于宜賓市第二人民醫(yī)院實(shí)驗中心動物房。動物房常年溫度控制在(24±2) ℃,濕度55%~65%,每天光照12 h,時間09:00~21:00。所有小鼠均飼喂全營養(yǎng)顆粒飼料和無菌雙蒸水。所有實(shí)驗動物的管理和使用均遵守中華人民共和國衛(wèi)生部動物實(shí)驗管理條例、宜賓市第二人民醫(yī)院實(shí)驗動物管理條例,所有實(shí)驗動物的使用均獲得相應(yīng)實(shí)驗動物管理委員批準(zhǔn)。
Aβ40 ELISA試劑盒和Aβ42 ELISA試劑盒購自Invitrogen;抗BACE1 抗體購自CST;抗Aβ抗體購自Covance;抗APP抗體和抗β-actin抗體購自Sigma;抗synaptophysin抗體購自Abcam;山羊抗小鼠HRP-IgG(H+L)抗體和山羊抗兔 HRP-IgG(H+L)抗體購自北京中杉金橋公司。
3.1動物分組與高壓氧治療 將購買的3個月齡的AD模型小鼠和野生型小鼠分組:野生型(wild-type,WT)組、AD模型(transgenic, TG)組和AD模型HBO治療(TG+HBO)組。飼養(yǎng)到4個月齡時,治療組進(jìn)行高壓氧治療,治療結(jié)束再次麻醉小鼠后斷頭取鼠腦標(biāo)本,進(jìn)行后續(xù)行為學(xué)和生化實(shí)驗。高壓氧治療:TG+HBO組小鼠被放置于高壓氧倉中,予以2 ATA的100%純氧治療,每次持續(xù)時間1 h;加壓及減壓過程各經(jīng)5 min緩慢進(jìn)行。治療過程中實(shí)際監(jiān)測氧濃度均達(dá)96%以上。WT和TG組小鼠同時放置于高壓氧倉中,但不給予高壓氧治療。小鼠共進(jìn)行6個療程治療,一療程為5 d,休息2 d后再進(jìn)入下一療程。
3.2Morris水迷宮實(shí)驗 本實(shí)驗水迷宮采用直徑1.2 m、深0.5 m的圓形溫控水箱,水箱正東、南、西、北壁上分別粘貼不同形狀和顏色的直徑20 cm塑料板作為空間標(biāo)記。水位控制在20 cm,水溫設(shè)定于22±1 ℃,將一個15 cm直徑的圓形透明平臺置于目的象限中央,浸沒于水下1 cm。白色人工食用色素調(diào)節(jié)水背景為白色。數(shù)據(jù)采集軟件使用Noldus公司EthoVision XT監(jiān)測分析軟件。
小鼠連續(xù)訓(xùn)練5 d,每天訓(xùn)練4次。同天的4次實(shí)驗中,每次使用不同的起始位點(diǎn)(東、南、西、北4個位點(diǎn),各位點(diǎn)間距相等),將小鼠頭部面向水槽壁輕放入水中。每次訓(xùn)練最長持續(xù)時間為90 s,或者直到小鼠找到逃生平臺時結(jié)束。如果小鼠在90 s內(nèi)沒有找到逃生平臺,則人為地將小鼠引導(dǎo)到平臺。無論小鼠是否找到平臺,都讓其在平臺上停留10 s。在整個訓(xùn)練過程中,逃生平臺位置保持不變,記錄小鼠每次訓(xùn)練的逃生時間、逃生距離和游泳速度等數(shù)據(jù)。于第6天,撤掉逃生平臺,從平臺所在象限的對立向限放入小鼠,記錄在60 s內(nèi)小鼠穿過逃生平臺區(qū)域的次數(shù)。
3.3老年斑計數(shù)和面積分析 每組選6只小鼠,每只小鼠依據(jù)冰凍切片由前向后依次選取4張切片做老年斑計數(shù),每只小鼠所選取切片位置大致相同。每張切片經(jīng)免疫熒光染色后,于熒光顯微鏡下拍攝大體圖像,在ImageJ中打開圖像,計數(shù)每張切片中老年斑的數(shù)量和面積、鼠腦切片的總面積。老年斑的密度以每張切片中老年斑的數(shù)量表示;老年斑的面積以每張切片中老年斑的總面積占整張切片中腦組織的面積比表示。
3.4Western blot實(shí)驗 鼠腦蛋白樣本制備:小鼠經(jīng)3.6%水合氯醛麻醉后,斷頸處死小小鼠,立即取鼠腦,予以預(yù)冷的RIPA裂解液勻漿處理后充分裂解組織,經(jīng)12 000×g、 4 ℃離心30 min,提取蛋白上清液,按照BCA法測定蛋白濃度。留存一部分用于ELISA檢測;剩余部分加入蛋白上樣loading buffer混勻,95 ℃ 加熱5 min,-80 ℃儲存。 配制10%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE;取電泳完成的凝膠,切取包括目的條帶的凝膠塊,根據(jù)蛋白分子量大小選用0.45 μm PVDF膜進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)膜;5% BSA進(jìn)行封;封閉結(jié)束后予以相應(yīng) I 抗4°C孵育過夜; II 抗室溫孵育2 h;成像儀中觀察和拍照。
