王書惠, 尹秀艷, 劉海英, 張亞男
(牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院,黑龍江 牡丹江 157011)
宮頸癌(cervical cancer)是女性常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率僅次于乳腺癌,為全球女性因癌致死的第2位病因,嚴(yán)重威脅女性健康[1]。中國每年新發(fā)病例達(dá)13.15萬,宮頸癌死亡人數(shù)每年約5.3萬,約占全部女性惡性腫瘤死亡人數(shù)的18.4%[2]。近些年宮頸癌的發(fā)病率呈不斷上升的趨勢,并且逐漸年輕化。近年來,中醫(yī)中藥治療在腫瘤治療中的作用越來越受到重視。紫草素(shikonin)為紫草干燥根的主要成分,具有抗菌、抗病毒、抗炎、促進(jìn)傷口愈合和抗腫瘤等多種生物活性[3],尤其是其抗腫瘤作用,如乳腺癌、白血病、結(jié)腸癌、肝癌和人絨毛膜癌等,已被大量研究所證實(shí)[4-8]。也有研究證實(shí),紫草素可抑制人宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖和遷移侵襲,并誘導(dǎo)其凋亡[9-10]。但是有關(guān)紫草素對HeLa 細(xì)胞自噬(auto-phagy)的影響尚不清楚。因此,本研究觀察了紫草素對HeLa 細(xì)胞凋亡和自噬的影響,以及凋亡和自噬的相互作用,并初步探討PI3K/Akt/mTOR信號通路在其中的可能作用,為其在臨床上治療宮頸癌奠定實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。
1.1細(xì)胞株 人宮頸癌HeLa 細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所,接種在含10% 胎牛血清、青霉素鏈霉素混合液的RPMI-1640 培養(yǎng)液中,置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔2~3 d傳代1 次,取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
1.2藥物與主要試劑 紫草素(純度>99%)購自Axygen;二甲基亞砜(DMSO)、自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)和凋亡抑制劑Z-DEVD-FMK均購自Sigma;CCK-8試劑盒和Annexin V-PI 雙染凋亡檢測試劑盒均購自同仁化學(xué)研究所;微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3)、cleaved caspase-3磷酸化PI3K(p-PI3K)、磷酸化Akt(p-Akt)和磷酸化mTOR(p-mTOR)I 抗購自ATCC;相應(yīng)Ⅱ 抗購自Santa Cruz。
1.3主要儀器 CO2培養(yǎng)箱(HERAcell 240i,Thermofisher Scientific);酶標(biāo)儀(RT-6100, Rayto);低溫高速離心機(jī)(GS-15R,BECKMAN);熒光顯微鏡(BX43,Olympus);電泳儀(PowerPac HV,BIO-RAD);蛋白成像系統(tǒng)(ChemiDoc XRS,BIO-RAD)。
1.4紫草素配制 紫草素溶解于DMSO(濃度<1%),配制成64 μmol/L溶液,-20℃保存,臨用時(shí),以RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋到所需濃度。
2.1CCK-8法檢測HeLa 細(xì)胞細(xì)胞活力 HeLa 細(xì)胞以1.5×104/well接種于96孔板,每孔100 μL,置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁后,以加入不同濃度(4、8、16、32和64 μmol/L)紫草素的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組,以加入等量RPMI-1640培養(yǎng)液的細(xì)胞作為對照組,另外設(shè)置不含細(xì)胞只加入等量RPMI-1640培養(yǎng)液的空白對照組,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48和72 h后。每孔加入用RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋成的含有10% CCK-8 試劑的工作液10 μL,輕輕搖勻,37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育90 min。用酶標(biāo)儀(波長450 nm)檢測每孔吸光度(A)值,計(jì)算細(xì)胞活力及半數(shù)抑制濃度(IC50)。細(xì)胞活力(%)=(A實(shí)驗(yàn)組-A空白對照組)/(A對照組-A空白對照組)×100%。
2.2Annexin V/PI 雙染法檢測HeLa細(xì)胞凋亡 HeLa 細(xì)胞以1.5×104/well接種于6孔板,每孔100 μL,置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁后,以加入不同濃度(8、16和32 μmol/L)紫草素的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組,以加入等量RPMI-1640培養(yǎng)液的細(xì)胞作為對照組,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后。棄去原培養(yǎng)基,0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞,終止消化后,1 000 r/min離心5 min,棄上清,PBS 洗滌2 次。按照試劑盒說明書,以稀釋的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。取100 μL 細(xì)胞懸液于5 mL 流式管中,然后加入Annexin V-FITC 5 μL,混勻,最后加入PI 染色液10 μL,輕輕混勻,用流式細(xì)胞儀檢測HeLa 細(xì)胞凋亡率。
