張鐵山, 尚曙玉, 王聰穎
(黃河科技學(xué)院 1生理藥理教研室, 2化學(xué)教研室, 河南 鄭州 450063)
膠質(zhì)瘤是常見(jiàn)的顱內(nèi)惡性腫瘤,占到顱內(nèi)惡性腫瘤的70%以上[1]。目前膠質(zhì)瘤的標(biāo)準(zhǔn)治療一般包括最大安全手術(shù)切除、放療和化療。盡管合理的治療方案可在一定程度上改善患者預(yù)后,但因復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率較高,患者的平均生存期只有15~18個(gè)月,5年生存率僅為5%[2-4]。因此,尋找新的治療靶點(diǎn)成為目前膠質(zhì)瘤研究的熱點(diǎn)之一。研究表明,過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ)在結(jié)直腸癌、乳腺癌、肺癌、胃癌和膠質(zhì)瘤等多種腫瘤組織中呈高表達(dá)[5-8],但在人腦組織中卻呈低表達(dá)[9],而上調(diào)PPARγ蛋白表達(dá)可誘導(dǎo)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期阻滯和凋亡[10]。這表明PPARγ在膠質(zhì)瘤中發(fā)揮著抑癌作用。研究證實(shí),薯蕷皂苷元(diosgenin, Dio)可上調(diào)脂肪細(xì)胞中PPARγ蛋白表達(dá)水平[11],這提示Dio可能作為PPARγ激活劑發(fā)揮抗膠質(zhì)瘤作用,但目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)Dio對(duì)人膠質(zhì)瘤作用的報(bào)道。因此,本研究擬通過(guò)分子生物學(xué)方法探究Dio對(duì)人膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其分子機(jī)制。
正常人星形膠質(zhì)細(xì)胞(human astrocytes, HA)購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心;人膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。星形膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液(astrocyte growth medium, AGM)套裝購(gòu)自Lonza;RPMI-1640培養(yǎng)液和胎牛血清購(gòu)自HyClone;CCK-8試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物公司;薯蕷皂苷元(純度≥98%)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;PPARγ抑制劑GW9662購(gòu)自Sigma;Giemsa染色液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;Annexin V-FITC/碘化丙啶雙染凋亡檢測(cè)試劑盒和細(xì)胞周期試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;RT-PCR試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司;ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒和RIPA裂解液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司;兔抗人PPARγ、Bcl-2、Bax、細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)、cyclin E1和β-actin抗體及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購(gòu)自Abcam。
2.1細(xì)胞培養(yǎng) HA細(xì)胞用含3%胎牛血清、1%左旋谷氨酰胺、0.25%胰島素、0.1%抗壞血酸、0.1%慶大霉素和0.1%血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的AGM培養(yǎng)液,U87MG細(xì)胞用含10%胎牛血清、1.0×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液,在37 ℃、5% CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng);當(dāng)細(xì)胞覆蓋率達(dá)到80%時(shí),用0.25%的胰蛋白酶消化,按1∶3的比例傳代。
2.2藥物配制 將Dio和GW9662分別溶于DMSO制成50 mmol/L儲(chǔ)備液,分裝后于-20 ℃儲(chǔ)存。使用時(shí)用細(xì)胞培養(yǎng)液將儲(chǔ)備液稀釋至所需濃度,其中DMSO終濃度為0.1%,對(duì)照組使用含有0.1% DMSO的細(xì)胞培養(yǎng)液。
2.3CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HA細(xì)胞和U87MG細(xì)胞,以每孔5 000個(gè)接種于96孔板,常規(guī)培養(yǎng)24 h后去上清,實(shí)驗(yàn)孔分別加入100 μL含有不同劑量(10、 20、 30、 40和50 μmol/L)Dio的細(xì)胞培養(yǎng)液,同時(shí)設(shè)調(diào)零孔和對(duì)照孔,每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔;處理48 h后,每孔加入10 μL CCK-8溶液,37 ℃孵育1 h,用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔450 nm波長(zhǎng)吸光度(A)值,計(jì)算細(xì)胞活力。細(xì)胞活力(%)=(加藥組A值-調(diào)零組A值)/(對(duì)照組A值-調(diào)零組A值)×100%。采用SPSS 16.0軟件Probit回歸模型計(jì)算Dio對(duì)U87MG細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration, IC50)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
