呂曉鵬，張澤群，王春梅

（1.長(zhǎng)春市人民醫(yī)院 康復(fù)醫(yī)學(xué)科，吉林 長(zhǎng)春 130051；2.北華大學(xué)藥學(xué)院， 吉林 吉林 132013)

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis, AS）是脂質(zhì)代謝紊亂造成的血管病變，為大多數(shù)心腦血管疾病的共同病理基礎(chǔ)[1]。冠狀動(dòng)脈造影和動(dòng)脈波傳導(dǎo)速度雖然可作為有效的檢測(cè)方法，但是由于價(jià)格昂貴、步驟繁瑣及造成創(chuàng)傷等原因難以大范圍應(yīng)用[2]。代謝組學(xué)技術(shù)已成為眾多疾病早期診斷的重要依據(jù)[3-4]。本研究運(yùn)用基于超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)的代謝組學(xué)方法尋找潛在的生物標(biāo)志物，為AS早期臨床診斷提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、甲酸（色譜純，美國(guó)TEDIA試劑公司），超純水由Milli-Q超純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）制備。

1.2 儀器與設(shè)備

VaSera VS-1000無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈血管彈性測(cè)定儀（日本福田公司），Waters Acquity超高效液相色譜系統(tǒng)（美國(guó)Waters公司），Q-TOF SYNAPT G2 HDMS質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters公司，配有ESI離子源）。

1.3 方法

1.3.1 樣本收集選取2016年3月—2017年6月長(zhǎng)春市人民醫(yī)院收治的24例健康志愿者（對(duì)照組）和27例AS患者（AS組），血液樣本由本院心內(nèi)科和體檢中心提供。以頸-股動(dòng)脈脈搏傳導(dǎo)速度＞ 9 cm/s為AS篩選指標(biāo)[5]，患者均為男性，無(wú)其他疾病。

1.3.2 血清樣本的前處理清晨空腹?fàn)顟B(tài)下采集血液樣本，3 000 r/min離心10 min，提取200μl血清加入800μl甲醇，渦旋1 min，4℃、1 200 r/min離心5 min，取上清液過(guò)0.45μm濾膜，4℃保存待測(cè)。

1.3.3 色譜條件選用Water ODS色譜柱（250.0 mm×4.6 mm，5μm），柱溫30℃，流動(dòng)相A：甲醇；流動(dòng)相B：超純水（0.1%甲酸）；流動(dòng)相梯度：0～＜5 min，5%～＜20% A；5～＜10 min，20%～＜35% A；10～＜15 min，35%～＜60% A；15～20 min，60%～100% A。流速0.5 ml/min，進(jìn)樣量為5μl。

1.3.4 液相條件電離源溫度：260℃；干燥氣（N2）流速：10 L/min；霧化器壓力：30 psig；裂解電壓：160 V；錐孔電壓：62 V；質(zhì)量掃描范圍： 100～1 100 m/z。樣本測(cè)定前運(yùn)用調(diào)諧液對(duì)質(zhì)量軸進(jìn)行校正。

1.3.5 質(zhì)量控制取所有待測(cè)血清樣本各50μl，混合后作為質(zhì)量控制樣本（quality control, QC）評(píng)價(jià)分析方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性，每8個(gè)待測(cè)定樣本中插入1個(gè)QC樣本。在正離子和負(fù)離子模式下各選5個(gè)離子，所選離子如下：正離子模式為m/z 136.2 681、187.0 638、214.6 059、314.2 274、418.6 837；負(fù)離子模式為m/z 162.5 545、196.6 528、242.5 286、276.4 608、318.5 960。對(duì)上述10個(gè)離子的保留時(shí)間、峰面積和質(zhì)荷比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

