張奎原，南 濤，張 虎，孫澤坤，楊薛楓，孫兆林，胡建新

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州 貴陽 550000；2.貴州省人民醫(yī)院泌尿外科，貴州 貴陽 550000)

精原干細(xì)胞(spermatogonial stem cells，SSCs)是一種定向分化為成熟精子的干細(xì)胞[1～3]。然而，如何促進(jìn)小鼠SSCs生長、增殖與分化作用尚不明確。近年來，男性精子總量及精子質(zhì)量較前明顯下降。男性少、弱精子癥及無精癥發(fā)病率明顯呈增高趨勢(shì)，男性不育率已占不育夫婦的20% 以上[4～6]。有相關(guān)研究表明胃酸相關(guān)癥狀藥物治療對(duì)活動(dòng)精子總數(shù)和濃度有影響，提示抑酸藥物使用與男性不育者精子質(zhì)量較差相關(guān)[7]，但具體作用的分子機(jī)制尚不明確。2015年12月至2019年3月本研究探討抑酸藥物對(duì)體外培養(yǎng)SSCs增殖與分化的影響，探討其對(duì)男性生殖能力的不良影響。

1 材料與方法

1.1 材料5～7日齡昆明雄性小白鼠30只購置于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(貴州醫(yī)科大學(xué))；透明質(zhì)酸酶、胰蛋白酶、胎牛血清、Ⅳ型膠原酶、DMEM/F-12、DMEM、雙抗?jié)鈨?chǔ)液(1000×P/S)：1×105IU/ml、青霉素鈉，1×105μg/ml 硫酸鏈霉素、TrisHCI、kit(FITC抗體：免疫熒光)、a6-整合素(FITC抗體：疫熒光)等(sigma公司)；奧美拉唑膠囊(20 mg)，購自浙江金華康恩貝公司；Trizol：碧云天生物；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，PCR Mix 試劑盒：Fermentas。DNA Marker DL2，000：5×DNA上樣緩沖液：美國ProMab，SJ-TD20085201。TaKaRa D501 A，PCR儀，ABI公司；水平電泳槽(北京儀器公司)；離心機(jī)、JY-SPC、DG-Ⅲ電泳儀、 SIGMA，1-13(北京鼎國公司)；成像系統(tǒng)等。

1.2 方法

1.2.1小鼠SSCs體外分離、培養(yǎng) ①酒精(75%)浸泡昆明小鼠15 min。②分離出小鼠雙側(cè)睪丸組織，置于培養(yǎng)皿中(含有PBS)，PBS清洗2～3次。③充分去除睪丸外層組織，并將睪丸組織移入10 ml離心管。④加入10倍體積PBS，反復(fù)充分吹打(進(jìn)一步祛除白膜)，靜置，待沉淀后棄上清。⑤加入膠原酶Ⅳ(10倍體積)，置于37 ℃恒溫箱，放置10 min。⑥加入5～10 mlPBS，輕輕吹打1～2 min，600r離心5 min，棄上清(重復(fù)2～3次)。⑦加入胰蛋白酶(5倍體積)，置于37 ℃水浴鍋，消化10 min，并不斷吹打(充分消化)。⑧加入等體積DMEM，400目細(xì)胞篩，濾過細(xì)胞(祛除雜質(zhì))。⑨濾液16 ℃1000r 6 min，棄上清，洗滌2～3次。⑩計(jì)數(shù)5×105個(gè)/ml，接種于培養(yǎng)基。6～8 h后，采用差速貼壁法分離小鼠 SSCs和Sertoli。

1.2.2小鼠SSCs生長情況 共培養(yǎng)24、72、120、192及240 h后，用400×顯微鏡分別觀察二組細(xì)胞生長狀態(tài)、數(shù)目的變化。

1.2.3小鼠SSCs的鑒定 ①加入PBS液，浸洗2次，5 min/次。②4% PFA(多聚甲醛)固定細(xì)胞20 min，PBS液浸洗3次，5 min/次。③0.1 TWeen-20(PBST)10 min，透化細(xì)胞，PBS洗一次，5 min/次。④加入5%BSA的PBST，封閉45 min。⑤加入一抗(1∶200稀釋封閉液，置于4 ℃培養(yǎng)箱過夜)。⑥加入二抗稀釋液，細(xì)胞洗滌3次，5 min/次。⑦加入二抗(1∶200稀釋于二抗稀釋液中)，37 ℃，60 min。⑧PBS洗3次，5 min/次。加入DAPI 3～5 min，PBS洗3次，5 min/次。⑨置于顯微鏡(免疫熒光)下檢測(cè)。

