張薇 譚淵 黃志健 王大明*

神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）是具有自我更新、多潛能的細(xì)胞，能分化成神經(jīng)系統(tǒng)主要細(xì)胞類型，如神經(jīng)元，星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞［1］。研究表明人參皂苷Rb1能促進(jìn)海馬細(xì)胞新生，改善學(xué)習(xí)記憶能力［2］，人參皂苷Rg1能促進(jìn)動物腦內(nèi)蛋白質(zhì)合成，顯著提高大鼠海馬突觸傳遞活動［3］。在大鼠腦梗死后24h內(nèi)給予人參皂苷Rd可促進(jìn)SVZ區(qū)的NSCs增殖［4］。雖人參皂苷Re有抗短波紫外線（UVC）效果，能減少UVC輻射引起的細(xì)胞早期凋亡［5］，但目前關(guān)于Re對NSCs增殖和分化鮮少提及，關(guān)于其他人參皂苷對NSCs增殖比較也尚未提及。另外，雖有文獻(xiàn)指出人參、銀杏葉、丹參能通過介導(dǎo)PI3K/AKT信號通路發(fā)揮調(diào)控作用，但對該通路中上下游靶標(biāo)的具體作用機(jī)制尚無研究［6］。本團(tuán)隊在觀察人參皂苷Rb1、Rg1對NSCs體外促增殖和分化的作用比較后［7］，繼續(xù)行人參皂苷中屬于原人參二醇中另具代表性Rd和原人參三醇中Re對胎鼠皮質(zhì)區(qū)原代NSCs體外促增殖和分化比較，并初步探索人參皂苷Re可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 所有動物實驗均遵循澳門大學(xué)中藥研究國家重點實驗室及澳門大學(xué)中華醫(yī)藥研究院倫理委員會制定的準(zhǔn)則，嚴(yán)格遵守動物實驗倫理原則。本研究實驗所用小鼠為C57BL/6 SPF級，由澳門大學(xué)中華醫(yī)藥研究院動物中心提供。

1.2 試劑、藥物及實驗儀器 （1）試劑和藥品：人參皂苷Rd、Re單體（純度≥98%）（曼思特，成都），DAPI（Santa Cruz，USA），A-M568，Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG（H+L）（Invitrogen，USA），A-M488，Alexa Fluor 488 goat antimouseIgG（H+L）（Invitrogen，USA），Anti-Mouse-GFAP（Sigma，USA），Anti-Mouse-Tuj1（Sigma，USA），Anti-Mouse-Nestin（Millipore，USA），5-BrdU（MCE，USA）Anti- Mouse- Brdu（Millipore，USA），DPBS（Dulbecco'sPhosphate Buffered Saline）（Gibco，USA），Laminin（Sigma，USA），Poly-llysine（PLL）（Sigma，USA），F(xiàn)BS（fetal bovine serum）（Gibco，USA），EGF（Recombinant HuMan EGF）（Peprotech，USA），bFGF（RecombinantHuMan FGF-basic）（Peprotech，USA），B-27 Supplement（50X）（Gibco，USA），N-2Supplement（100X）（Gibco，USA），DMEM/ F- 12（1 ∶ 1）basic（1X）（Gibco，USA）。（2）主要實驗儀器：細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo），生物安全柜（ThermoFisher），離心機(jī)（ZONKIA），解剖顯微鏡（Leica），熒光顯微鏡（ZEISS），細(xì)胞分析儀 2000（GeneralElectric Company）。

1.3 NSCs分離培養(yǎng)和傳代方法 （1）NSCs分離培養(yǎng)：孕鼠（孕12～13d）頸椎脫臼法處死。顯微鏡下分離胎鼠大腦皮質(zhì)，離心管中吹散成單細(xì)胞，細(xì)胞懸浮液接種子T25cm2培養(yǎng)瓶中，搖晃使其分布均勻，置入37℃5%CO2培養(yǎng)箱。2～3d后可見神經(jīng)球形成，每3天半量更換細(xì)胞培養(yǎng)基。（2）NSCs傳代：神經(jīng)球的傳代與純化：離心管裝入含懸浮神經(jīng)球的培養(yǎng)基，室溫靜置2min。棄上清液，加DPBS洗滌，離心。加0.05%胰蛋白酶消化神經(jīng)球，以1ml終止消化培養(yǎng)基（含0.1%FBS）終止胰蛋白酶反應(yīng)。離心，加入NSC培養(yǎng)基，將神經(jīng)球吹散成單細(xì)胞，使分布均勻。貼壁神經(jīng)干細(xì)胞的傳代：提前包被好細(xì)胞培養(yǎng)皿，確認(rèn)NSCs大部分貼壁。用DPBS清洗后加入0.05%胰蛋白酶消化，終止消化，適度吹打，室溫離心2次，加NSCs培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。