樣本運(yùn)用超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間-質(zhì)譜（UPLC/Q-TOF-MS）進(jìn)行檢測(cè)，得到樣本的色譜圖，采用MarkerLynx軟件對(duì)所得信息進(jìn)行提取、背景扣除、峰校準(zhǔn)、歸一化及數(shù)據(jù)簡(jiǎn)化處理，將結(jié)果轉(zhuǎn)化為包含化合物保留時(shí)間與質(zhì)荷比信息的.csv格式文件。再導(dǎo)入EZinfo 2.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并運(yùn)用偏最小二乘法判別分析法（partial least squaresdiscriminant analysis, PLS-DA）和正交偏最小二乘法判別分析法（orthogonal partial least squares-discriminant analysis, OPLS-DA）獲得樣本分類(lèi)信息并對(duì)潛在生物標(biāo)志物進(jìn)行篩選，根據(jù)精確分子質(zhì)量和碎裂離子特征與數(shù)據(jù)庫(kù)HMDB[6]、LIPID MAPS[7]及KEGG[8]進(jìn)行匹配比較，通過(guò)潛在生物標(biāo)志物標(biāo)準(zhǔn)品的串聯(lián)譜圖特征再進(jìn)行比對(duì)驗(yàn)證以最終確認(rèn)。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較

兩組年齡、體重指數(shù)（BMI）、收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL）及高密度脂蛋白（HDL）等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），而動(dòng)脈波傳導(dǎo)速度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見(jiàn) 表1。

表1 兩組一般資料比較 （±s）

表1 兩組一般資料比較 （±s）

組別n年齡/歲BMI/ （kg/m2）SBP/mmHgDBP/mmHgTC/（mmol/L）TG/（mmol/L）LDL/（mmol/L）HDL/（mmol/L）動(dòng)脈波傳導(dǎo)速度/（m/s）對(duì)照組2443.62±3.4224.51±2.16125.81±7.2987.59±5.275.42±0.711.61±0.262.85±0.381.26±0.338.58±1.14 AS組2744.28±2.8523.85±1.97127.24±6.0988.60±5.335.36±0.651.68±0.252.96±0.501.23±0.299.62±1.34 t值1.0251.0421.0911.0861.0571.0611.0131.1282.217 P值0.5060.4300.3340.3840.4160.4050.5230.2710.021

2.2 UPLC/Q-TOF-MS方法的血清代謝譜分析

10個(gè)選定離子的保留時(shí)間、峰面積及質(zhì)荷比相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.17%～0.28%、6.70%～9.60%及0.00%～0.07%。結(jié)果表明，本方法分析過(guò)程中儀器和試劑的穩(wěn)定性和重復(fù)性良好。正離子和負(fù)離子模式下兩組典型基峰強(qiáng)度色譜圖（base peak intensity chromatograms, BPI）中可看出兩組間部分峰有差異（見(jiàn)圖1）。PLS-DA得分圖中每一個(gè)標(biāo)記代表一個(gè)樣本，樣本在空間中位置由其化合物的種類(lèi)和含量所決定，因此特征相似的樣本會(huì)距離比較近，在正離子和負(fù)離子模式下，兩組樣本分離明顯，表明兩組血清代謝輪廓發(fā)生改變（見(jiàn)圖2）。運(yùn)用PLS-DA和OPLSDA法對(duì)兩組樣本進(jìn)行分析（評(píng)價(jià)指標(biāo)包括R2X和R2Y值表示模型擬合情況），Q2值表示模型的預(yù)測(cè)能力。結(jié)果表明，模型的穩(wěn)定性和預(yù)測(cè)率較高。見(jiàn) 圖1、2。

圖1 兩組患者典型樣本BPI色譜圖

圖2 兩組樣本PLS-DA得分圖

2.3 差異代謝產(chǎn)物鑒定和變化趨勢(shì)

PLS-DA載荷圖中每一個(gè)標(biāo)記代表一個(gè)化合物，距離中心越遠(yuǎn)的化合物對(duì)分組的貢獻(xiàn)越大。將VIP＞1視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義變量，最終在正離子模式下共鑒定2個(gè)代謝產(chǎn)物，負(fù)離子模式下共鑒定4個(gè)代謝產(chǎn)物。列舉差異代謝產(chǎn)物信息，與對(duì)照組比較，AS組血清中甜菜堿（t =2.164，P =0.027）含量升高，而磷脂酰膽堿（t =2.073，P =0.038）、亞油酸（t =2.127，P =0.031）、3-羥基丁酸酯（t =2.093，P =0.034）、檸檬酸（t =2.029，P =0.042）及賴(lài)氨酸（t =2.132，P =0.030）含量降低。見(jiàn)表2和圖3。