1.2.4小鼠SSCs生長增殖檢測(cè) 取實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組生長狀態(tài)良好的兩組細(xì)胞，調(diào)控細(xì)胞濃度為(5×104/ml)，并種植于96孔板中，190 μl/孔，分別孵育24 h后，加入查爾酮類衍生物C10，并設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，分別共培養(yǎng)24、72、120、192、240 h后，每孔加入20 μl MTT，孵育6～8 h后離心，棄上清液，然后加入150 μl DMSO，室溫震蕩15分鐘，并置于490 nm光激發(fā)下用酶標(biāo)儀測(cè)吸光度(OD值)。

1.2.5小鼠精原干細(xì)胞基因水平檢測(cè) 運(yùn)用PCR技術(shù)，檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組SSCs 基因水平。

1.2.6RNA提取 ①樣本中加入0.8 ml Trizol，吹打使細(xì)胞充分溶解。②室溫下靜置5～10 min，后添加氯仿(0.2倍體積)，需震動(dòng)15秒，后在2～8 ℃下離心機(jī)12，000×g離心15 min。③將水樣層樣本轉(zhuǎn)移至試管中，加入異丙醇(0.5倍體積)，二者充分混勻后置于-20 ℃冰箱10～15 min，后在2～8 ℃下離心機(jī)12，000×g離心10 min。④去上層懸液，將RNA沉淀用1 ml 75%乙醇清洗，在震蕩器上混勻，置于2～8 ℃離心機(jī)7，500×g，5 min，保留下層沉淀。5.待RNA沉淀適度干燥后，加入無RNase的水(使RNA溶解)。⑥室溫下離心機(jī)2000 rpm離心20 sec。⑦將獲得的RNA溶液，保存于-80 ℃待用。

1.2.7PCR擴(kuò)增程序 獲得所需樣品。

1.2.8瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) 上樣：須預(yù)電泳5 min(上樣前)，后加入上樣孔。電泳：5～6 V/cm電壓2～2.5 h，使溴酚蘭指示劑進(jìn)入凝膠(2～3 cm即可)。紫外透射光下，觀察結(jié)果并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0軟件分析數(shù)據(jù)，重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)比較采用方差分析及LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠SSCs生長狀態(tài)觀察對(duì)照組精原干細(xì)胞 小鼠SSCs接種12～24 h后，細(xì)胞開始黏附、分裂增殖，呈體積中等、圓形、大小均一。細(xì)胞之間見未斷開的間橋，邊緣呈透明狀。隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長，精原干細(xì)胞生長、增殖逐漸明顯，并在接種后第240 h形成數(shù)百個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)，細(xì)胞總數(shù)達(dá)高峰。實(shí)驗(yàn)組小鼠SSCs 實(shí)驗(yàn)組SSCS相對(duì)較對(duì)照組細(xì)胞貼壁慢，并且較為散亂，細(xì)胞之間未見明顯相互連接。培養(yǎng)240 h時(shí)，可見小鼠SSCs有增殖，但細(xì)胞的數(shù)目、細(xì)胞相互連接仍不明顯。如圖1。

圖1 各組 SSCs生長形態(tài)檢測(cè)(顯微鏡檢測(cè)，×400) a：對(duì)照組培養(yǎng)24 h；b：對(duì)照組培養(yǎng)240 h；c：實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)24 h；d 實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)240 h

2.2 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組精原干細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果培養(yǎng)240 h后分別運(yùn)用免疫熒光顯微鏡(400倍)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組SSCs：兩組小鼠SSCs大小、生長狀態(tài)相似，但實(shí)驗(yàn)組小鼠SSCs總數(shù)明顯低于對(duì)照組。如圖2。

圖2 各組細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果(免疫熒光檢測(cè)，×400) a：實(shí)驗(yàn)組；b：對(duì)照組

2.3 小鼠SSCs生長、增殖檢測(cè)隨共培養(yǎng)時(shí)間的延長，對(duì)照組小鼠SSCs OD值，逐漸增高，相對(duì)實(shí)驗(yàn)組小鼠SSCs，OD值則增高不明顯。不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，二組小鼠SSCs OD值結(jié)果性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01)。見表1。

培養(yǎng)時(shí)間(h)實(shí)驗(yàn)組(n=30)對(duì)照組(n=30)240.122±0.031?0.174±0.027720.165±0.016?0.273±0.0561200.217±0.029?0.324±0.0301920.345±0.042?0.599±0.0472400.400±0.082?1.052±0.097

