王 茜， 冷 慧， 欒 曉， 郭菲菲， 高勝利， 孫向榮， 徐 珞

(青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)系， 山東 青島 266071)

中樞神經(jīng)系統(tǒng)參與調(diào)節(jié)攝食和能量代謝，并且通過調(diào)節(jié)特定腦區(qū)的攝食相關(guān)肽，進(jìn)而與外周器官(如胃腸道)密切聯(lián)系，從而保證內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。近年來，大量研究探討γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)對攝食及能量代謝的調(diào)控作用[1]，但較少涉及GABA對胃腸道的影響。

GABA是一種廣泛分布于哺乳動物體內(nèi)的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，其受體可根據(jù)藥理特征分為GABA-A受體(GABA-A receptor，GABA-AR)、GABA-B受體和GABA-C受體，其中GABA-AR為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)主要的抑制性受體[2]。GABA可活躍腦內(nèi)葡萄糖代謝，促進(jìn)乙酰膽堿的合成，抗驚厥，降低血壓，并維護(hù)腦細(xì)胞正常功能[2]。此外，先前已有研究表明GABA可能對胃腸運(yùn)動具有調(diào)節(jié)作用[3]，但目前尚不清楚GABA受體信號通路參與調(diào)節(jié)胃運(yùn)動或胃酸分泌的潛在機(jī)制。

伏隔核(nucleus accumbens，NAc)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中參與調(diào)控?cái)z食及獎勵性進(jìn)食的重要核團(tuán)之一，與調(diào)控胃功能也密切相關(guān)[4-5]。NAc位于前腦底部背側(cè)紋狀體腹側(cè)，包括核部和殼部2個亞區(qū)[6]。NAc內(nèi)的GABA能中脊神經(jīng)元可整合傳遞來的信息，并繼續(xù)傳遞到基底神經(jīng)節(jié)的腹側(cè)蒼白球和黑質(zhì)，從而參與調(diào)控穩(wěn)態(tài)平衡，尤其是對動機(jī)和情緒等相關(guān)活動所引起的攝食行為的調(diào)節(jié)[2]。

胰高血糖素樣肽1(glucagon-like peptide 1，GLP-1)是由人胰高血糖素基因編碼，并由腸道L細(xì)胞分泌的一種肽類激素，是目前發(fā)現(xiàn)的幾種厭食性神經(jīng)肽之一，因其在調(diào)節(jié)攝食及降低血糖等方面的作用而受到廣泛關(guān)注[7]。GLP-1能神經(jīng)元主要位于孤束核(nucleus tractus solitarius，NTS)，并可投射到進(jìn)食相關(guān)的許多腦區(qū)，如NAc和中腦腹側(cè)被蓋區(qū)(ventral tegmental area，VTA)[8]。GLP-1還能夠延緩胃內(nèi)容物排空；此外，胃牽張(gastric distension，GD)刺激可使GLP-1能神經(jīng)元興奮[9]。

目前尚不清楚下丘腦NAc外源性GABA對胃牽張敏感神經(jīng)元的調(diào)控及其潛在機(jī)制，以及GLP-1受體信號通路是否參與其中。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察NAc內(nèi)GABA對大鼠的胃運(yùn)動、胃酸分泌及GD敏感神經(jīng)元興奮性的影響，同時(shí)探究GLP-1R信號通路對其調(diào)控作用。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動物

雄性健康SD大鼠(體質(zhì)量為180～220 g)，購自山東省青島市藥物檢驗(yàn)研究所，動物合格證編號為SCXK(魯)0013329。實(shí)驗(yàn)動物房溫度設(shè)置為(21±3)℃，相對濕度為(60±5)%，光/暗周期為12 h，大鼠可自由飲水進(jìn)食。本實(shí)驗(yàn)飼養(yǎng)大鼠及實(shí)驗(yàn)方法均經(jīng)青島大學(xué)動物保護(hù)機(jī)構(gòu)委員會批準(zhǔn)，符合倫理學(xué)要求。

2 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

大鼠腦立體定位儀(Scientifica)；熒光顯微鏡(Olympus)；冰凍切片機(jī)(Kryostat 1720，Leica)。Cy3標(biāo)記的IgG抗體購自Jackson ImmunoResearch；GABA、抗 GABA-AR 抗體、GABA-AR拮抗劑荷包牡丹堿(bicuculline, BIC)、抗GLP-1R抗體和GLP-1R拮抗劑exendin 9-39(Ex9)均購自Sigma。

