宋紅衛(wèi)，張惠喜，朱 山，高英莉，郭靈玲，張季東，蘇紅梅

（1.菏澤市食品藥品檢驗檢測研究院，山東菏澤274000；2.菏澤信息工程學校，山東菏澤274000；3.五宴尊酒業(yè)股份有限公司，山東菏澤274000)

免疫力是指機體抵抗外來侵襲，維護體內環(huán)境穩(wěn)定性的能力?，F(xiàn)代醫(yī)學發(fā)現(xiàn)免疫是一個與衰老有密切關系的因素，機體免疫功能在30歲左右就開始減退，這種變化是悄然、緩慢、持續(xù)進行的，生活節(jié)奏加快與競爭壓力增大加劇了這個變化趨勢。隨著國家經(jīng)濟水平的快速發(fā)展和人民生活水平的日益提高，越來越多的人開始認同預防保健。在我國飲酒是部分消費群體的一種嗜好，有著千年的文化傳承,養(yǎng)生保健酒更是深受廣大群眾的喜愛和認同，但是民間很多采用白酒浸泡中草藥后飲用，缺乏相應的安全性評價，效果也不明確。因此，本課題組通過查閱大量資料，采用保健食品原料人參、紅棗、枸杞子、桑葚，充分考慮配伍合理性、用量安全性、口感舒適性，以總皂苷為標志性功效成分，開發(fā)一款具有調節(jié)機體免疫力的保健酒。

1 材料和方法

1.1 材料、試劑及儀器

實驗動物：SPF級昆明小鼠，雄性，體重18～22 g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司。

藥材與試劑：人參、大棗、枸杞和桑葚原料，人參皂苷標準品Re，純度≥97.4%，Amberlite-XAD-2大孔樹脂、中性氧化鋁；甲醇為色譜純；高氯酸、乙醇、冰乙酸為分析純；香草醛溶液，稱取5 g香草醛于100 mL容量瓶中，加冰乙酸溶解定容至刻度。綿羊紅細胞(SRBC)、補體（豚鼠血清）、SA緩沖液、都氏試劑、印度墨汁。

儀器設備：UV-2700紫外可見分光光度計，日本島津公司；XS-105電子天平，瑞士梅特勒公司；DZKW-S-4恒溫水浴鍋，上?？坪銓崢I(yè)發(fā)展有限公司；游標卡尺(精密度0.02 mm)，微量注射器（50 μL），秒表，手術器械。

1.2 試驗方法

1.2.1 功效成分總皂苷溶出量工藝研究

按配方稱取人參、枸杞子、桑葚、紅棗共100 g，人參切片，紅棗破碎，白酒浸泡提取，以乙醇濃度、提取溫度、提取時間和提取次數(shù)為主要因素進行考察，每個因素選擇3個水平。采用L9(34)正交設計表安排實驗，以總皂苷溶出量為指標優(yōu)化工藝。結果見表1。

表1 總皂苷浸提正交設計因素水平表

1.2.2 總皂苷含量的測定

標準曲線的制備，精密稱取人參皂苷Re標準品10 mg，用甲醇定容至10 mL，吸取對照品溶液0.03 mL、0.06 mL、0.09 mL、0.12 mL、0.15 mL、0.18 mL分別加入試管中，60℃水浴揮發(fā)至干，再加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL，搖勻，置于60℃恒溫水浴中加熱15 min后，冰浴冷卻2 min。加冰醋酸5 mL，搖勻，以相應試劑作為空白對照，分光光度計560 nm進行檢測。以吸光度為縱坐標，人參皂苷Re濃度為橫坐標繪制標準曲線，得到的回歸方程為Y=3.0229X-0.0062，R2=0.9992。

