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        二苯乙烯苷對(duì)HepG2細(xì)胞膽固醇含量的影響及其作用機(jī)制研究*

        2019-07-29 00:57:36林昶李玉平齊建彤鄭曙光朱璨柴藝匯徐昌君王和生楊長(zhǎng)福
        關(guān)鍵詞:外流苯乙烯膽固醇

        林昶,李玉平,齊建彤,鄭曙光,朱璨,柴藝匯,徐昌君,王和生,楊長(zhǎng)福

        (貴州中醫(yī)藥大學(xué),貴州 貴陽(yáng) 550002)

        何首烏為蓼科植物何首烏的干燥塊根,作為中醫(yī)常用的一味傳統(tǒng)中藥,在我國(guó)有著悠久的應(yīng)用歷史。現(xiàn)代研究表明,何首烏具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用[1]。該藥主要含3類(lèi)有效成分:蒽醌類(lèi)、二苯乙烯苷類(lèi)及多糖類(lèi)化合物。其中二苯乙烯苷有降血脂和抗動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis, AS)的作用,但其作用機(jī)制還不清楚[2-4]。本實(shí)驗(yàn)以肝癌HepG2細(xì)胞作為研究對(duì)象,采用氧化性低密度脂蛋白(oxidation low density lipoprotein, ox-LDL)制作高膽固醇細(xì)胞模型,二苯乙烯苷干預(yù)后觀察膽固醇含量的變化,以及ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1(ATP-binding cassette transporter A1, ABCA1)、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G1(ATP-binding cassette transporterG1, ABCG1)和B族I型清道夫受體(Scavenger reptor class B type I, SR-BI)mRNA表達(dá)水平的變化,初步探索二苯乙烯苷降膽固醇的作用機(jī)制。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        肝癌HepG2細(xì)胞(上海陸奧生物科技有限公司),0.25%胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司),青鏈霉素混合液(哈爾濱哈藥集團(tuán)制藥總廠),高糖DMEM(美國(guó)HyClone公司),胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司),總RNA提取試劑盒(日本TaKaRa公司MiniBEST Universal RNA Extraction Kit),cDNA鏈合成試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with Gdna Eraser)、PCR酶(Premix TaqTM)、瓊脂糖及DNA Marker等購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司,ox-LDL(北京索萊寶科技有限公司),膽固醇含量測(cè)定試劑盒(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司),DL5和00 DNA Marker(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司),油紅O染液(北京索萊寶科技有限公司),生工生物工程(上海)股份有限公司合成逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)擴(kuò)增引物。見(jiàn)表1。

        1.2 儀器與設(shè)備

        MSL-3020型全自動(dòng)高壓滅菌鍋(日本三洋有限公司),BSC 1800-Ⅱ-A/B3型超凈工作臺(tái)(上海瑞仰凈化裝備有限公司),TS-100F型倒置相差顯微鏡(日本Nikon公司),Multiskan FC自動(dòng)酶標(biāo)讀儀(美國(guó)Thermo公司),NKSY恒溫水浴鍋(江蘇諾基儀器有限公司),二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司),微量加樣器(德國(guó)Eppendorf公司),D-37520臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher公司),JA2004N型電子天平(上海箐海儀器有限責(zé)任公司),SIM-F140AY6ICEMAKER型制冰機(jī)(日本三洋有限公司),ELIX/RIOS-20型反滲透純水系統(tǒng)(法國(guó)Millipore公司),總/游離膽固醇含量測(cè)定試劑盒(E1015/E1016)(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司),PCR擴(kuò)增儀(GeneAmp 9700型,美國(guó)ABI公司),凝膠圖像分析系統(tǒng)(GGM/D2,英國(guó)Syngene公司),超低溫冰箱(德國(guó)Eppendorf公司),Bio-Rad GEL DOC 2000凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD公司),細(xì)胞培養(yǎng)瓶(美國(guó)Corning公司),6孔和96孔培養(yǎng)板(美國(guó) Corning公司)。

        表1 PT-PCR引物序列

        1.3 方法

        1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)HepG2細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于鏈霉素和青霉素終濃度為100 u/ml的含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中,每2~3天細(xì)胞傳代1次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。

