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        早期動(dòng)脈粥樣硬化患者的血清代謝組學(xué)研究*

        2019-07-29 00:57:44呂曉鵬張澤群王春梅
        關(guān)鍵詞:組學(xué)脂質(zhì)產(chǎn)物

        呂曉鵬,張澤群,王春梅

        (1.長(zhǎng)春市人民醫(yī)院 康復(fù)醫(yī)學(xué)科,吉林 長(zhǎng)春 130051;2.北華大學(xué)藥學(xué)院, 吉林 吉林 132013)

        動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是脂質(zhì)代謝紊亂造成的血管病變,為大多數(shù)心腦血管疾病的共同病理基礎(chǔ)[1]。冠狀動(dòng)脈造影和動(dòng)脈波傳導(dǎo)速度雖然可作為有效的檢測(cè)方法,但是由于價(jià)格昂貴、步驟繁瑣及造成創(chuàng)傷等原因難以大范圍應(yīng)用[2]。代謝組學(xué)技術(shù)已成為眾多疾病早期診斷的重要依據(jù)[3-4]。本研究運(yùn)用基于超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)的代謝組學(xué)方法尋找潛在的生物標(biāo)志物,為AS早期臨床診斷提供依據(jù)。

        1 資料與方法

        1.1 材料與試劑

        甲醇、甲酸(色譜純,美國(guó)TEDIA試劑公司),超純水由Milli-Q超純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司)制備。

        1.2 儀器與設(shè)備

        VaSera VS-1000無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈血管彈性測(cè)定儀(日本福田公司),Waters Acquity超高效液相色譜系統(tǒng)(美國(guó)Waters公司),Q-TOF SYNAPT G2 HDMS質(zhì)譜儀(美國(guó)Waters公司,配有ESI離子源)。

        1.3 方法

        1.3.1 樣本收集選取2016年3月—2017年6月長(zhǎng)春市人民醫(yī)院收治的24例健康志愿者(對(duì)照組)和27例AS患者(AS組),血液樣本由本院心內(nèi)科和體檢中心提供。以頸-股動(dòng)脈脈搏傳導(dǎo)速度> 9 cm/s為AS篩選指標(biāo)[5],患者均為男性,無(wú)其他疾病。

        1.3.2 血清樣本的前處理清晨空腹?fàn)顟B(tài)下采集血液樣本,3 000 r/min離心10 min,提取200μl血清加入800μl甲醇,渦旋1 min,4℃、1 200 r/min離心5 min,取上清液過(guò)0.45μm濾膜,4℃保存待測(cè)。

        1.3.3 色譜條件選用Water ODS色譜柱(250.0 mm×4.6 mm,5μm),柱溫30℃,流動(dòng)相A:甲醇;流動(dòng)相B:超純水(0.1%甲酸);流動(dòng)相梯度:0~<5 min,5%~<20% A;5~<10 min,20%~<35% A;10~<15 min,35%~<60% A;15~20 min,60%~100% A。流速0.5 ml/min,進(jìn)樣量為5μl。

        1.3.4 液相條件電離源溫度:260℃;干燥氣(N2)流速:10 L/min;霧化器壓力:30 psig;裂解電壓:160 V;錐孔電壓:62 V;質(zhì)量掃描范圍: 100~1 100 m/z。樣本測(cè)定前運(yùn)用調(diào)諧液對(duì)質(zhì)量軸進(jìn)行校正。

        1.3.5 質(zhì)量控制取所有待測(cè)血清樣本各50μl,混合后作為質(zhì)量控制樣本(quality control, QC)評(píng)價(jià)分析方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性,每8個(gè)待測(cè)定樣本中插入1個(gè)QC樣本。在正離子和負(fù)離子模式下各選5個(gè)離子,所選離子如下:正離子模式為m/z 136.2 681、187.0 638、214.6 059、314.2 274、418.6 837;負(fù)離子模式為m/z 162.5 545、196.6 528、242.5 286、276.4 608、318.5 960。對(duì)上述10個(gè)離子的保留時(shí)間、峰面積和質(zhì)荷比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

