葉國梅 史亞楠 王蓉蕓 孫秋華 徐小宏*

近年來，胃腸道吻合口瘺越來越受到臨床醫(yī)生的重視，據(jù)報道食管和直腸手術(shù)吻合口瘺發(fā)生率約10%～15%，而其他部位消化道發(fā)生率約5%～10%［1］，特別是胃腸道腫瘤術(shù)后常因吻合口瘺而延遲術(shù)后輔助放化療而增加復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險［2］。傳統(tǒng)經(jīng)胃腸道給藥或靜脈給藥促進(jìn)吻合口愈合有增加胃腸道負(fù)擔(dān)或增加補(bǔ)液量的弊端。課題組前期研究表明，基于中醫(yī)外治理論參黃膏外敷神闕穴可減輕術(shù)后腸道功能障礙（Postoperative ileus，POI）模型大鼠的小腸平滑肌層炎癥反應(yīng)，并促進(jìn)胃腸道傳輸。本文進(jìn)一步探討參黃膏外敷兔神闕穴對胃腸吻合口愈合的影響，為臨床促進(jìn)吻合口愈合提供新的思路和治療方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 （1）實(shí)驗(yàn)動物：24只雄性新西蘭兔，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物中心提供，合格證號：SCXK（蘇）2015-0003，體質(zhì)量為2.5～3.0kg。（2）參黃膏制備：按課題組前期研究的參黃膏制劑配方（人參、丹參、大黃、枳實(shí)、厚樸、丁香、吳茱萸等藥組成）制備工藝與方法，通過單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)，以質(zhì)量標(biāo)志物的轉(zhuǎn)移率與純度為主要指標(biāo)，確定了參黃方提取純化工藝，以外觀性狀、初黏力、持黏力，質(zhì)量標(biāo)志物的釋放度等為指標(biāo)，進(jìn)行質(zhì)量把關(guān)，由本院制劑室制作用于動物實(shí)驗(yàn)［3］。（3）試劑和儀器：羥脯氨酸試劑盒（R&D公司）；Masson三色染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；YAP/TAZ 抗體（Cell signaling公司）；TGF-β1抗體（Santa Cruz公司）；醫(yī)用5-0 VICRYL可吸收線（Ethicon公司）；實(shí)驗(yàn)室連續(xù)傳輸注射泵LSP01-1C（Longer公司）；YB-150A型精密壓力表（溫州正泰儀器儀表有限責(zé)任公司）；Olympus BX53光學(xué)顯微鏡。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 （1）造模與給藥：新西蘭兔適應(yīng)環(huán)境1周，術(shù)前24h禁食，自由飲水，采用隨機(jī)排列表法將24只兔編號隨機(jī)均分為對照組和參黃膏組。兩組均異氟烷吸入麻醉，常規(guī)消毒后取腹部正中切口長約5cm，打開腹腔，距回盲部15cm切除約2cm小腸，5-0 VICRYL可吸收線端端間斷吻合，并關(guān)閉腸系膜，1號絲線逐層關(guān)閉腹腔。參黃膏組術(shù)后取參黃膏貼，滴數(shù)滴透皮劑至藥膏，均勻浸透后帖敷于兔神闕穴；對照組使用等量透皮劑滴入細(xì)沙包外敷。術(shù)后自由進(jìn)食飲水；手術(shù)操作均由同一人完成。各組膏貼或細(xì)沙包每天更換2次。（2）觀察指標(biāo)：術(shù)后3d和7d實(shí)驗(yàn)兔再次吸入麻醉下剖腹探查取樣后處死。如吻合口周圍發(fā)現(xiàn)膿苔及壞死組織或明顯漏口者可診斷為吻合口瘺。分別測定吻合口破裂壓、吻合口羥脯氨酸水平、吻合口YAP、ZAT和TGF-β1蛋白表達(dá)。①吻合口破裂壓力測定：參考文獻(xiàn)［4］，分離腹腔粘連，距離吻合口近、遠(yuǎn)端各3cm分別切斷腸袢并置于PBS液中，近端連接YB-150A型壓力計(jì)，另一端接連續(xù)傳輸注射泵，以6ml/min的速率注入亞甲藍(lán)溶液，至吻合口破裂亞甲藍(lán)溢出為止，壓力計(jì)所顯示最高壓力點(diǎn)為吻合口破裂壓值（單位mmHg）。②吻合口組織羥脯氨酸水平測定：切除約0.5cm寬吻合口組織，4℃PBS洗凈后保存于-80℃冰箱，以高效液相色譜法檢測羥脯氨酸水平［5］。③吻合口組織膠原纖維含量測定：吻合口組織甲醛固定后行Masson染色，用VIDHS圖像分析軟件計(jì)算同一視野下膠原纖維總面積與場面積之比表示膠原纖維的面積密度值。④Westblot法測吻合口YAP、ZAT和TGF-β1蛋白表達(dá)：術(shù)后7d切除吻合口，4℃PBS液清洗后顯微鏡下清理線結(jié)，冰浴上將組織剪碎，RIPA裂解液裂解勻漿并超聲破碎，4℃ 13000r/min離心15min，取上清液，Bradford法定量測蛋白濃度，8%SDS-PAGE凝膠電泳分離目的蛋白，65V×2h轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1h，分別加YAP/TAZ 抗體（1∶1000）和TGF-β1抗體（1∶1000）孵育4℃過夜，含吐溫PBST液洗脫一抗，加AP標(biāo)記的二抗（兔抗羊，1∶1000）孵育1h，洗脫二抗后滴加顯影液顯色，化學(xué)發(fā)光后壓片，以β-actin作為內(nèi)參照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（x±s）表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，方差齊時采用t檢驗(yàn)，方差不齊時采用校正t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組吻合口破裂壓力比較 見表1。