2.3GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染分析觀察HeLa 細(xì)胞自噬小體 HeLa 細(xì)胞培養(yǎng)操作和培養(yǎng)條件同“2.2”培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁后,按照轉(zhuǎn)染試劑說明書,將GFP-LC3質(zhì)粒和Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑分別加入無血清RPMI-1640培養(yǎng)基中,室溫靜置5 min 后混合,再次靜置20 min,將其加入到細(xì)胞中,使之均勻分散。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h 后更換培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48 h。以加入不同濃度(8、16和32 μmol/L)紫草素的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組,以加入等量RPMI-1640培養(yǎng)液的細(xì)胞作為對照組,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后。棄去原培養(yǎng)基,PBS 洗滌3 次,置熒光顯微鏡下觀察GFP-LC3 熒光聚集情況,如發(fā)生自噬則細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)綠色點(diǎn)狀聚集的自噬小體,否則呈現(xiàn)彌漫性綠色熒光。
2.4Western blot 分析檢測自噬和凋亡相關(guān)蛋白及PI3K/Akt/mTOR信號通路蛋白的表達(dá) HeLa 細(xì)胞以1.5×104/well接種于96孔板,每孔100 μL,置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。檢測LC3和cleaved caspase-3蛋白水平:待細(xì)胞貼壁后,實(shí)驗(yàn)分為對照組(加入等量RPMI-1640培養(yǎng)液)、紫草素(shikonin)組(加入32 μmol/L shikonin)、3-MA組(加入5 mmol/L 3-MA)、Z-DEVD-FMK組(加入5 mmol/L Z-DEVD-FMK)、shikonin+3-MA組(加入32 μmol/L shikonin+5 mmol/L 3-MA)和shikonin+Z-DEVD-FMK組(加入32 μmol/L shikonin+5 mmol/L Z-DEVD-FMK)。檢測LC3、p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白水平:待細(xì)胞貼壁后,分組同“2.2”。以上各組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。細(xì)胞經(jīng)RIPA 裂解液冰上裂解30 min。4 ℃、12 000 r/min離心5 min,取上清。BCA 蛋白定量法測定蛋白濃度定量。沸水煮沸5 min,蛋白完全變性后,冷卻。取40 μg蛋白上樣進(jìn)行10% SDS-PAGE,同時(shí)以GAPDH(或β-actin)轉(zhuǎn)印到PVDF 上。用含5% 脫脂奶粉的PBST 封閉1 h,分別加入對應(yīng)I 抗4 ℃孵育過夜,TBST 洗膜后,加入對應(yīng)Ⅱ 抗室溫?fù)u床孵育2 h,TBST 洗膜3 次。滴入ECL 化學(xué)發(fā)光液后放入暗盒中壓片并依次顯影、定影,凝膠成像系統(tǒng)分析蛋白條帶灰度值。結(jié)果以目的蛋白相對表達(dá)量表示。
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,利用GraphPad Prism 5.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,各組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,不同濃度的紫草素作用于HeLa 細(xì)胞24、48和72 h后,與對照組比較,隨著濃度的增加和時(shí)間的延長,細(xì)胞活力顯著降低,呈一定的濃度-時(shí)間依賴關(guān)系(P<0.05或P<0.01),見圖1。作用24、48和72 h,紫草素對HeLa 細(xì)胞的IC50分別為42.8、19.1和14.7 μmol/L。另外,由于4 μmol/L的紫草素作用于HeLa細(xì)胞24 h,細(xì)胞活力與對照組比較差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),因此,本研究采用8、16和32 μmol/L的紫草素作用于HeLa細(xì)胞24 h用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
Figure 1.The effects of shikonin on the viability of HeLa cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group.
圖1 紫草素對HeLa 細(xì)胞細(xì)胞活力的影響
Annexin V-FITC/PI雙染法結(jié)果顯示,與對照組比較,HeLa細(xì)胞經(jīng)8、16和32 μmol/L的紫草素作用后,凋亡率顯著升高(P<0.05或P<0.01),見圖2。
GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染分析結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染GFP-LC3 質(zhì)粒的HeLa細(xì)胞經(jīng)8、16和32 μmol/L的紫草素作用后,細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)綠色點(diǎn)狀聚集的自噬小體,而對照組細(xì)胞中極少觀察到點(diǎn)狀聚集的自噬小體形成,見圖3。
Western blot 分析結(jié)果顯示,HeLa 細(xì)胞凋亡經(jīng)8、16和32 μmol/L的紫草素作用后,LC3-II/LC3-I顯著升高(P<0.05或P<0.01),說明LC3-I向LC3-II轉(zhuǎn)換增多,從而誘導(dǎo)自噬,見圖4。
Western blot 分析結(jié)果顯示,與shikonin組比較,shikonin+3-MA組由于自噬抑制劑的存在,LC3-II/LC3-I顯著降低(P<0.01),說明LC3-I向LC3-II轉(zhuǎn)換降低,自噬被抑制,而同時(shí)cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05),說明凋亡作用顯著增強(qiáng),見圖5A;與shikonin組比較,shikonin+Z-DEVD-FMK組由于凋亡抑制劑的存在,HeLa 細(xì)胞凋亡被顯著抑制,表現(xiàn)為cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)降低(P<0.01),而同時(shí)自噬增強(qiáng),表現(xiàn)為LC3-II/LC3-I顯著升高(P<0.05),見圖5B。
Figure 2.The effects of shikonin on the apoptosis of the HeLa cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.