1.3 調節(jié)機體免疫力研究

1.3.1 劑量選擇與樣品給予方式

實驗前，用旋轉蒸發(fā)儀濃縮樣品，用50%vol酒基和純化水配制各劑量組所需濃度，并使各組樣品乙醇含量為15%。100只小鼠隨機分為2個實驗組，每組50只，分為高劑量組、中劑量組、低劑量組、溶媒酒基組、空白對照組。低、中、高劑量組分別以 8.33 mL/kg·bw、16.67 mL/kg·bw、50.00 mL/kg·bw灌胃給樣，1次/d，灌胃劑量20 mL/kg·bw、溶媒酒基組和空白組分別給予等體積的酒基和純化水，連續(xù)30 d。一組用于遲發(fā)型變態(tài)反應（DTH）實驗、血清溶血素的測定；二組用于碳廓清實驗、免疫器官指數(shù)的測定。

1.3.2 小鼠免疫器官指數(shù)的測定及小鼠碳廓清實驗

將印度墨汁原液用生理鹽水稀釋4倍，各組小鼠尾靜脈注射10 mL/kg·bw，注射墨汁后2 min、10 min，分別從內眥靜脈叢取血20 μL，立即加入到2 mL 0.1%Na2CO3溶液中。以0.1%Na2CO3溶液作溶劑對照，600 nm波長處測定各試驗組光密度值（OD）。采血結束，稱重后頸椎脫臼處死小鼠，取出胸腺、肝臟和脾臟，去掉筋膜，用濾紙吸干臟器表面血污，分別稱重，計算吞噬指數(shù)a，同時計算胸腺/體重比值與脾臟/體重比值。

1.3.3 小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應（DTH）實驗

小鼠腹腔注射0.2 mL 2%（v/v）綿羊紅細胞（SRBC），致敏后4 d，測量左后足跖厚度，然后在測量部位皮下注射20%（v/v）SRBC，每只小鼠注射20 μL，注射后于24 h測量左后足跖部厚度，同一部位測量3次，取平均值。以攻擊前后足跖厚度的差值表示DTH的程度。

表2 總皂苷含量結果分析

表3 總皂苷提取量方差分析表

1.3.4 小鼠血清溶血素值測定

小鼠腹腔注射0.2 mL 2%（v/v）SRBC，致敏后5 d，摘除眼球取血，2000 r/min離心10 min，收集血清。將血清用SA緩沖液稀釋200倍，測定半數(shù)溶血值（HC50）。

2 結果和分析

2.1 總皂苷溶出量的結果分析（表2、表3）

由表2樣品皂苷含量與表3方差分析可知，乙醇濃度、提取溫度、提取時間對總皂苷提取效果影響非常顯著（P＜0.01），提取次數(shù)對總皂苷提取效果影響不顯著（P＞0.05）。確定最佳提取工藝條件為3倍量的50%vol乙醇濃度的白酒，提取溫度25℃±2℃、提取時間10 d，過濾后濾渣再重復1次。

2.2 樣品對小鼠免疫器官指數(shù)的影響（表4）

表4 樣品對免疫器官指數(shù)的影響 (±s)

表4 樣品對免疫器官指數(shù)的影響 (±s)

注：與空白對照組比較。

分組空白對照組酒基對照組低劑量組中劑量組高劑量組脾臟/體重比(mg/g)3.92±0.69 3.99±0.62 4.18±0.68 4.21±0.55 4.11±0.71動物數(shù)(只)10 10 10 10 10胸腺/體重比(mg/g)2.71±0.54 2.81±0.42 2.70±0.44 2.72±0.48 2.89±0.50

由表4可見，給予小鼠不同劑量的樣品30 d后，酒基對照組，低、中、高各劑量組與空白對照組脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)比均無顯著性差異（P＞0.05）。

2.3 樣品對小鼠碳廓清能力的影響（表5）

表5 樣品對小鼠碳廓清吞噬指數(shù)的影響 (±s)

表5 樣品對小鼠碳廓清吞噬指數(shù)的影響 (±s)

注：與空白對照組比較。

吞噬指數(shù)(a)分組動物數(shù)(只)

由表5可見，給予小鼠不同劑量的樣品30 d后，與空白對照組比較，酒基對照組與低、中、高各劑量小鼠碳廓清吞噬指數(shù)無顯著性差異（P＞0.05）。

2.4 樣品對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應（DTH）結果的影響（表6）

表6 樣品對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(DTH)結果的影響 (±s)