3.5酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗 用于定量檢測Aβ40/42的ELISA試劑盒購自Invitrogen。鼠腦樣本經(jīng)制備成蛋白上清液后,嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書步驟完成樣本檢測。
3.6高爾基染色檢測樹突棘密度 高爾基染色試劑盒購自FD Neuro Technologies。根據(jù)試劑盒操作流程制作高爾基染色切片,并對染色腦片在Leica激光共聚焦顯微鏡下采用Z軸多層掃描。用ImageJ軟件對樹突棘的密度進(jìn)行測量分析。
所有數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示,2組樣本間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗,3組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
我們檢測了APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦中Aβ水平,發(fā)現(xiàn)高壓氧治療組小鼠腦中Aβ40和Aβ42水平明顯低于對照組(P<0.01),見圖1A、B。免疫熒光染色結(jié)果顯示,高壓氧治療組小鼠腦中老年斑數(shù)量和老年斑所占腦切片面積均要顯著低于對照組(P<0.01),見圖1C~E。
我們通過對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦標(biāo)本進(jìn)行蛋白檢測發(fā)現(xiàn),經(jīng)高壓氧治療后鼠腦中Sirt1蛋白水平明顯增加,而BACE1的蛋白水平明顯減低(P<0.01);β-CTF作為BACE1蛋白分解APP蛋白的代謝產(chǎn)物,與對照組的APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦標(biāo)本相比,高壓氧治療減少β-CTF的形成(P<0.01);但是高壓氧治療并未改變鼠腦中APP蛋白的表達(dá)水平,見圖2。這些結(jié)果表明高壓氧治療可通過上調(diào)Sirt1蛋白水平,從而減低BACE1蛋白的表達(dá),并最終減少APP的淀粉蛋白途徑降解。
我們通過對3組鼠腦標(biāo)本進(jìn)行高爾基染色檢測神經(jīng)元樹突棘發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)元樹突棘密度明顯降低,而高壓氧治療可以增加樹突棘的密度(P<0.01),但仍未能達(dá)到正常小鼠水平(P<0.05),見圖3A。對反映神經(jīng)突觸水平的synaptophysin進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因小鼠synaptophysin蛋白水平明顯降低,而高壓氧治療可以增加synaptophysin的水平(P<0.01),但TG+HBO組與WT組比較差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性,見圖3B。
Figure 1.Treatment with HBO reduced Aβ generation and plaque formation in the brains ofAPP/PS1transgenic (TG) mice. A and B: ELISA analysis of the Aβ40 and Aβ42 levels in the brain of transgenic mice treated with or without HBO; C: coronal sections of brain of transgenic mice after MWM test were immunostained for Aβ and counterstained with DAPI (scale bar=250 μm); D and E: the number of and the size of amyloid plaques of the transgenic mice were quantified. Mean±SEM.n=6.**P<0.01vsTG group.