2.4RT-PCR檢測(cè)PPARγ的mRNA水平 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U87MG細(xì)胞以每孔5×105個(gè)接種于6孔板,常規(guī)培養(yǎng)24 h后去上清,分別加入不同劑量(0, 20和40 μmol/L)Dio或Dio(40 μmol/L)+GW9662(5 μmol/L);處理48 h后,用TRIzol試劑提取總RNA,取2 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),反轉(zhuǎn)錄條件:42 ℃ 60 min,70 ℃ 15 min。取2 μL上述反應(yīng)液進(jìn)行PCR,反應(yīng)條件:94 ℃ 1 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,32個(gè)循環(huán)。PPARγ(208 bp)上游引物序列為5’-TTGCAGTGGGGATGTCTCAT-3’,下游引物序列為5’-TTTCCTGTCAAGATCGCCCT-3’;GAPDH(217 bp)上游引物序列為5’-AAGGGTCATCATCTCTGCCC-3’,下游引物序列為5’-ATCCACAGTCTTCTGGGTGG-3’。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,紫外燈下拍照,用ImageJ 1.45s軟件進(jìn)行灰度分析,以目的產(chǎn)物與內(nèi)參照GAPDH的灰度值比值表示目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
2.5平板集落形成實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U87MG細(xì)胞,以每孔200個(gè)細(xì)胞接種于6孔板,細(xì)胞分組同2.4;處理48 h后,去上清,加入常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng);10 d后待細(xì)胞長(zhǎng)成集落,棄上清,PBS洗滌1次,甲醇固定10 min,PBS洗滌1次,Giemsa染色30 min,PBS洗滌2次;在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的集落數(shù),計(jì)算集落形成率。集落形成率(%)=集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。
2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 細(xì)胞處理同2.4;收集各組細(xì)胞,每組取104個(gè)細(xì)胞,PBS洗滌2次,加入1 mL 70%冰乙醇于4 ℃固定24 h;PBS洗滌2次,加入碘化丙啶染色液,4 ℃避光染色30 min;使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞處理組同2.4;收集各組細(xì)胞,每組取104個(gè)細(xì)胞,PBS洗滌2次,重懸細(xì)胞于400 μL Annexin V-FITC結(jié)合液中;加入5 μL Annexin V-FITC,4 ℃避光孵育15 min;加入10 μL碘化丙啶染色液,4 ℃避光孵育15 min;使用流式細(xì)胞儀分析檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
2.8Western blot檢測(cè)蛋白水平 細(xì)胞處理同2.4;用RIPA裂解各組細(xì)胞提取總蛋白,用紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度;取25 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE并轉(zhuǎn)移至PVDF膜,用5%脫脂奶粉封閉1 h,加入Ⅰ抗(PPARγ、Bcl-2、Bax、cyclin D1、cyclin E1和β-actin抗體均以1∶1 000稀釋),4 ℃孵育過(guò)夜,TBST洗膜3次,加入Ⅱ抗(1∶2 000稀釋)室溫下孵育1 h,TBST洗膜3次,加入ECL進(jìn)行發(fā)光反應(yīng),暗室X膠片顯影,拍照,使用ImageJ 1.45s軟件進(jìn)行灰度分析。以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參照β-actin灰度值的灰度比值作為目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
采用SPSS 16.0分析數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),并用Bonferroni法進(jìn)行組間兩兩比較。以P<0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,不同劑量Dio組U87MG細(xì)胞活力均顯著下降(P<0.05),且隨著Dio劑量的增加,細(xì)胞活力有逐漸下降的趨勢(shì);Dio作用U87MG細(xì)胞48 h的IC50為24.31 μmol/L。但不同劑量Dio組HA的活力與對(duì)照組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)圖1。
RT-PCR結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,20和40 μmol/L Dio組PPARγ的mRNA表達(dá)水平顯著升高(P< 0.05),且隨著Dio濃度的增加而升高;與40 μmol/L Dio組比較,Dio(40 μmol/L)+GW9662(5 μmol/L)組PPARγ的mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),見(jiàn)圖2。
Figure 1.Effect of Dio on the viability of HA and U87MG cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L Dio group;#P<0.05vs10 μmol/L Dio group;△P<0.05vs20 μmol/L Dio group;▲P<0.05vs30 μmol/L Dio group.