圖2 紫草素對Hela細(xì)胞凋亡的影響
Figure 3.The effects of shikonin on the autophagy of the HeLa cells (×400).
圖3 紫草素對HeLa 細(xì)胞自噬的影響
Figure 4.The effects of shikonin on the expression of LC3 in the HeLa cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.
圖4 紫草素對HeLa 細(xì)胞LC3蛋白表達(dá)的影響
Western blot 分析結(jié)果顯示,與對照組比較,HeLa細(xì)胞經(jīng)8、16和32 μmol/L的紫草素作用后,p-PI3K、p-Akt和p-mTOR表達(dá)顯著降低(P<0.05或P<0.01),見圖6。
凋亡和自噬是細(xì)胞程序性死亡的2種死亡方式,可共同作用于腫瘤細(xì)胞,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡[11]。自噬又稱為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡,是廣泛存在于真核細(xì)胞中的一種程序性死亡方式,其通過單層或雙層膜包裹自身細(xì)胞質(zhì)蛋白或細(xì)胞器形成自噬小體,再與溶酶體融合形成自噬溶酶體,最終使被包裹的內(nèi)容物降解,以實(shí)現(xiàn)“自身消化”和細(xì)胞器更新的過程[12-13]。本研究結(jié)果顯示,紫草素可使轉(zhuǎn)染GFP-LC3 質(zhì)粒的HeLa 細(xì)胞中出現(xiàn)綠色點(diǎn)狀聚集的自噬小體,提示紫草素可誘導(dǎo)HeLa 細(xì)胞自噬。在自噬過程中,LC3 發(fā)揮了重要作用。LC3 存在LC3-I 和LC3-II 2種形式,其中LC3-I 為非活化形式,自噬開始后,LC3-I 會酶解掉一小段多肽,轉(zhuǎn)變?yōu)長C3-II 并聚集到自噬體膜上[14-15],因此LC3-II 水平在一定程度上反映了自噬的程度,為細(xì)胞內(nèi)自噬水平的特異性蛋白標(biāo)記物[16-17]。本研究結(jié)果顯示,紫草素具有明顯的抑制HeLa 細(xì)胞活力及促進(jìn)LC3 的表型轉(zhuǎn)換的作用,提示紫草素能夠誘導(dǎo)HeLa 細(xì)胞自噬,從而抑制其細(xì)胞活力。
Figure 5.The effecfs of shikonin combined with 3-MA or Z-DEVD-FMK on the apoptosis (A) and autophagy (B) of the HeLa cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsshikonin group.
圖5 紫草素與3-MA或Z-DEVD-FMK共同作用對HeLa 細(xì)胞凋亡和自噬的影響
Figure 6.The effect of shikonin on the protein levels of p-PI3K, p-Akt and p-mTOR in the HeLa cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.
圖6 紫草素對Hela 細(xì)胞p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表達(dá)的影響
本研究用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡,結(jié)果顯示,紫草素可誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡。
凋亡與自噬的關(guān)系相當(dāng)復(fù)雜,而其互補(bǔ)作用最為常見且被廣泛認(rèn)同[18]。本研究結(jié)果顯示,紫草素與3-MA共同作用于HeLa 細(xì)胞后,cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)升高,凋亡作用增強(qiáng)。同時(shí)紫草素與Z-DEVD-FMK共同作用于HeLa 細(xì)胞后,LC3-II/LC3-I顯著升高,自噬作用也增強(qiáng)。以上結(jié)果提示,紫草素能夠誘導(dǎo)HeLa 細(xì)胞凋亡和自噬,并且其凋亡和自噬作用具有協(xié)同作用,從而抑制其細(xì)胞活力。
PI3K/Akt/mTOR 信號通路由PI3K、Akt和mTOR 三種蛋白酶構(gòu)成,激活PI3K/Akt /mTOR 信號通路可抑制多種刺激誘發(fā)的細(xì)胞凋亡和(或)自噬,促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程,從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生存和增殖[19-20]。本研究結(jié)果顯示,紫草素顯著降低HeLa 細(xì)胞p-PI3K、p-Akt和p-mTOR的表達(dá),以上結(jié)果提示,紫草素可能通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路,從而誘導(dǎo)HeLa 細(xì)胞發(fā)生凋亡和自噬,并進(jìn)一步抑制其細(xì)胞活力。
綜上所述,紫草素可通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路誘導(dǎo)HeLa 細(xì)胞發(fā)生凋亡和自噬,并進(jìn)一步抑制其細(xì)胞活力。并且紫草素誘導(dǎo)HeLa 細(xì)胞凋亡和自噬具有協(xié)同作用,即紫草素與自噬抑制劑共同作用能夠更好地誘導(dǎo)HeLa 細(xì)胞凋亡,紫草素與凋亡抑制劑共同作用能夠更好地誘導(dǎo)HeLa 細(xì)胞自噬。