表6 樣品對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(DTH)結果的影響 (±s)

注：*P＜0.05；**P＜0.01，與空白對照組比較。

分組 動物數(shù) 足趾腫脹度(mm)0.32±0.14 0.34±0.20 0.36±0.12 0.42±0.18*0.54±0.12**空白對照組酒基對照組低劑量組中劑量組高劑量組10 10 10 10 10

由表6可見，給予小鼠不同劑量的樣品30 d后，與空白對照組比較，酒基對照組和低劑量組無顯著性差異（P＞0.05），中、高劑量差異顯著（P＜0.05、P＜0.01）。

2.5 樣品對小鼠血清溶血素值的影響（表7）

表7 樣品對小鼠血清溶血素值的影響 (±s)

表7 樣品對小鼠血清溶血素值的影響 (±s)

注：*P＜0.05，與空白對照組比較。

半數(shù)溶血值(HC50)186.79±5.31 190.86±3.48 193.84±4.96 201.40±4.56 212.79±4.31*分組空白對照組酒基對照組低劑量組中劑量組高劑量組動物數(shù)10 10 10 10 10

由表7可見，給予小鼠不同劑量的樣品30 d后，與空白對照組比較，酒基對照組和低、中劑量組血清溶血素值無顯著性差異（P＞0.05），高劑量組有顯著性差異（P＜0.05）。

3 結論

人參為五加科植物人參干燥的根及根莖，被人們稱為“百草之王”，藥理研究表明，其含有的人參皂苷具有免疫調節(jié)作用，能夠改善試驗動物的非特異性免疫和特異性免疫功能[1]。張才軍等[2]研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rh1對免疫功能低下的小鼠模型巨噬細胞的吞噬功能有增強作用。枸杞子作為一種食藥兩用藥材在我國具有悠久的應用歷史，其有效成分枸杞多糖是一種良好的免疫調節(jié)劑。研究表明，0.5%枸杞多糖混懸液以120 mg/kg·bw連續(xù)灌胃5 d，小鼠的巨噬細胞吞噬指數(shù)顯著提高,且其血清溶酶菌活力顯著增強［3]。紅棗為鼠李科植物棗的成熟果實，具有補虛益氣、養(yǎng)血安神、健脾和胃等作用，其含有的三萜類化合物及環(huán)磷酸腺苷，有較強的抗癌、抗過敏作用[4]。研究表明，紅棗多糖能促進正常及免疫抑制小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能、促進溶血素和溶血空斑形成，促進淋巴細胞轉化[5]。桑葚是?？贫嗄晟颈局参锷涞墓麑崳哂辛己玫姆腊?、抗衰老、抗?jié)?、抗病毒等作用。本研究?種原料組方，利用白酒浸泡工藝，以總皂苷溶出量為指標，優(yōu)化制備工藝。

巨噬細胞的吞噬能力是衡量機體非特異性免疫功能的標志之一[6]。碳廓清試驗中所得的吞噬指數(shù)可反映單核-巨噬細胞的吞噬能力[7]。實驗結果表明，各劑量小鼠碳廓清吞噬指數(shù)無顯著性差異（P＞0.05）。胸腺和脾臟是哺乳動物機體重要的免疫器官，其臟器系數(shù)在一定程度上可以反映機體的免疫功能[8]。實驗結果表明，各劑量小鼠免疫器官指數(shù)無顯著性差異（P＞0.05）。遲發(fā)型變態(tài)反應是抗原刺激機體使T淋巴細胞致敏，然后再次利用抗原刺激后，機體受刺激部位的腫脹程度可反映機體細胞免疫功能的強弱[9]。實驗表明，中、高劑量組能夠顯著提高小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應能力（P＜0.05），表明樣品可以調節(jié)機體細胞免疫功能。血清溶血素試驗利用抗原刺激機體產(chǎn)生抗體，在補體的參與下可發(fā)生溶血反應，通過檢測血紅蛋白評價機體的抗體水平。實驗表明，高劑量組能顯著提高血清溶血素值（P＜0.05）,因此，該樣品能夠調節(jié)機體體液免疫功能。