        取HepG2細(xì)胞懸液,在顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/ml,將細(xì)胞懸液接種于25 cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),1ml/瓶,用培養(yǎng)基補(bǔ)足至3.5 ml,在37℃、5%二氧化碳CO2環(huán)境下孵育24 h至細(xì)胞貼壁,棄培養(yǎng)基,用提前預(yù)冷的PBS沖洗2次,更換培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)分為正常組、模型組(ox-LDL 50 mg/L)、 A組(ox-LDL 50 mg/L+二苯乙烯苷250μmol/L)、B組 (ox-LDL 50 mg/L+二苯乙烯苷188μmol/L)、C組(ox-LDL 50 mg/L二苯乙烯苷125μmol/L)及D組(ox-LDL 50 mg/L+二苯乙烯苷62.5μmol/L),每組培養(yǎng)3瓶,重復(fù)3次,換成相應(yīng)的培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48 h后。油紅O脂肪染色法觀察,測(cè)定各組細(xì)胞內(nèi)總膽固醇(total cholesterol, TC)、游離膽固醇(free cholesterol, FC)及培養(yǎng)基上清TC和FC。采用RTPCR檢測(cè)肝癌HepG2細(xì)胞ABCG1、ABCA1和SR-BI mRNA表達(dá)水平的變化。

        1.3.2 細(xì)胞變化按照油紅O脂肪染色試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色。吸去培養(yǎng)基,PBS清洗貼壁的細(xì)胞3次,ORO Fixative固定10 min,吸去固定液并干燥,ORO Stain液染15 min,加入適量60%異丙醇漂洗30 s并用流水沖洗,蘇木精復(fù)染2 min,ORO Buffer染1 min,流水沖洗晾干后鏡下觀察結(jié)果。

        1.3.3 膽固醇測(cè)定室溫下2 000 r/min離心5 min后,取各組細(xì)胞沉淀和培養(yǎng)基,沉淀需用PBS洗2次后以1×106個(gè)細(xì)胞加0.1 ml試劑盒配備的裂解液混勻,靜置10 min后取上清進(jìn)行膽固醇測(cè)定。用E1015試劑盒和E1016檢測(cè)沉淀和培養(yǎng)基中TC、FC。取適量上清用BCA法蛋白定量試劑盒(#p1511)測(cè)定蛋白濃度,以每毫克蛋白濃度校正上清TC、FC含量,校正上清膽固醇=上清總蛋白/FC濃度×蛋白濃度。應(yīng)用膽固醇的外流率=培養(yǎng)基TC/(培養(yǎng)基TC+細(xì)胞內(nèi)TC)的方式計(jì)算膽固醇的外流率。

        1.3.4 總RNA提取及RT-PCR擴(kuò)增按購(gòu)買(mǎi)的RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)和cDNA合成試劑盒的方法進(jìn)行總RNA提取并合成cDNA鏈,進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng),PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性2 min,94℃變性30 s,58℃(GAPDH)、60℃(ABCA1、ABCG1)、62℃(SR-BI)退火30 s,72℃延伸30 s,共30個(gè)循環(huán),72℃繼續(xù)延伸10 min。取5μl產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè),用BioRad凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照記錄,最后用GAPDH灰度值對(duì)目的基因進(jìn)行矯正并采用Quantity One軟件分析。

        1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn),P <0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 二苯乙烯苷在高膽固醇狀態(tài)下對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞內(nèi)膽固醇代謝的影響

        各組膽固醇情況比較,經(jīng)單因素方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P <0.05);正常組、A、B、C和D組細(xì)胞內(nèi)TC、FC含量均低于模型組(P <0.05),同時(shí)A、B、C和D組上清TC較模型組升高(P <0.05),B、C組上清FC較模型組升高(P <0.05)。二苯乙烯苷能夠減少HepG2細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量,增加膽固醇外流率(P <0.05),其中二苯乙烯苷濃度為125μmol/L時(shí)達(dá)最高值(t =10.094,P =0.000)。見(jiàn)表2和圖1。

        表2 各組膽固醇情況比較 (±s)

        表2 各組膽固醇情況比較 (±s)