1.4 NSCs鑒定 包括NSCs的標(biāo)志—巢蛋白（Nestin）表達(dá)的檢測及其分化能力檢測—TUJ-1/GFAP分別被用作標(biāo)記分化的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞。

1.5 人參皂苷Rd、Re與神經(jīng)干細(xì)胞促增殖 細(xì)胞傳代后NSCs培養(yǎng)基培養(yǎng)≥12h，DMEM/F-12洗去殘留的EGF和bFGF。對照組選用空白組（DMEM/F-12，N-2，B-27），實驗組在對照組基礎(chǔ)上分別加入人參皂苷 Rd、Re的 0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L三 種濃度與NSCs共培養(yǎng)48h，條件37℃、5% CO2培養(yǎng)箱，進(jìn)行免疫熒光化學(xué)染色，分別計算兩種人參皂苷不同濃度組與對照組BrdU/DAPI比值。每次實驗重復(fù)3遍，每種皂苷的每種濃度均設(shè)有三個復(fù)孔。

1.6 人參皂苷Rd、Re與神經(jīng)干細(xì)胞促分化 單純用1%FBS誘導(dǎo)分化NSCs作為對照組，選取10μmol/L濃度人參皂苷Rd、Re分別加入1% FBS誘導(dǎo)分化NSCs5-7d作為實驗組，比較人參皂苷單體Rd、Re對NSCs分化神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的效率。TUJ-1/GFAP分別被用作標(biāo)記分化的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞，計算Tuj1/DAPI、GFAP/DAPI比例。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（x±s）表示，采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCs的培養(yǎng) 將孕鼠（12.5d）處死，取胎鼠大腦，剝除腦膜，獲得胎鼠大腦皮質(zhì)（圖1A），消化成單細(xì)胞，開始以懸浮神經(jīng)球培養(yǎng)的方式進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)與純化（圖1B），然后進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞單層貼壁培養(yǎng)（圖1C）并進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖1 神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)（200í）

2.2 NSCs的鑒定 用DAPI細(xì)胞核染，Nestin是NSCs的陽性標(biāo)記物（圖2A）。當(dāng)NSCs培養(yǎng)基中的EGF、bFGF被1% FBS代替后，NSCs開始分化。5d后，NSCs成功分化為Tuj-1標(biāo)記的神經(jīng)元（圖2B）和GFAP標(biāo)記的星形膠質(zhì)細(xì)胞（圖2C）。

圖2 神經(jīng)干細(xì)胞鑒定（200í）

2.3 不同濃度人參皂苷Rd、Re對NSCs促增殖作用 通過Brdu免疫熒光染色法，對兩種人參皂苷0.1μmol/L、1μmol/L和10μmol/L三個濃度組和空白對照組相比較。在NSCs加人參皂苷培養(yǎng)48h后，先取對照組及各人參皂苷組進(jìn)行DAPI和Nestin染色，與正常培養(yǎng)的NSCs相比，可見Nestin標(biāo)記陽性的細(xì)胞形態(tài)變得略細(xì)長，但Nestin/DAPI比值均＞99%，說明加人參皂苷處理后及對照組的細(xì)胞仍為NSCs。相較于對照組，人參皂苷Rd的0.1μmol/L、1μmol/L和10μmol/L三個濃度組及Re的1μmol/L濃度組BrdU染色陽性細(xì)胞數(shù)比例，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。而Re的0.1μmol/L和10μmol/L組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。人參皂苷Rd、Re促進(jìn)NSCs增殖的適宜濃度均為1μmol/L，而和Re組相比，1μmol/L的Rd對NSCs促增殖作用更強(qiáng)。見圖3，表2。（采用的Nestin和BrdU抗體均為鼠抗）。

圖3 不同濃度Rd和Re對NSCs促增殖的作用（熒光染色，400í）

表2 人參皂苷Rd、Re對NSCs促分化作用 ［%，（x±s）］

2.4 不同濃度人參皂苷Rd、Re對NSCs促分化作用 通過Tuj1和GFAP免疫熒光染色法，比較人參皂苷Rd、Re單體對NSCs分化為神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞的效率。選用1%FBS誘導(dǎo)分化NSCs作為對照組，選10μmol/L人參皂苷Rd、Re，分別聯(lián)合1% FBS誘導(dǎo)分化NSCs 5～7d作為實驗組，計算Tuj1/DAPI、GFAP/DAPI比值。與對照組相比，人參皂苷Rd、Re組Tuj1/DAPI比值無顯著性差異，本研究中未發(fā)現(xiàn)Rd、Re有促進(jìn)NSCs分化為神經(jīng)元細(xì)胞作用。和對照組比較，人參皂苷Rd和Re組增加了GFAP陽性細(xì)胞比例，人參皂苷Rd和Re均可促NSCs分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞，而與Rd相比，10μmol/L的Re對NSCs促分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞作用更強(qiáng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

