林昶，李玉平，齊建彤，鄭曙光，朱璨，柴藝匯，徐昌君，王和生，楊長福

（貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550002）

何首烏為蓼科植物何首烏的干燥塊根，作為中醫(yī)常用的一味傳統(tǒng)中藥，在我國有著悠久的應(yīng)用歷史。現(xiàn)代研究表明，何首烏具有抗動脈粥樣硬化的作用[1]。該藥主要含3類有效成分：蒽醌類、二苯乙烯苷類及多糖類化合物。其中二苯乙烯苷有降血脂和抗動脈粥樣硬化（Atherosclerosis, AS）的作用，但其作用機(jī)制還不清楚[2-4]。本實(shí)驗(yàn)以肝癌HepG2細(xì)胞作為研究對象，采用氧化性低密度脂蛋白（oxidation low density lipoprotein, ox-LDL）制作高膽固醇細(xì)胞模型，二苯乙烯苷干預(yù)后觀察膽固醇含量的變化，以及ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1（ATP-binding cassette transporter A1, ABCA1）、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G1（ATP-binding cassette transporterG1, ABCG1）和B族I型清道夫受體（Scavenger reptor class B type I, SR-BI）mRNA表達(dá)水平的變化，初步探索二苯乙烯苷降膽固醇的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肝癌HepG2細(xì)胞（上海陸奧生物科技有限公司），0.25%胰蛋白酶（美國Gibco公司），青鏈霉素混合液（哈爾濱哈藥集團(tuán)制藥總廠），高糖DMEM（美國HyClone公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），總RNA提取試劑盒（日本TaKaRa公司MiniBEST Universal RNA Extraction Kit），cDNA鏈合成試劑盒（PrimeScriptTMRT reagent Kit with Gdna Eraser）、PCR酶（Premix TaqTM）、瓊脂糖及DNA Marker等購自寶生物工程（大連）有限公司，ox-LDL（北京索萊寶科技有限公司），膽固醇含量測定試劑盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司），DL5和00 DNA Marker（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司），油紅O染液（北京索萊寶科技有限公司），生工生物工程（上海）股份有限公司合成逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）擴(kuò)增引物。見表1。

1.2 儀器與設(shè)備

MSL-3020型全自動高壓滅菌鍋（日本三洋有限公司），BSC 1800-Ⅱ-A/B3型超凈工作臺（上海瑞仰凈化裝備有限公司），TS-100F型倒置相差顯微鏡（日本Nikon公司），Multiskan FC自動酶標(biāo)讀儀（美國Thermo公司），NKSY恒溫水浴鍋（江蘇諾基儀器有限公司），二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），微量加樣器（德國Eppendorf公司），D-37520臺式冷凍高速離心機(jī)（美國Thermo Fisher公司），JA2004N型電子天平（上海箐海儀器有限責(zé)任公司），SIM-F140AY6ICEMAKER型制冰機(jī)（日本三洋有限公司），ELIX/RIOS-20型反滲透純水系統(tǒng)（法國Millipore公司），總/游離膽固醇含量測定試劑盒（E1015/E1016）（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司），PCR擴(kuò)增儀（GeneAmp 9700型，美國ABI公司），凝膠圖像分析系統(tǒng)（GGM/D2，英國Syngene公司），超低溫冰箱（德國Eppendorf公司），Bio-Rad GEL DOC 2000凝膠成像系統(tǒng)（美國BIO-RAD公司），細(xì)胞培養(yǎng)瓶（美國Corning公司），6孔和96孔培養(yǎng)板（美國 Corning公司）。

表1 PT-PCR引物序列

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)HepG2細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于鏈霉素和青霉素終濃度為100 u/ml的含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，每2～3天細(xì)胞傳代1次。取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。

取HepG2細(xì)胞懸液，在顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/ml，將細(xì)胞懸液接種于25 cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)，1ml/瓶，用培養(yǎng)基補(bǔ)足至3.5 ml，在37℃、5%二氧化碳CO2環(huán)境下孵育24 h至細(xì)胞貼壁，棄培養(yǎng)基，用提前預(yù)冷的PBS沖洗2次，更換培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)分為正常組、模型組（ox-LDL 50 mg/L）、 A組（ox-LDL 50 mg/L+二苯乙烯苷250μmol/L）、B組 （ox-LDL 50 mg/L+二苯乙烯苷188μmol/L）、C組（ox-LDL 50 mg/L二苯乙烯苷125μmol/L）及D組（ox-LDL 50 mg/L+二苯乙烯苷62.5μmol/L）,每組培養(yǎng)3瓶，重復(fù)3次，換成相應(yīng)的培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48 h后。油紅O脂肪染色法觀察，測定各組細(xì)胞內(nèi)總膽固醇（total cholesterol, TC）、游離膽固醇（free cholesterol, FC）及培養(yǎng)基上清TC和FC。采用RTPCR檢測肝癌HepG2細(xì)胞ABCG1、ABCA1和SR-BI mRNA表達(dá)水平的變化。