3 方法

3.1實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)1采用熒光免疫組化染色法，以10只大鼠為實(shí)驗(yàn)對象，主要觀察NAc內(nèi)GABA-AR免疫陽性神經(jīng)元及GLP-1R免疫陽性神經(jīng)元的分布。實(shí)驗(yàn)2采用單細(xì)胞外放電記錄實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)選取65只大鼠，探究微量注射GABA、GABA-AR拮抗劑BIC、GLP-1及GLP-1R拮抗劑Ex9對大鼠NAc內(nèi)GD神經(jīng)元興奮性的影響。實(shí)驗(yàn)3采用胃運(yùn)動實(shí)驗(yàn)，通過對GLP-1R信號通路的調(diào)控，觀察NAc外源性GABA及其受體對胃運(yùn)動的影響。隨機(jī)選取48只大鼠并分為8組：(1)0.5 μL生理鹽水(normal saline，NS)組；(2)0.5 μg/0.5 μL GABA；(3)2.5 μg/0.5 μL GABA；(4)5.0 μg/0.5 μL GABA；(5)10.0 μg/0.5 μL BIC組；(6)10.0 μg/0.25 μL BIC+2.5 μg/0.25 μL GABA組；(7)10.0 μg/0.5 μL Ex9組；(8)10.0 μg/0.25 μL Ex9+2.5 μg/0.25 μL GABA組。實(shí)驗(yàn)4采用胃酸分泌實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)選取48只大鼠并分為8組，分組情況同實(shí)驗(yàn)3。

3.2熒光免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn) 大鼠以硫代巴比妥鈉(0.1 g/kg，ip)麻醉后以4%多聚甲醛溶液灌注固定，以冰凍切片機(jī)連續(xù)冠狀切片(厚15 μm)，-20 ℃冰箱避光凍存。選取具有合適的NAc區(qū)域部位[10]的切片置于室溫環(huán)境，加入正常羊血清避光孵育2 h，加入抗GABA-AR抗體(1∶500)和抗GLP-1R抗體(1∶300)，空白對照組以正常羊血清代替 I 抗，同時(shí)避光過夜處理；加入Cy3標(biāo)記的羊抗兔抗體(1∶400)室溫環(huán)境避光孵育2 h，最后以PBS清洗切片并防淬滅熒光封片劑封片。BX50顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以DP50數(shù)碼相機(jī)(Olympus)拍照，并以Image-Pro Plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件進(jìn)行平均吸光度分析。

3.3腦部置管 大鼠禁食過夜，以硫代巴比妥鈉(0.1 g/kg，ip)麻醉并固定于三維腦立體定位儀(Narashige SN-3)。參照大鼠腦圖譜，在NAc(前囟1.70 mm，旁開0.80 mm，顱骨下5.50 mm)內(nèi)植入不銹鋼導(dǎo)管(26號，15 μm)，內(nèi)置內(nèi)芯防止堵塞。內(nèi)部給藥套管(29號，10 μm)經(jīng)聚乙烯管(10 cm)與微量注射器連接以便注射藥物。大鼠術(shù)后連續(xù)3 d腹腔注射8×104U青霉素防止感染，單籠飼養(yǎng)恢復(fù)7 d再行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.4電生理實(shí)驗(yàn) 大鼠禁食過夜，以腹腔注射10%水合氯醛(100 mg/kg)麻醉，沿其腹中線行一縱行切口，胃底行一小切口并取出胃內(nèi)容物。乳膠球囊(3～4 cm)通過切口插入胃腔并連接于聚乙烯管，結(jié)扎固定于切口邊緣，關(guān)閉腹腔。球囊充盈后的體積大于胃膨脹的容積，以此作為GD刺激。GD刺激時(shí)，向球囊內(nèi)以每秒0.5 mL的速度充入3～5 mL溫水(37 ℃)。