表1 兩組家兔吻合口破裂壓力比較［P/mmHg，（x±s）］

2.2 兩組吻合口羥脯氨酸水平比較 見表2。

表2 兩組家兔吻合口羥脯氨酸水平比較［Mb/（μmol·g），（x±s）］

2.3 兩組吻合口膠原蛋白比較 見表3。

2.4 兩組吻合口YAP、ZAT和TGF-β1蛋白表達(dá)比較 術(shù)后第7天westblot法顯示兩組吻合口組織均有YAP、ZAT和TGF-β1蛋白陽性條帶。與對照組比較，參黃膏組吻合口組織YAP、ZAT和TGF-β1蛋白表達(dá)明顯增加。見圖1。

圖1 兩組術(shù)后7天吻合口YAP、ZAT和TGF-β1蛋白表達(dá)

3 討論

胃腸道術(shù)后并發(fā)吻合口瘺除延長住院時間和增加醫(yī)療費(fèi)用外，常繼發(fā)嚴(yán)重水電解質(zhì)紊亂、營養(yǎng)不良甚至感染性休克和多臟器功能衰竭，臨床處理非常棘手。據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)直腸癌術(shù)后吻合口瘺圍手術(shù)期病死率高達(dá)6%～22%，且與遠(yuǎn)期腫瘤局部復(fù)發(fā)有相關(guān)性［6］。吻合口愈合過程受多種因素影響，如吻合口血供、張力、感染、遠(yuǎn)端梗阻以及伴隨疾病等。吻合口瘺的病因處理是關(guān)鍵，但是促進(jìn)吻合口組織愈合也是預(yù)防吻合口瘺的重要環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)抗炎補(bǔ)液及胃腸減壓等手段預(yù)防吻合口瘺效果并不明顯。

研究顯示［7］，采用人參、大黃等藥制成參黃散貼敷治療POI，臨床療效顯著，可促進(jìn)胃癌術(shù)后POI的早期康復(fù)，可能的作用機(jī)制是降低POI兔小腸平滑肌層ICAM-1、IL-6、iNOSmRNA表達(dá)和促進(jìn)IL-10的mRNA表達(dá)，促進(jìn)Ghrelin分泌和增加小腸平滑肌GHS-R1a表達(dá)，而改善POI兔胃腸道傳輸［8-9］。而神闕穴皮膚解剖上無脂肪組織，角質(zhì)層薄，與腹膜直接相連；臍下腹膜有豐富的靜脈網(wǎng)，藥物在臍滲透后，直接擴(kuò)散至靜脈網(wǎng)而進(jìn)入體循環(huán)。課題組前期研究表明參黃膏經(jīng)神闕穴給藥滲透力強(qiáng)，吸收快，還可避免“首過效應(yīng)”。臨床實(shí)踐表明經(jīng)外敷神闕穴給藥途經(jīng)優(yōu)勢獨(dú)特，可避免靜脈輸注和經(jīng)胃腸道用藥，對于需限制補(bǔ)液量和胃腸道手術(shù)患者尤為有益，而且方法簡便、患者依從性好、易于推廣應(yīng)用。為此，課題組研制成參黃膏劑型，以新西蘭兔為研究對象探索參黃膏外敷神闕穴對胃腸吻合口愈合過程的影響。吻合口破裂壓可準(zhǔn)確地描述吻合的機(jī)械強(qiáng)度，其主要與吻合處膠原沉積量有關(guān)。羥脯氨酸幾乎只存在于膠原蛋白中，可作為評估膠原蛋白代謝的有效指標(biāo)［10］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明參黃膏外敷可提高吻合口破裂壓力，促進(jìn)吻合口膠原沉積和提高羥脯氨酸水平，可顯著促進(jìn)吻合口愈合。

隨后，課題組進(jìn)一步研究參黃膏外敷神闕穴促進(jìn)吻合口愈合可能的機(jī)制。Hippo信號通路參與調(diào)控組織再生、機(jī)械力傳導(dǎo)和干細(xì)胞更新與分化等多個生物學(xué)過程［11］。Yes 相關(guān)蛋白（YAP）和轉(zhuǎn)錄共激活因子PDZ結(jié)合基序（TAZ）為Hippo信號通路的下游級聯(lián)效應(yīng)分子。當(dāng)Hippo信號通路受到抑制時，YAP/TAZ不被磷酸化而進(jìn)入細(xì)胞核，與其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，介導(dǎo)TGF-β1通路中Smad-2、p21和Smad-7蛋白的表達(dá)［12］。如YAP/TAZ被磷酸化而裂解，降低轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β1）表達(dá)，延緩創(chuàng)口愈合。TGF-β1與成肌纖維細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞的分化有關(guān)，介導(dǎo)膠原蛋白的合成和修復(fù)，也與創(chuàng)口收縮有關(guān)。smad-2密切參與傷口愈合過程，在體內(nèi)傷口愈合過程中依賴于TGF-β1信號。膠原蛋白降解一般術(shù)后24h達(dá)到高峰，術(shù)后第7天膠原蛋白合成抑制了膠原蛋白的降解，吻合口愈合反應(yīng)膠原合成與裂解之間平衡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，術(shù)后7dYAP、ZAT和TGF-β1蛋白在兩組吻合口均有表達(dá)，但與對照組比較參黃膏組蛋白表達(dá)均明顯增加。說明Hippo信號通路在參黃膏外敷神闕穴可促進(jìn)胃腸吻合口愈合方面發(fā)揮重要作用。