中醫(yī)理論認(rèn)為腎精不足、髓?？仗撌菍?dǎo)致腦神失用即神經(jīng)功能減退的主要原因，使用益氣類中藥可促進(jìn)NSCs的增殖分化，從而恢復(fù)腦功能。人參是益氣類中藥的代表，具有增強(qiáng)免疫力、改善記憶力、抗腫瘤、抗衰老、抗疲勞等作用，這源于其含有多種生物活性物質(zhì)，人參皂苷是其中最重要的部分。人參皂苷Rd是人參主要活性成分之一，具有廣泛的藥理活性，可改善心腦血管系統(tǒng)、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)、治療潰瘍性結(jié)腸炎、抑制腫瘤細(xì)胞生長、延緩衰老等，這些是和中藥人參大補(bǔ)元氣和益智的作用分不開的。

在分化實驗中，發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rd、Re可促進(jìn)NSCs分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞，未發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rd、Re對NSCs分化為神經(jīng)元細(xì)胞有促進(jìn)作用，這可能和選取的皂苷濃度以及實驗操作手法不同等有關(guān)。有報道星形膠質(zhì)細(xì)胞在大腦中起支持和分隔神經(jīng)細(xì)胞的作用，故Rd、Re可能在支持和分隔神經(jīng)細(xì)胞方面發(fā)揮作用［8］。

本研究中，除首次探索Re對NSCs促增殖有效濃度1μm外，還發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rd三個濃度均能促進(jìn)NSCs增殖，同時本實驗中得出Rd的1μm為促進(jìn)NSCs增殖的最合適濃度。同一濃度（1μmol/L）Re和Rd相比較，Rd對NSCs促增殖作用更強(qiáng)。另外，已發(fā)現(xiàn) Rb1 比 Rg1 對 NSCs 促增殖作用更強(qiáng)［7］，Rd 和 Rb1均屬于原人參二醇型，是否人參皂苷原人參二醇型比原人參三醇型普遍存在促NSCs增殖作用更強(qiáng)，有待進(jìn)一步實驗研究。這個篩選結(jié)果為今后研究NSCs從體外轉(zhuǎn)至體內(nèi)的增殖、細(xì)胞移植后的存活以及選擇人參皂苷的種類、濃度提供實驗基礎(chǔ)。

研究表明，PI3K/AKT，MAPK/Mek是常見的幾種參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、存活、凋亡及分化的信號通路，其中PI3K/AKT信號通路與NSCs增殖密切相關(guān)，對人參皂苷的研究基本集中在PI3K/AKT、Mek/MAPK/ERK等通路上。目前，Rd、Re兩種皂苷的通路研究大多在其他細(xì)胞而NSCs較少涉及。本實驗發(fā)現(xiàn)Re有調(diào)高mAKT1、mAKT2、mMAPK1、mMek、mNFKB、mPI3K表達(dá)水平的趨勢，Re促進(jìn)NSCs增殖的機(jī)制可能與PI3K/AKT、PI3K/NFKB、MAPK/Mek信號通路的激活有關(guān)。本實驗結(jié)果為mRNA的表達(dá)，可在后續(xù)研究中進(jìn)行AKT的蛋白表達(dá)和磷酸化水平測定，進(jìn)一步驗證其增殖的機(jī)制。另外，有研究證實人參皂苷Re通過抑制脂多糖引起的NFKB信號通路的誘導(dǎo)表達(dá)增加，發(fā)揮抗炎作用，表明Re促進(jìn)NSCs增殖可能具有抗細(xì)胞凋亡、抗炎等多靶點作用［9］。

總之，是否人參皂苷Rd、Re對NSCs的增殖具有另外的信號通路，抑或是多條信號通路共同起作用，還是中藥對NSCs增殖分化信號通路具有綜合調(diào)控作用，還需做進(jìn)一步的深入探討與實驗研究。本實驗為后期對人參皂苷促NSCs增殖的研究奠定基礎(chǔ)，在促增殖機(jī)制研究中可根據(jù)不同皂苷選擇不同的信號通路進(jìn)一步研究。