        1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        樣本運(yùn)用超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間-質(zhì)譜(UPLC/Q-TOF-MS)進(jìn)行檢測(cè),得到樣本的色譜圖,采用MarkerLynx軟件對(duì)所得信息進(jìn)行提取、背景扣除、峰校準(zhǔn)、歸一化及數(shù)據(jù)簡(jiǎn)化處理,將結(jié)果轉(zhuǎn)化為包含化合物保留時(shí)間與質(zhì)荷比信息的.csv格式文件。再導(dǎo)入EZinfo 2.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,并運(yùn)用偏最小二乘法判別分析法(partial least squaresdiscriminant analysis, PLS-DA)和正交偏最小二乘法判別分析法(orthogonal partial least squares-discriminant analysis, OPLS-DA)獲得樣本分類(lèi)信息并對(duì)潛在生物標(biāo)志物進(jìn)行篩選,根據(jù)精確分子質(zhì)量和碎裂離子特征與數(shù)據(jù)庫(kù)HMDB[6]、LIPID MAPS[7]及KEGG[8]進(jìn)行匹配比較,通過(guò)潛在生物標(biāo)志物標(biāo)準(zhǔn)品的串聯(lián)譜圖特征再進(jìn)行比對(duì)驗(yàn)證以最終確認(rèn)。P <0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 兩組一般資料比較

        兩組年齡、體重指數(shù)(BMI)、收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)及高密度脂蛋白(HDL)等一般資料比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P >0.05),而動(dòng)脈波傳導(dǎo)速度比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P <0.05)。見(jiàn) 表1。

        表1 兩組一般資料比較 (±s)

        表1 兩組一般資料比較 (±s)

        組別n年齡/歲BMI/ (kg/m2)SBP/mmHgDBP/mmHgTC/(mmol/L)TG/(mmol/L)LDL/(mmol/L)HDL/(mmol/L)動(dòng)脈波傳導(dǎo)速度/(m/s)對(duì)照組2443.62±3.4224.51±2.16125.81±7.2987.59±5.275.42±0.711.61±0.262.85±0.381.26±0.338.58±1.14 AS組2744.28±2.8523.85±1.97127.24±6.0988.60±5.335.36±0.651.68±0.252.96±0.501.23±0.299.62±1.34 t值1.0251.0421.0911.0861.0571.0611.0131.1282.217 P值0.5060.4300.3340.3840.4160.4050.5230.2710.021

        2.2 UPLC/Q-TOF-MS方法的血清代謝譜分析

        10個(gè)選定離子的保留時(shí)間、峰面積及質(zhì)荷比相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.17%~0.28%、6.70%~9.60%及0.00%~0.07%。結(jié)果表明,本方法分析過(guò)程中儀器和試劑的穩(wěn)定性和重復(fù)性良好。正離子和負(fù)離子模式下兩組典型基峰強(qiáng)度色譜圖(base peak intensity chromatograms, BPI)中可看出兩組間部分峰有差異(見(jiàn)圖1)。PLS-DA得分圖中每一個(gè)標(biāo)記代表一個(gè)樣本,樣本在空間中位置由其化合物的種類(lèi)和含量所決定,因此特征相似的樣本會(huì)距離比較近,在正離子和負(fù)離子模式下,兩組樣本分離明顯,表明兩組血清代謝輪廓發(fā)生改變(見(jiàn)圖2)。運(yùn)用PLS-DA和OPLSDA法對(duì)兩組樣本進(jìn)行分析(評(píng)價(jià)指標(biāo)包括R2X和R2Y值表示模型擬合情況),Q2值表示模型的預(yù)測(cè)能力。結(jié)果表明,模型的穩(wěn)定性和預(yù)測(cè)率較高。見(jiàn) 圖1、2。

        圖1 兩組患者典型樣本BPI色譜圖

        圖2 兩組樣本PLS-DA得分圖

        2.3 差異代謝產(chǎn)物鑒定和變化趨勢(shì)

        PLS-DA載荷圖中每一個(gè)標(biāo)記代表一個(gè)化合物,距離中心越遠(yuǎn)的化合物對(duì)分組的貢獻(xiàn)越大。將VIP>1視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義變量,最終在正離子模式下共鑒定2個(gè)代謝產(chǎn)物,負(fù)離子模式下共鑒定4個(gè)代謝產(chǎn)物。列舉差異代謝產(chǎn)物信息,與對(duì)照組比較,AS組血清中甜菜堿(t =2.164,P =0.027)含量升高,而磷脂酰膽堿(t =2.073,P =0.038)、亞油酸(t =2.127,P =0.031)、3-羥基丁酸酯(t =2.093,P =0.034)、檸檬酸(t =2.029,P =0.042)及賴(lài)氨酸(t =2.132,P =0.030)含量降低。見(jiàn)表2和圖3。