腹部手術(shù)后，大鼠俯臥位固定于腦立體定位儀。充分暴露大鼠顱骨后用牙科鉆鉆一小洞，切開硬腦膜并暴露腦組織，滴加溫瓊脂(3%生理鹽水)以保護(hù)神經(jīng)元穩(wěn)定性。在腦立體定位儀引導(dǎo)下，用液壓推進(jìn)器將事先拉制的5管玻璃微電極(尖端直徑10～20 μm，電阻5～15 MΩ)垂直置于NAc(位置如前)。記錄電極充以0.5 mol/L乙酸鈉和20 g/L的滂胺天藍(lán)，用于神經(jīng)元放電記錄。另外4管根據(jù)分組情況分別充以NS、GABA(10 nmol/L)、GLP-1(15 nmol/L)、BIC(20 nmol/L)或Ex9(20 nmol/L)。在NAc內(nèi)微量注射GABA(10 nmol/L)，觀察GABA對NAc內(nèi)GD神經(jīng)元放電活動的影響；待神經(jīng)元放電活動恢復(fù)，預(yù)先微量注射BIC(20 nmol/L)或Ex9(20 nmol/L)后再次微量注射GABA，觀察GABA所誘導(dǎo)放電效應(yīng)的改變。以MEZ-8201型微電極放大器將所得電信號經(jīng)輸入VC-11雙道示波器，進(jìn)行放電頻率處理與分析(SUMP-PC生物信號系統(tǒng))。神經(jīng)元興奮或抑制指標(biāo)為放電頻率變化率超過20%，依據(jù)其放電頻率升高或降低，將GD敏感神經(jīng)元進(jìn)一步分為胃牽張興奮(GD-E)神經(jīng)元和胃牽張抑制(GD-I)神經(jīng)元。

3.5胃運(yùn)動的測定 選擇腦部置管的大鼠，術(shù)前大鼠禁食18 h，硫代巴比妥鈉(0.1 g/kg，ip)麻醉后，沿大鼠環(huán)形肌方向在距幽門0.5 cm處縫合嵌入應(yīng)力傳感器。術(shù)后大鼠經(jīng)7 d恢復(fù)期，無疼痛或應(yīng)激反應(yīng)再行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。以胃運(yùn)動生理記錄儀(3066-23，四川成都精密儀器公司)收集并記錄大鼠胃收縮幅度及頻率。注藥前記錄穩(wěn)定30 min，注藥后再記錄60 min。

胃收縮幅度或頻率變化率(%)=(注射藥物后幅度或頻率-注射藥物前幅度或頻率)/注射藥物后幅度或頻率×100%。

3.6測定胃酸分泌量 大鼠禁食16 h后，腹腔注射硫代巴比妥鈉(0.1 g/kg)進(jìn)行麻醉。沿大鼠腹部中線放置雙腔插管，結(jié)扎賁門及幽門處。在0.5 h內(nèi)，收集5 mL灌流液，并計(jì)算其中的胃液排出量，以此作為基礎(chǔ)胃酸分泌量。通過自動滴定儀(COM-2500，Hiranuma Sangyo)用100 mmol/L氫氧化鈉滴定灌流液直至pH值為7.0。pH值以pH計(jì)(Thermo Fisher Scientific)測量。總酸產(chǎn)量(μEq)=滴定酸度(mL)×2×10。

3.7組織學(xué)檢驗(yàn) 細(xì)胞外放電記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，微電極接陰極，無關(guān)電極接陽極，50 μA的直流電通電 20 min，使電極內(nèi)滂胺天藍(lán)以微電泳形式進(jìn)入腦組織并標(biāo)記電極所在部位。4%多聚甲醛溶液灌注固定并快速斷頭取腦，甲醛溶液內(nèi)浸泡2 d，連續(xù)冠狀50 μm切片，以中性紅染色并檢查電極記錄位置，舍棄位置不符的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)。兩獨(dú)立樣本間比較采用t檢驗(yàn)。多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用的Bonferroni檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 NAc內(nèi)GABA-AR和GLP-1R的表達(dá)

為探討GABA或GLP-1是否能通過其受體激活NAc神經(jīng)元，觀察在NAc中GABA-AR或GLP-1R的表達(dá)。熒光免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，大鼠NAc可見GABA-AR(圖1A)或GLP-1R(圖1B)免疫陽性神經(jīng)元，且部分神經(jīng)元呈GABA-AR和GLP-1R抗體雙染現(xiàn)象，見圖1C。經(jīng)Image-Pro Plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件計(jì)數(shù)可得，在NAc內(nèi)GABA-AR平均吸光度值為0.487±0.024，GLP-1R平均吸光度值為0.418±0.019，雙染平均吸光度值為0.198±0.013，提示NAc可能為GABA或GLP-1的作用位點(diǎn)之一。

2 GABA對大鼠NAc內(nèi)GD神經(jīng)元放電活動的影響

在65只大鼠的NAc中共記錄到164個神經(jīng)元的自發(fā)放電活動，其中有119個(119/164，72.56%)神經(jīng)元對GD刺激有反應(yīng)。在這119個神經(jīng)元中，78個為GD-E神經(jīng)元，41個為GD-I神經(jīng)元。