圖1 高壓氧治療能減少APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦中Aβ的產(chǎn)生和老年斑的形成
對3組小鼠進(jìn)行水迷宮試驗檢測發(fā)現(xiàn),TG組小鼠的逃生時間顯著長于WT組(P<0.01);而高壓氧治療逆轉(zhuǎn)了這一情況,TG+HBO組與TG組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),且TG+HBO組的逃生時間與WT組接近,差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性,見圖4A。對穿越逃生平臺的次數(shù)進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn),TG組穿越逃逃生平臺的次數(shù)明顯少于WT組,而TG+HBO組的穿越次數(shù)明顯多于TG組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),TG+HBO組與WT組比較差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性,見圖4B。
AD是嚴(yán)重威脅人類健康的一種老年神經(jīng)退行性疾病,其病理機(jī)制復(fù)雜多樣,發(fā)病隱匿,病理進(jìn)程緩慢,而且AD起病伴隨著諸多病理生理性蛋白表達(dá)和信號通路的改變。BACE1是APP降解產(chǎn)生Aβ的關(guān)鍵酶,AD模型小鼠中BACE1的蛋白表達(dá)水平顯著高于同齡野生小鼠[12];在AD患者的腦樣本中也檢測到BACE1的蛋白水平和酶活性都比非AD病人腦中BACE1蛋白水平和酶活性有顯著升高[13]。目前許多臨床藥物研究都靶向于BACE1,希望通過下調(diào)BACE1蛋白水平及其酶活性從而減少Aβ的產(chǎn)生憶功能障礙,具有明確的治療作用。
Figure 2.Treatment with HBO increased the protein levels of Sirt1, and reduced the protein level of BACE1 and the cleavage of APP by BACE1 in theAPP/PS1transgenic (TG) mice. Mean±SEM.n=6.**P<0.01vsTG group.
圖2 高壓氧治療能增加APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦中Sirt1的蛋白水平,降低BACE1的蛋白水平,從而減少β-CTF的產(chǎn)生,但高壓氧治療并不改變腦中APP的蛋白量
Figure 3.HBO treatment attenuated the loss of spines and synapses inAPP/PS1transgenic (TG) mice. A: representative images of spines of the mice (scale bar=25 μm) and the density of spines in each group; B: Western blot analysis of the levels of synaptophysin in the brain. Mean±SEM.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsWT group;##P<0.01vsTG group.
圖3 高壓氧治療能增加APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦神經(jīng)棘突數(shù)量與突觸素蛋白水平
及繼發(fā)的神經(jīng)病理改變。但由于藥物作用的特異性及單一性,目前仍很難全面改善AD的病理進(jìn)展。而高壓氧作為一種重要的臨床治療手段,其作用機(jī)制復(fù)雜多樣,能夠有效提升血氧水平,改善炎癥反應(yīng)、促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生、調(diào)節(jié)腦組織中多種關(guān)鍵蛋白的表達(dá),從而具有重要的改善神經(jīng)功能的作用。本實(shí)驗通過高壓氧治療APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)現(xiàn),高壓氧治療可以顯著減輕AD相關(guān)病理變化,逆轉(zhuǎn)小鼠學(xué)習(xí)記Sirt1蛋白在腦組織中有較高表達(dá),參與調(diào)節(jié)細(xì)胞糖代謝、炎癥反應(yīng)、抗細(xì)胞衰老與調(diào)亡等,在細(xì)胞存活及功能保存、預(yù)防疾病進(jìn)展、延長壽命方面具有重要作用。而且Sirt1能通過熱量限制,改善AD小鼠的Aβ產(chǎn)生,改善神經(jīng)病理及認(rèn)知功能障礙,是AD的一個新穎的潛在治療靶點(diǎn)[14]。對3xTg-AD小鼠腦進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)AD鼠腦中Sirt1的RNA及蛋白水平均明顯低于野生小鼠[15-16]。