圖1 Dio對(duì)HA和U87MG細(xì)胞活力的影響
Figure 2.Effect of Dio on mRNA level of PPARγ in U87MG cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vs20 μmol/L Dio group;△P<0.05vs40 μmol/L Dio group.
圖2 Dio對(duì)PPARγ mRNA表達(dá)水平的影響
平板集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,20和40 μmol/L Dio組細(xì)胞集落形成率顯著降低(P<0.05),且隨著Dio濃度的增加而降低;與40 μmol/L Dio組比較,Dio(40 μmol/L)+GW9662(5 μmol/L)組細(xì)胞集落形成率顯著升高(P<0.05),見(jiàn)圖3。
Figure 3.Effect of Dio on colony formation of U87MG cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vs20 μmol/L Dio group;△P<0.05vs40 μmol/L Dio group.
圖3 Dio對(duì)U87MG細(xì)胞集落形成的影響
流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,20和40 μmol/L Dio組G0/G1期細(xì)胞比例逐漸升高(P<0.05),S期細(xì)胞比例則逐漸降低(P<0.05);與40 μmol/L Dio組比較,Dio(40 μmol/L)+GW9662(5 μmol/L)組G0/G1期細(xì)胞比例顯著降低(P<0.05),S期細(xì)胞比例則顯著回升(P<0.05),見(jiàn)圖4。
Figure 4.Effect of Dio on cell cycle of U87MG cells. Mean±SD,n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vs20 μmol/L Dio group;△P<0.05vs40 μmol/L Dio group.
圖4 Dio對(duì)U87MG細(xì)胞周期的影響
流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,20和40 μmol/L Dio組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05),且隨著Dio濃度的增加而上升;與40 μmol/L Dio組比較,Dio(40 μmol/L)+GW9662(5 μmol/L)組細(xì)胞凋亡率顯著下降(P<0.05),見(jiàn)圖5。
Western blot結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,20和40 μmol/L Dio組Bcl-2、cyclin D1和cyclin E1蛋白表達(dá)水平逐漸降低(P<0.05),PPARγ和Bax蛋白表達(dá)水平則逐漸升高(P<0.05);與40 μmol/L Dio組比較,Dio(40 μmol/L)+GW9662(5 μmol/L)組Bcl-2、cyclin D1和cyclin E1蛋白表達(dá)水平顯著回升(P<0.05),PPARγ和Bax蛋白表達(dá)水平則顯著降低(P<0.05),見(jiàn)圖6。
Dio是從薯蕷科植物的根莖中提取出來(lái)的一種甾體化合物,具有降血脂、抗血小板聚集和抗炎等藥理作用[12-14]。近年來(lái),Dio的抗腫瘤活性備受關(guān)注。多項(xiàng)研究證實(shí),Dio可通過(guò)抑制腫瘤血管生成,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,抑制腫瘤細(xì)胞增殖、阻礙腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲等發(fā)揮抗腫瘤活性[15-19]。本研究表明,Dio可劑量依賴性地抑制人腦膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞活力,但對(duì)人正常星形膠質(zhì)細(xì)胞活力無(wú)顯著影響,提示Dio具有良好的抗膠質(zhì)瘤作用。
Figure 5.Effect of Dio on apoptosis of U87MG cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vs20 μmol/L Dio group;△P<0.05vs40 μmol/L Dio group.
圖5 Dio對(duì)U87MG細(xì)胞凋亡的影響
Figure 6.Effect of Dio on expression levels of related proteins. Mean ±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vs20 μmol/L Dio group;△P<0.05vs40 μmol/L Dio group.