1.3.2 細(xì)胞變化按照油紅O脂肪染色試劑盒說明書進(jìn)行染色。吸去培養(yǎng)基，PBS清洗貼壁的細(xì)胞3次，ORO Fixative固定10 min，吸去固定液并干燥，ORO Stain液染15 min，加入適量60%異丙醇漂洗30 s并用流水沖洗，蘇木精復(fù)染2 min，ORO Buffer染1 min，流水沖洗晾干后鏡下觀察結(jié)果。

1.3.3 膽固醇測定室溫下2 000 r/min離心5 min后，取各組細(xì)胞沉淀和培養(yǎng)基，沉淀需用PBS洗2次后以1×106個(gè)細(xì)胞加0.1 ml試劑盒配備的裂解液混勻，靜置10 min后取上清進(jìn)行膽固醇測定。用E1015試劑盒和E1016檢測沉淀和培養(yǎng)基中TC、FC。取適量上清用BCA法蛋白定量試劑盒（#p1511）測定蛋白濃度，以每毫克蛋白濃度校正上清TC、FC含量，校正上清膽固醇=上清總蛋白/FC濃度×蛋白濃度。應(yīng)用膽固醇的外流率=培養(yǎng)基TC/（培養(yǎng)基TC+細(xì)胞內(nèi)TC）的方式計(jì)算膽固醇的外流率。

1.3.4 總RNA提取及RT-PCR擴(kuò)增按購買的RNA提取試劑盒說明書和cDNA合成試劑盒的方法進(jìn)行總RNA提取并合成cDNA鏈，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，58℃（GAPDH）、60℃（ABCA1、ABCG1）、62℃（SR-BI）退火30 s，72℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸10 min。取5μl產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，用BioRad凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照記錄，最后用GAPDH灰度值對目的基因進(jìn)行矯正并采用Quantity One軟件分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 二苯乙烯苷在高膽固醇狀態(tài)下對肝癌HepG2細(xì)胞內(nèi)膽固醇代謝的影響

各組膽固醇情況比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；正常組、A、B、C和D組細(xì)胞內(nèi)TC、FC含量均低于模型組（P ＜0.05），同時(shí)A、B、C和D組上清TC較模型組升高（P ＜0.05），B、C組上清FC較模型組升高（P ＜0.05）。二苯乙烯苷能夠減少HepG2細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量，增加膽固醇外流率（P ＜0.05），其中二苯乙烯苷濃度為125μmol/L時(shí)達(dá)最高值（t =10.094，P =0.000）。見表2和圖1。

表2 各組膽固醇情況比較 （±s）

表2 各組膽固醇情況比較 （±s）

注：?與模型組比較，P ＜0.05

組別細(xì)胞內(nèi)TC/（mmol/L）細(xì)胞內(nèi)FC/（mmol/L）上清TC/（mmol/L）上清FC/（mmol/L）膽固醇外流率/%正常組33.49±0.99?17.21±1.78?111.43±6.49?85.52±1.44?76.77±1.55?模型組120.42±1.4546.15±1.83139.21±4.9789.29±1.4453.59±0.76 A組43.91±1.42?25.84±1.32?177.61±6.49?88.98±2.0680.16±0.66?B組75.99±2.85?34.98±1.32?180.87±8.65?94.64±1.13?70.39±0.79?C組37.33±2.18?23.56±1.32?198.85±7.79?89.92±1.13?84.12±0.62?D組43.91±1.42?27.36±2.02?182.51±7.08?87.71±1.5880.59±0.59?F值1 015.091116.23765.97112.269468.170 P值0.0000.0000.0000.0000.000

圖1 油紅O脂肪染色結(jié)果 （×400）

2.2 不同濃度二苯乙烯苷對肝癌HepG2細(xì)胞ABCA1、ABCG1和SR-BI mRNA表達(dá)的影響

各組ABCA1、ABCG1和SR-BI mRNA表達(dá)水平比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。模型組可見各基因條帶較細(xì)，較弱，進(jìn)一步兩兩比較顯示，模型組細(xì)胞ABCA1 mRNA表達(dá)水平較正常組下降（P ＜0.05）。A、B、C和D組ABCA1、ABCG1表達(dá)水平較模型組升高（P ＜0.05），A、B和C組SR-BI表達(dá)水平較模型組升高（P ＜0.05），A組與B組ABCA1、ABCG1及SR-BI mRNA表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t =1.586、0.221和0.372，P =0.139、0.829和0.716）。見表3和圖2～7。