        注:?與模型組比較,P <0.05

        組別細(xì)胞內(nèi)TC/(mmol/L)細(xì)胞內(nèi)FC/(mmol/L)上清TC/(mmol/L)上清FC/(mmol/L)膽固醇外流率/%正常組33.49±0.99?17.21±1.78?111.43±6.49?85.52±1.44?76.77±1.55?模型組120.42±1.4546.15±1.83139.21±4.9789.29±1.4453.59±0.76 A組43.91±1.42?25.84±1.32?177.61±6.49?88.98±2.0680.16±0.66?B組75.99±2.85?34.98±1.32?180.87±8.65?94.64±1.13?70.39±0.79?C組37.33±2.18?23.56±1.32?198.85±7.79?89.92±1.13?84.12±0.62?D組43.91±1.42?27.36±2.02?182.51±7.08?87.71±1.5880.59±0.59?F值1 015.091116.23765.97112.269468.170 P值0.0000.0000.0000.0000.000

        圖1 油紅O脂肪染色結(jié)果 (×400)

        2.2 不同濃度二苯乙烯苷對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞ABCA1、ABCG1和SR-BI mRNA表達(dá)的影響

        各組ABCA1、ABCG1和SR-BI mRNA表達(dá)水平比較,經(jīng)單因素方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P <0.05)。模型組可見(jiàn)各基因條帶較細(xì),較弱,進(jìn)一步兩兩比較顯示,模型組細(xì)胞ABCA1 mRNA表達(dá)水平較正常組下降(P <0.05)。A、B、C和D組ABCA1、ABCG1表達(dá)水平較模型組升高(P <0.05),A、B和C組SR-BI表達(dá)水平較模型組升高(P <0.05),A組與B組ABCA1、ABCG1及SR-BI mRNA表達(dá)水平比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t =1.586、0.221和0.372,P =0.139、0.829和0.716)。見(jiàn)表3和圖2~7。

        表3 各組ABCA1、ABCG1和SR-BI mRNA表達(dá)水平 比較 (±s)

        表3 各組ABCA1、ABCG1和SR-BI mRNA表達(dá)水平 比較 (±s)

        注:?與模型組比較,P <0.05

        組別ABCA1ABCG1SR-BI正常組1.13±0.11?1.40±0.14?0.76±0.12?模型組0.80±0.110.89±0.130.35±0.12 A組1.24±0.11?1.49±0.13?0.81±0.12?B組1.10±0.11?1.46±0.14?0.84±0.14?C組1.07±0.11?1.22±0.14?0.81±0.12?D組1.04±0.11?1.23±0.15?0.28±0.13 F值5.3907.68912.642 P值0.0080.0020.000

        圖2 HepG2細(xì)胞ABCA1 mRNA的表達(dá)

        圖3 各組ABCA1與GAPDH比值比較 (±s)

        圖4 HepG2細(xì)胞ABCG1 mRNA的表達(dá)

        圖5 各組ABCG1與GAPDH比值比較 (±s)

        圖6 HepG2細(xì)胞SR-BI mRNA的表達(dá)

        圖7 各組SR-BI與GAPDH比值比較 (±s)

        3 討論

        高脂血癥是指血漿TC或/和甘油三脂(Triglyceride, TG)的異常增高,其是公認(rèn)的AS發(fā)生、發(fā)展最重要的原因,AS病變中脂質(zhì)源于血漿脂蛋白的浸潤(rùn),主要為FC、膽固醇脂(cholesterol ester, CE),其次為T(mén)G、磷脂及載脂蛋白[5]。過(guò)多的脂質(zhì)沉積在動(dòng)脈膜內(nèi),是局部形成隆起的病灶,繼而內(nèi)膜纖維結(jié)締組織增生,將其圍起、固定,形成粥樣斑塊。流行病學(xué)調(diào)查證明,AS的嚴(yán)重程度隨血漿膽固醇水平的升高呈線性加重[5]。