表2 兩組血清差異代謝產(chǎn)物鑒定結(jié)果

圖3 兩組樣本的OPLS-DA載荷圖

3 討論

代謝組學(xué)研究的目的主要是疾病診斷或發(fā)生發(fā)展機(jī)制的探討。AS研究中，普遍認(rèn)為脂質(zhì)代謝紊亂是造成AS的重要誘因，有些報(bào)道也將極低密度脂蛋白、HDL、LDL、TC及TG等指標(biāo)作為代謝產(chǎn)物用于AS代謝組學(xué)的研究[9-10]。為獲得AS早期潛在診斷指標(biāo)，本研究選擇AS患者時(shí)，未將血脂異?；颊呒{入研究范圍，旨在觀察血脂未發(fā)生異常時(shí)體內(nèi)代謝產(chǎn)物的潛在變化；同時(shí)為防止性別、年齡、體重及血壓等因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，對(duì)病例選擇進(jìn)行嚴(yán)格 篩選。

氨基酸代謝方面，甜菜堿作為甲硫氨酸循環(huán)過(guò)程中甲基的供體參與氨基酸代謝。大量研究表明，甜菜堿與AS發(fā)生呈正相關(guān)，是預(yù)測(cè)高脂血癥和冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的早期生物標(biāo)志物[11]。賴(lài)氨酸在血漿白蛋白和含有apoB100的分子中以糖基化產(chǎn)物或氧化修飾形式存在，血中低水平游離賴(lài)氨酸在血脂發(fā)生變化時(shí)代表氧化應(yīng)激的發(fā)生[12]。本研究表明，AS發(fā)生早期，血中氨基酸類(lèi)物質(zhì)已經(jīng)產(chǎn)生變化，且預(yù)示氧化應(yīng)激的發(fā)生。

檸檬酸作為三羧酸循環(huán)的重要中間體，其參與體內(nèi)脂肪、蛋白質(zhì)及糖類(lèi)物質(zhì)的代謝過(guò)程，也是體內(nèi)能量供應(yīng)的中間環(huán)節(jié)。有研究表明檸檬酸和其他參與三羧酸循環(huán)的物質(zhì)與AS密切相關(guān)[13]，表明AS發(fā)生早期體內(nèi)三羧酸循環(huán)出現(xiàn)紊亂。亞油酸作為一種多不飽和脂肪酸，是花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素途徑的前體物質(zhì)。有研究表明，花生四烯酸及其代謝產(chǎn)物前列腺素和白三烯在AS和高血壓發(fā)生過(guò)程中密切相關(guān)。也有研究報(bào)道，亞油酸在降低血清TC和LDL水平方面起重要作用[14]。3-羥基丁酸酯是由乙酰輔酶A生成的一種酮體。以往研究認(rèn)為，3-羥基丁酸酯的減少意味著高脂血癥的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中酮體的積累及乙酰乙酸向丙酮轉(zhuǎn)化的降低，表明脂肪酸氧化作用的增強(qiáng)[15]。磷脂酰膽堿是HDL中最為主要的脂質(zhì)，可通過(guò)清除過(guò)多TC及改善血中膽固醇和脂質(zhì)的溶解度來(lái)影響脂質(zhì)和膽固醇的沉積；同時(shí)磷脂酰膽堿也是合成極低密度脂蛋白的重要物質(zhì)，如果不足則會(huì)造成肝臟脂肪的堆積[16]。

綜上所述，運(yùn)用基于UPLC/Q-TOF-MS技術(shù)的代謝組學(xué)方法對(duì)AS男性患者血清代謝譜進(jìn)行研究，共鑒定甜菜堿、磷脂酰膽堿、亞油酸、3-羥基丁酸酯、檸檬酸及賴(lài)氨酸6個(gè)差異代謝產(chǎn)物。表明在AS發(fā)生早期體內(nèi)氨基酸代謝、脂肪酸代謝、磷脂代謝及三羧酸循環(huán)發(fā)生了變化，這些變化有助于了解AS的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，為AS早期篩查提供新的參考依據(jù)。