為觀察GABA對大鼠NAc內(nèi)GD神經(jīng)元放電活動的影響，于NAc內(nèi)微量注射GABA。在78個GD-E神經(jīng)元中，有47個神經(jīng)元的放電頻率從(3.84±0.09) Hz降低到(1.15±0.05) Hz(P<0.05)，平均降低(70.05±20.21)%；在41個GD-I神經(jīng)元中，有27個神經(jīng)元的放電頻率從(3.81±0.14) Hz下降到(1.13±0.05) Hz(P<0.05)，平均下降(70.34±21.71)%，見圖2、表1。

Figure 1.GABA-AR and GLP-1R immunoreactive neurons in the NAc. A: GABA-AR immunoreactive neurons in the NAc; B: GLP-1R immunopositive neurons in the NAc; C: two-receptor dual-labeled neurons in the NAc; D: the position of the mouse brain map is displayed, and the red part indicates NAc. The scale bar=100 μm.

圖1 NAc中GABA-AR和GLP-1R免疫陽性反應(yīng)神經(jīng)元

Figure 2.The effect of microinjection of GABA on the discharge activity of GD neurons in the NAc. A: GD-E neurons; B: GD-I neurons; C: GD neuron discharge rate changes. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsNS group;#P<0.05vs1GABA group.

圖2 NAc微量注射GABA對GD神經(jīng)元放電活動的影響

表1 GABA對大鼠NAc內(nèi)GD神經(jīng)元放電活動的影響

Table 1.The effect of GABA on the discharge activity of GD neurons in rat NAc

NeuronnGABA responsivenessInhibitoryExcitatoryUnresponsiveGD-E7847(60.25%)19(24.36%)12(15.38%)GD-I4127(65.85%)9(21.95%)5(12.19%)

GD-E: gastric distension excitation; GD-I: gastric distension inhibition.

為了進(jìn)一步探究參與該過程的受體信號通路，本研究應(yīng)用了GABA-A受體拮抗劑BIC和GLP-1受體拮抗劑Ex9，觀察兩者對GABA效應(yīng)的影響。大鼠NAc預(yù)先微量注射BIC或Ex9，GABA對GD神經(jīng)元放電頻率的抑制作用可被BIC完全阻斷(P<0.05)，或被Ex9部分拮抗(P<0.05)，提示GABA對GD神經(jīng)元放電活動的影響作用可能主要依賴于GABA-A受體信號通路，且該過程涉及GLP-1受體信號通路；而單獨(dú)注射BIC對NAc內(nèi)GD神經(jīng)元的放電活動沒有明顯影響(P>0.05)，見圖2(BIC部分未顯示)。

3 NAc微量注射GABA對大鼠胃運(yùn)動的影響

在胃運(yùn)動曲線穩(wěn)定的情況下，向NAc微量注射不同濃度的GABA。結(jié)果表明，GABA可明顯增加胃收縮幅度和頻率，且呈劑量依賴關(guān)系(P<0.05或P<0.01)，見圖3。注射GABA后3 min左右，大鼠胃收縮幅度和頻率在8～13 min左右達(dá)到最大值。大鼠NAc微量注射GABA(2.5 μg)+BIC(10.0 μg)，或GABA(2.5 μg)+Ex9(10.0 μg)，BIC可顯著降低GABA對胃運(yùn)動的興奮作用(P<0.01),而Ex9可部分減弱GABA誘導(dǎo)的胃運(yùn)動(P<0.05)，見圖3。這提示NAc內(nèi)GABA-AR或GLP-1R信號通路在NAc對胃運(yùn)動的調(diào)節(jié)中起重要作用。NS、BIC和Ex9對胃運(yùn)動無明顯影響。

Figure 3.The effects of GABA microinjection into NAc on gastric motility. A: the rate of change in gastric motion amplitude; B: the rate of change in gastric motion frequency. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsNS group;#P<0.05,##P<0.01vs0.5 μg GABA group;△P<0.05,△△P<0.01vs2.5 μg GABA group;▲P<0.05,▲▲P<0.01vs10.0 μg Ex9 group.