        膽固醇外流與多個(gè)受體或蛋白參與密切相關(guān)[6]。當(dāng)體內(nèi)膽固醇過(guò)多時(shí),可通過(guò)上調(diào)ABCA1、ABCG1和SR-BI,增加肝臟膽固醇向膽汁外流[7]。ABCA1、ABCG1和SR-BI是介導(dǎo)細(xì)胞膽固醇外流的重要調(diào)節(jié)蛋白,對(duì)調(diào)節(jié)膽固醇水平起著重要作用[8-10]。ABCA1參與膽固醇外流的最初始的階段,介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)FC結(jié)合到載脂蛋白apoA-I上形成pre-βHDL,接著在卵磷脂-膽固醇脂?;D(zhuǎn)移酶(lecithin-cholesterol acyltransferase, LCAT)作用下將結(jié)合的FC酯化成CE,從而形成成熟的高密度脂蛋白(High density lipoprotein, HDL)[11]。成熟的HDL在ABCG1介導(dǎo)下繼續(xù)結(jié)合FC,最終形成富含脂質(zhì)的HDL[12]。富含脂質(zhì)的HDL轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇有2條路徑:一條是在CETP介導(dǎo)下將自身CE和極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein, VLDL)中的TG進(jìn)行交換,使VLDL顆粒逐漸變小,密度逐漸增加,最終轉(zhuǎn)變成低密度脂蛋白(low-density lipoprotein, LDL),進(jìn)而被肝細(xì)胞上的LDL受體識(shí)別而入肝,并在肝臟將CE解離出來(lái)[13]。繼而又從CE中將FC分解出來(lái),這一部分FC經(jīng)肝細(xì)胞上ABCA1介導(dǎo)再次進(jìn)入血液循環(huán);另一條是富含脂質(zhì)的HDL直接被肝細(xì)胞上的HDL受體SR-BI選擇性識(shí)別并介導(dǎo)入肝,肝臟將CE解離出來(lái),最終CE中膽固醇轉(zhuǎn)化為糞甾醇類(lèi)和膽汁酸后外排到膽汁[11]。ABCA1在肝細(xì)胞和外周組織細(xì)胞都有大量表達(dá),ABCG1主要表達(dá)在外周組織細(xì)胞,SR-BI主要表達(dá)在肝組織細(xì)胞[14-16]。ABCA1使肝細(xì)胞和外周組織細(xì)胞膽固醇流出至apoA-I形成HDL,ABCG1使外周組織細(xì)胞膽固醇流出至HDL形成富含脂質(zhì)的HDL,增加ABCA1或ABCG1的表達(dá)能使肝細(xì)胞和周?chē)M織細(xì)胞流出到HDL的膽固醇增加,降低膽固醇的含量。增加SR-BI表達(dá)后,增加其介導(dǎo)HDL流向肝臟同時(shí),也使膽固醇主要以HDL的形式轉(zhuǎn)移至肝,減少了LDL的生成,進(jìn)而降低LDL被氧化成ox-LDL的量。ABCA1、ABCG1和SR-BI是一個(gè)正性調(diào)節(jié)劑,其高表達(dá)可促進(jìn)膽固醇外流,清除體內(nèi)過(guò)多的膽固醇[17-18]。

        ox-LDL是LDL經(jīng)氧化而成的,是觸發(fā)AS炎癥反應(yīng)引起AS的關(guān)鍵因子[19-20]。炎癥反應(yīng)貫穿AS的整個(gè)過(guò)程,與高膽固醇血癥共同構(gòu)成了AS的主要病因[21]。二苯乙烯苷能通過(guò)調(diào)脂、抗氧化、抗炎、舒張血管及增強(qiáng)免疫力等多靶點(diǎn)多環(huán)節(jié),多途徑發(fā)揮抗AS作 用[2-4]。有研究表明二苯乙烯苷降血脂的同時(shí)ox-LDL減少[22]。

        本實(shí)驗(yàn)以不同濃度的二苯乙烯苷處理高膽固醇HepG2細(xì)胞后,發(fā)現(xiàn)二苯乙烯苷確有降膽固醇的效果,與模型組相比,ABCG1、ABCA1和SR-BI mRNA表達(dá)水平均明顯上調(diào)。因此筆者認(rèn)為二苯乙烯苷可能是通過(guò)上調(diào)ABCG1、ABCA1和SR-BI的表達(dá),增加肝癌HepG2細(xì)胞膽固醇的外流,降低膽固醇的 含量。

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