        表2 兩組血清差異代謝產(chǎn)物鑒定結(jié)果

        圖3 兩組樣本的OPLS-DA載荷圖

        3 討論

        代謝組學(xué)研究的目的主要是疾病診斷或發(fā)生發(fā)展機(jī)制的探討。AS研究中,普遍認(rèn)為脂質(zhì)代謝紊亂是造成AS的重要誘因,有些報(bào)道也將極低密度脂蛋白、HDL、LDL、TC及TG等指標(biāo)作為代謝產(chǎn)物用于AS代謝組學(xué)的研究[9-10]。為獲得AS早期潛在診斷指標(biāo),本研究選擇AS患者時(shí),未將血脂異?;颊呒{入研究范圍,旨在觀察血脂未發(fā)生異常時(shí)體內(nèi)代謝產(chǎn)物的潛在變化;同時(shí)為防止性別、年齡、體重及血壓等因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響,對(duì)病例選擇進(jìn)行嚴(yán)格 篩選。

        氨基酸代謝方面,甜菜堿作為甲硫氨酸循環(huán)過(guò)程中甲基的供體參與氨基酸代謝。大量研究表明,甜菜堿與AS發(fā)生呈正相關(guān),是預(yù)測(cè)高脂血癥和冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的早期生物標(biāo)志物[11]。賴(lài)氨酸在血漿白蛋白和含有apoB100的分子中以糖基化產(chǎn)物或氧化修飾形式存在,血中低水平游離賴(lài)氨酸在血脂發(fā)生變化時(shí)代表氧化應(yīng)激的發(fā)生[12]。本研究表明,AS發(fā)生早期,血中氨基酸類(lèi)物質(zhì)已經(jīng)產(chǎn)生變化,且預(yù)示氧化應(yīng)激的發(fā)生。

        檸檬酸作為三羧酸循環(huán)的重要中間體,其參與體內(nèi)脂肪、蛋白質(zhì)及糖類(lèi)物質(zhì)的代謝過(guò)程,也是體內(nèi)能量供應(yīng)的中間環(huán)節(jié)。有研究表明檸檬酸和其他參與三羧酸循環(huán)的物質(zhì)與AS密切相關(guān)[13],表明AS發(fā)生早期體內(nèi)三羧酸循環(huán)出現(xiàn)紊亂。亞油酸作為一種多不飽和脂肪酸,是花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素途徑的前體物質(zhì)。有研究表明,花生四烯酸及其代謝產(chǎn)物前列腺素和白三烯在AS和高血壓發(fā)生過(guò)程中密切相關(guān)。也有研究報(bào)道,亞油酸在降低血清TC和LDL水平方面起重要作用[14]。3-羥基丁酸酯是由乙酰輔酶A生成的一種酮體。以往研究認(rèn)為,3-羥基丁酸酯的減少意味著高脂血癥的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中酮體的積累及乙酰乙酸向丙酮轉(zhuǎn)化的降低,表明脂肪酸氧化作用的增強(qiáng)[15]。磷脂酰膽堿是HDL中最為主要的脂質(zhì),可通過(guò)清除過(guò)多TC及改善血中膽固醇和脂質(zhì)的溶解度來(lái)影響脂質(zhì)和膽固醇的沉積;同時(shí)磷脂酰膽堿也是合成極低密度脂蛋白的重要物質(zhì),如果不足則會(huì)造成肝臟脂肪的堆積[16]。

        綜上所述,運(yùn)用基于UPLC/Q-TOF-MS技術(shù)的代謝組學(xué)方法對(duì)AS男性患者血清代謝譜進(jìn)行研究,共鑒定甜菜堿、磷脂酰膽堿、亞油酸、3-羥基丁酸酯、檸檬酸及賴(lài)氨酸6個(gè)差異代謝產(chǎn)物。表明在AS發(fā)生早期體內(nèi)氨基酸代謝、脂肪酸代謝、磷脂代謝及三羧酸循環(huán)發(fā)生了變化,這些變化有助于了解AS的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程,為AS早期篩查提供新的參考依據(jù)。

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