圖3 NAc內(nèi)微量注射GABA對胃運(yùn)動的影響

4 NAc微量注射GABA對大鼠胃酸分泌的影響

與NS組相比，NAc微量注射GABA，大鼠胃液量和胃酸輸出量均明顯升高，且呈劑量依賴性(P<0.05或P<0.01)，見圖4。而大鼠NAc微量注射GABA(2.5 μg)+BIC(10.0 μg)，或GABA(2.5 μg)+Ex9(10.0 μg)，BIC可顯著降低GABA誘導(dǎo)的胃酸分泌增加(P<0.01)，Ex9可部分拮抗GABA誘導(dǎo)的胃酸分泌增加，pH值高于2.5 μg GABA組(P<0.05)，見圖4。這提示GABA可通過GABA-AR信號通路影響胃酸分泌，其調(diào)控過程涉及GLP-1受體信號通路。NS、BIC和Ex9對胃酸分泌無明顯影響。

Figure 4.The effects of GABA microinjection at different concentrations in the NAc on gastric acid secretion. A: gastric juice volume; B: gastric acid output. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsNS group;△△P<0.01vs2.5 μg GABA group;▲▲P<0.01vs10.0 μg Ex9 group.

圖4 NAc內(nèi)微量注射不同濃度GABA對胃酸分泌的影響

討 論

胃牽張刺激是一種可以引起胃部肌肉被動牽張，并刺激胃部傳入神經(jīng)信號的傳遞，進(jìn)而對神經(jīng)系統(tǒng)誘導(dǎo)的攝食行為產(chǎn)生負(fù)反饋調(diào)節(jié)的刺激活動[11]。各種動物實(shí)驗(yàn)均證實(shí)，表達(dá)于特定腦核[12]的各個神經(jīng)肽可參與調(diào)控胃運(yùn)動、胃酸分泌以及胃排空。已有研究報(bào)道，NAc可以參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)對能量平衡和胃腸功能的調(diào)控[13]。確切地說，在腦-胃腸軸之間復(fù)雜的相互作用中，NAc可參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)對胃腸道內(nèi)傳入和傳出信息的整合，并通過對各種神經(jīng)肽的調(diào)節(jié)進(jìn)而參與調(diào)控胃腸功能。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠NAc內(nèi)存在GD反應(yīng)性神經(jīng)元，這些神經(jīng)元同時(shí)也對GLP-1敏感，GLP-1使NAc內(nèi)部分GD-E神經(jīng)元和GD-I神經(jīng)元的放電頻率增加。

GABA是腦內(nèi)重要的抑制性遞質(zhì)，在NAc中具有其特殊的促攝食作用[13]。據(jù)先前的研究結(jié)果，GABA神經(jīng)元可參與胃腸功能的調(diào)節(jié)[14]。在大鼠NAc中微量注射GABA可促進(jìn)大鼠胃運(yùn)動，且GLP-1R拮抗劑Ex9可部分減弱該促進(jìn)作用。因此，外源性GABA在NAc中可能具有一定的興奮性促胃運(yùn)動作用，且主要通過GABA-AR信號通路來調(diào)節(jié)該過程，并且GLP-1R信號通路也可能參與這一調(diào)控過程。通過熒光免疫組織化學(xué)染色觀察到GABA-AR和GLP-1R免疫反應(yīng)神經(jīng)元在大鼠NAc中的共表達(dá)，這與先前研究結(jié)果一致[15]，表明NAc是GABA和GLP-1共同的作用位點(diǎn)之一。

GLP-1及其受體信號通路在維持能量平衡中起著重要的生理作用[16]。目前研究發(fā)現(xiàn)，腦室內(nèi)注射GLP-1受體拮抗劑可增加攝食量[17]。若通過RNA干擾誘導(dǎo)NTS中GLP-1的前體胰高血糖素mRNA下調(diào)，則會引起暴飲暴食和體重增加的現(xiàn)象[18]。此外，已有研究發(fā)現(xiàn)，NAc內(nèi)GLP-1受體的激活可增加谷氨酸能AMPA/kainate信號，從而抑制攝食行為[19]。本研究中大鼠NAc內(nèi)注射GABA可增強(qiáng)胃運(yùn)動和胃酸分泌，而GLP-1受體拮抗劑可部分拮抗該效應(yīng)，據(jù)此推測外源性GABA對胃運(yùn)動和胃酸分泌起作用的潛在機(jī)制可能涉及GLP-1受體信號通路。

綜上所述，NAc中GABA通過調(diào)控GD神經(jīng)元的放電活動參與胃傳入信號的調(diào)控；還可增加胃動力和胃酸分泌，此為影響胃部傳出信號的結(jié)果；且中樞GLP-1R信號也參與該調(diào)節(jié)過程；此外，經(jīng)熒光免疫組織化學(xué)染色證實(shí)，NAc內(nèi)GABA-A受體和GLP-1受體共染?？傊?，GLP-1受體信號通路參與調(diào)節(jié)NAc內(nèi)GABA-A受體信號通路對胃腸道傳入及傳出信息的處理及調(diào)控。