圖6 Dio對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響
PPARγ是一種由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子,屬于II型核受體超家族成員,在腫瘤的發(fā)生、生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移以及腫瘤血管生成等方面發(fā)揮重要作用,是腫瘤防治的一個(gè)新靶標(biāo)[20]。研究表明,上調(diào)PPARγ蛋白表達(dá)可抑制人肝癌細(xì)胞遷移和侵襲,并誘導(dǎo)其凋亡[21], PPARγ 可通過(guò)下調(diào)cyclin D1、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4(cyclin-dependent kinase 4, CDK4)、CDK6和Bcl-2蛋白表達(dá)以及上調(diào)Bax蛋白表達(dá)而抑制人膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡[10]。本研究顯示,Dio可劑量依賴性地上調(diào)U87MG細(xì)胞中PPARγ的mRNA和蛋白表達(dá)水平,抑制細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)G0/G1期阻滯和凋亡,但該作用可被PPARγ抑制劑GW9662阻斷,這表明PPARγ在膠質(zhì)瘤中充當(dāng)著抑癌基因的作用,并介導(dǎo)了Dio對(duì)U87MG細(xì)胞的抑制作用。
Cyclin是細(xì)胞周期調(diào)控的關(guān)鍵因子。Cyclin D1和cyclin E1均為細(xì)胞周期G1期的關(guān)鍵蛋白,調(diào)控細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)換[22]。Srinivasan等[23]研究顯示,Dio可下調(diào)cyclin D1、CDK4和CDK6蛋白表達(dá)使乳腺癌細(xì)胞阻滯于G0/G1期。Cyclin D1和cyclin E1表達(dá)下降會(huì)導(dǎo)致U87MG細(xì)胞細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯[24-25]。本研究顯示,Dio可劑量依賴地下調(diào)cyclin D1和cyclin E1蛋白表達(dá)水平,且該作用可被GW9662抑制,這表明Dio可通過(guò)PPARγ抑制cyclin D1和cyclin E1蛋白表達(dá),阻滯U87MG細(xì)胞于G0/G1期。
Bcl-2家族蛋白在調(diào)控細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用,其中抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax是該家族的重要成員[24-25]。Bcl-2蛋白表達(dá)水平下降和Bax蛋白表達(dá)水平升高會(huì)促進(jìn)U87MG細(xì)胞凋亡[26]。Das等[27]研究證實(shí),Dio可通過(guò)上調(diào)Bax蛋白水平和下調(diào)Bcl-2蛋白水平促進(jìn)人皮膚鱗癌A431細(xì)胞凋亡。本研究顯示,Dio可劑量依賴性地下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)水平和上調(diào)Bax表達(dá)蛋白水平,該作用也同樣可被GW9662抑制,這表明Dio可引起B(yǎng)cl-2蛋白和Bax蛋白表達(dá)失衡,導(dǎo)致U87MG細(xì)胞凋亡,而PPARγ介導(dǎo)了該效應(yīng)。
由于體外實(shí)驗(yàn)的局限性,本研究尚存在一定的不足之處。但已有研究證實(shí),Dio在動(dòng)物體內(nèi)仍具有顯著的抗腫瘤作用。Das等[27]通過(guò)皮內(nèi)注射小鼠惡性肉瘤S-180細(xì)胞建立小鼠移植瘤模型,經(jīng)尾靜脈給予Dio(20 mg·kg-1·d-1),第18天結(jié)果顯示腫瘤移植瘤的生長(zhǎng)受到顯著抑制。Dong等[28]向C57BL/6雌鼠皮下注射小鼠黑色素瘤B16F10細(xì)胞建立小鼠移植瘤模型,每天以20 mg/kg Dio灌胃,2周后結(jié)果顯示,移植瘤的生長(zhǎng)也受到顯著抑制,移植瘤組織中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著升高。
綜上所述,Dio可在體外抑制U87MG細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡,這可能與Dio上調(diào)PPARγ表達(dá),繼而抑制cyclin D1、cyclin E1和Bcl-2蛋白表達(dá)以及上調(diào)Bax蛋白水平有關(guān)。本研究為Dio用于治療膠質(zhì)瘤提供了參考資料。