* 與對(duì)照組比較，P< 0.01

2.4 小鼠SSCs生長、增殖基因(PCR)檢測(cè)共培養(yǎng)240 h時(shí)，提取小鼠實(shí)驗(yàn)組SSCs及對(duì)照組SSCs，運(yùn)用PCR技術(shù)(聚合酶鏈反應(yīng))，分別檢測(cè)兩組小乳鼠SSCs DNA。可見對(duì)照組小鼠SSCsDNA量明顯高于實(shí)驗(yàn)組小鼠SSCs，見圖3。

圖3 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組PCR結(jié)果(Marker自上而下為750bp、500bp、250bp、100bp)a:實(shí)驗(yàn)組：b：對(duì)照組

3 討論

小鼠睪丸SSCs是定向分化為精子的起始細(xì)胞，受其周圍的內(nèi)環(huán)境因素影響較大。影響精子總數(shù)及質(zhì)量的原因有很多種，尤其是藥物對(duì)男性生育能力的不良作用，受到其的種類、劑量、藥代動(dòng)力學(xué)、療程、患者年齡等諸多因素的影響[8～10]。一般來說，藥物的劑量越大、藥代動(dòng)力學(xué)越長、療程越長、年齡越小，對(duì)男性生育功能的損害就越嚴(yán)重，從而造成精子總數(shù)量及精子質(zhì)量的下降[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)的精原干細(xì)胞培養(yǎng)液中添加質(zhì)子泵抑制藥奧美拉唑后，SSCs的生長變慢，增殖與分化也受到了不良影響。前期實(shí)驗(yàn)表明：SSCs貼壁速度較慢，為12～24 h，潛伏期為24～96 h，故選擇在培養(yǎng)24、72、120、192、240 h分別用顯微鏡直視下觀察兩組SSCs在不同時(shí)間點(diǎn)SSCs生長形態(tài)及數(shù)目；結(jié)果表明，培養(yǎng)240 h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)目明顯低于對(duì)照組，故選擇培養(yǎng)240 h時(shí)進(jìn)行PCR技術(shù)檢測(cè)。研究提示質(zhì)子泵抑酸藥對(duì)SSCs產(chǎn)生了不良影響，很可能造成男性不育。另有研究表明，抑酸藥物對(duì)活動(dòng)精子總數(shù)和濃度有影響，與男性不育者精子質(zhì)量較差相關(guān)，以及與精子濃度降低相關(guān)。并假設(shè)抑酸藥物降低小腸吸收維生素B的可得性，從而造成一碳物質(zhì)代謝紊亂，并對(duì)精子形成造成不利影響[12]。但具體作用機(jī)制尚不清楚。Kadam等[13]研究發(fā)現(xiàn)，色域解旋酶/ATP酶DNA結(jié)合蛋白(Chd1)是一種新的SSCs存活和自我更新調(diào)節(jié)因子，并用高通量的小RNA測(cè)序揭示Chd1控制的microRNA(MiR)表達(dá)譜，結(jié)果表明，在SSCs中，124 miR轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)受到Chd1的不同調(diào)控。KEGG通路分析表明，Chd1抑制的差異表達(dá)miRs蛋白，在干細(xì)胞多能性和增殖相關(guān)的通路呈現(xiàn)中明顯富集的作用。并證明了上調(diào)miRs之一miR-486控制著SSCs基因的表達(dá)和生長特性。即Chd1、miR-486和MMP 2協(xié)同調(diào)控SSCs基因表達(dá)和生長特性。我們猜想抑酸藥物(奧美拉唑)是通過作用于色域解旋酶/ATP酶DNA結(jié)合蛋白(Chd1l)，抑制調(diào)控miR-486和MMP 2，從而抑制SSCs生長與增值分化。Chd1l-miR-486-MMP 2是調(diào)控SSCs基因表達(dá)和生長特性的一個(gè)新的調(diào)節(jié)軸。我們通過向DMEM/F12完全培養(yǎng)液中添加中抑酸藥物藥后培養(yǎng)SSCs，培養(yǎng)結(jié)果顯示SSCs生長與增殖分化明顯受到抑制，這可能與抑酸藥物中的質(zhì)子泵抑制劑抑制了SSCsChd1l-miR-486-MMP 2靶向軸有關(guān)將，也將加快人們對(duì)這一領(lǐng)域的深入認(rèn)識(shí)，也為治療男性不育提供一種新的治療方法。