對APPswe/PS1dE9模型小鼠進(jìn)行Sirt1過表達(dá)后明顯減少了Aβ的水平及老年斑的數(shù)量,而沉默Sirt1后,Aβ水平明顯升高[17]。Xue等[18]對小鼠局灶性腦缺血的研究發(fā)現(xiàn)HBO治療可以增加Sirt1的蛋白水平,并改善腦缺血相關(guān)病理改變。本實(shí)驗在對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行高壓氧治療后進(jìn)行Sirt1蛋白水平檢測發(fā)現(xiàn)高壓氧治療也明顯增加了Sirt1的蛋白表達(dá)。同時高壓氧下調(diào)了BACE1的蛋白表達(dá),Aβ40和Aβ42水平均顯著降低,病理性老年斑的形成明顯減少。APP經(jīng)BACE1降解產(chǎn)生中間產(chǎn)物β-CTF,β-CTF則進(jìn)一步被裂解產(chǎn)生Aβ[19],因此β-CTF直接反映APP經(jīng)淀粉蛋白途徑降解的水平。本研究發(fā)現(xiàn)HBO治療后APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦中β-CTF水平明顯降低,這些結(jié)果都表明在APP/PS1轉(zhuǎn)基因模型鼠中,高壓氧治療可以通過增加Sirt1蛋白水平,減少APP降解產(chǎn)生Aβ,這與高壓氧可以上調(diào)腦中Sirt1蛋白表達(dá),以及Sirt1可以下調(diào)AD中APP淀粉蛋白途徑降解的理論相一致。
Figure 4.HBO treatment attenuated the learning and memory deficits in theAPP/PS1transgenic (TG) mice. Escape latencies (A) and the times that each group of mice swam across the target sites after retrieval of the platform (B) were analyzed. Mean±SEM.n=6.**P<0.01vsWT group;##P<0.01vsTG group.
圖4 高壓氧治療能改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)認(rèn)知功能障礙
進(jìn)行性加重的學(xué)習(xí)記憶障礙是AD突出的臨床表現(xiàn)。主要因為AD病理改變導(dǎo)致大腦突觸素蛋白和突觸數(shù)量減少,突觸可塑性的損害相關(guān)。而Aβ具有高神經(jīng)毒性,是導(dǎo)致突觸可塑性受損的關(guān)鍵因素。水迷宮能有效評估小鼠海馬學(xué)習(xí)記憶。本實(shí)驗也采用水迷宮檢測APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠經(jīng)高壓氧治療后海馬學(xué)習(xí)記憶的改善情況。結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)高壓氧治療后,APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力顯著改善,且接近于野生小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。而且,高爾基染色發(fā)現(xiàn)高壓氧治療后突觸密度及突觸素蛋白都顯著升高。這一結(jié)果表明高壓氧治療可能通過增加Sirt1蛋白表達(dá),降低BACE1蛋白水平,從而減少APP裂解產(chǎn)生Aβ,進(jìn)而減少Aβ的神經(jīng)毒性損傷,最終發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。Gao等[20]的研究表明Sirt1蛋白活化可以通過腦特異性miR-134進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)CREB的表達(dá),從而促進(jìn)突觸可塑性,而Sirt1功能失活則使突觸可塑性受損。這也說明高壓氧治療不僅通過改善AD病理,或許還可以通過Sirt1蛋白通路本身,調(diào)控突觸可塑性,改善學(xué)習(xí)記憶功能。
值得注意的是,本研究中觀察到APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠經(jīng)高壓氧治療減少Aβ產(chǎn)生與改善小鼠的病理及認(rèn)知障礙相一致。這一結(jié)果表明通過高壓氧治療增加Sirt1蛋白水平,減少BCE1蛋白水平,進(jìn)而減少老年斑,改善突觸可塑性是改善AD進(jìn)展的有效方式。但是,因為高壓氧治療本身具有改善炎癥反應(yīng),促進(jìn)海馬神經(jīng)發(fā)生,促進(jìn)軸突形成,調(diào)節(jié)突觸可塑性等多種復(fù)雜機(jī)制,因此,高壓氧對AD的神經(jīng)保護(hù)作用或許不能簡單地歸結(jié)于本研究所涉及的這個單一因素,仍有待我們進(jìn)一步深入研究。