表3 各組ABCA1、ABCG1和SR-BI mRNA表達(dá)水平 比較 （±s）

表3 各組ABCA1、ABCG1和SR-BI mRNA表達(dá)水平 比較 （±s）

注：?與模型組比較，P ＜0.05

組別ABCA1ABCG1SR-BI正常組1.13±0.11?1.40±0.14?0.76±0.12?模型組0.80±0.110.89±0.130.35±0.12 A組1.24±0.11?1.49±0.13?0.81±0.12?B組1.10±0.11?1.46±0.14?0.84±0.14?C組1.07±0.11?1.22±0.14?0.81±0.12?D組1.04±0.11?1.23±0.15?0.28±0.13 F值5.3907.68912.642 P值0.0080.0020.000

圖2 HepG2細(xì)胞ABCA1 mRNA的表達(dá)

圖3 各組ABCA1與GAPDH比值比較 （±s）

圖4 HepG2細(xì)胞ABCG1 mRNA的表達(dá)

圖5 各組ABCG1與GAPDH比值比較 （±s）

圖6 HepG2細(xì)胞SR-BI mRNA的表達(dá)

圖7 各組SR-BI與GAPDH比值比較 （±s）

3 討論

高脂血癥是指血漿TC或/和甘油三脂（Triglyceride, TG）的異常增高，其是公認(rèn)的AS發(fā)生、發(fā)展最重要的原因，AS病變中脂質(zhì)源于血漿脂蛋白的浸潤，主要為FC、膽固醇脂（cholesterol ester, CE），其次為TG、磷脂及載脂蛋白[5]。過多的脂質(zhì)沉積在動脈膜內(nèi)，是局部形成隆起的病灶，繼而內(nèi)膜纖維結(jié)締組織增生，將其圍起、固定，形成粥樣斑塊。流行病學(xué)調(diào)查證明，AS的嚴(yán)重程度隨血漿膽固醇水平的升高呈線性加重[5]。

膽固醇外流與多個(gè)受體或蛋白參與密切相關(guān)[6]。當(dāng)體內(nèi)膽固醇過多時(shí)，可通過上調(diào)ABCA1、ABCG1和SR-BI，增加肝臟膽固醇向膽汁外流[7]。ABCA1、ABCG1和SR-BI是介導(dǎo)細(xì)胞膽固醇外流的重要調(diào)節(jié)蛋白，對調(diào)節(jié)膽固醇水平起著重要作用[8-10]。ABCA1參與膽固醇外流的最初始的階段，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)FC結(jié)合到載脂蛋白apoA-I上形成pre-βHDL，接著在卵磷脂-膽固醇脂?；D(zhuǎn)移酶（lecithin-cholesterol acyltransferase, LCAT）作用下將結(jié)合的FC酯化成CE，從而形成成熟的高密度脂蛋白（High density lipoprotein, HDL）[11]。成熟的HDL在ABCG1介導(dǎo)下繼續(xù)結(jié)合FC，最終形成富含脂質(zhì)的HDL[12]。富含脂質(zhì)的HDL轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇有2條路徑：一條是在CETP介導(dǎo)下將自身CE和極低密度脂蛋白（very low density lipoprotein, VLDL）中的TG進(jìn)行交換，使VLDL顆粒逐漸變小，密度逐漸增加，最終轉(zhuǎn)變成低密度脂蛋白（low-density lipoprotein, LDL），進(jìn)而被肝細(xì)胞上的LDL受體識別而入肝，并在肝臟將CE解離出來[13]。繼而又從CE中將FC分解出來，這一部分FC經(jīng)肝細(xì)胞上ABCA1介導(dǎo)再次進(jìn)入血液循環(huán)；另一條是富含脂質(zhì)的HDL直接被肝細(xì)胞上的HDL受體SR-BI選擇性識別并介導(dǎo)入肝，肝臟將CE解離出來，最終CE中膽固醇轉(zhuǎn)化為糞甾醇類和膽汁酸后外排到膽汁[11]。ABCA1在肝細(xì)胞和外周組織細(xì)胞都有大量表達(dá)，ABCG1主要表達(dá)在外周組織細(xì)胞，SR-BI主要表達(dá)在肝組織細(xì)胞[14-16]。ABCA1使肝細(xì)胞和外周組織細(xì)胞膽固醇流出至apoA-I形成HDL，ABCG1使外周組織細(xì)胞膽固醇流出至HDL形成富含脂質(zhì)的HDL，增加ABCA1或ABCG1的表達(dá)能使肝細(xì)胞和周圍組織細(xì)胞流出到HDL的膽固醇增加，降低膽固醇的含量。增加SR-BI表達(dá)后，增加其介導(dǎo)HDL流向肝臟同時(shí)，也使膽固醇主要以HDL的形式轉(zhuǎn)移至肝，減少了LDL的生成，進(jìn)而降低LDL被氧化成ox-LDL的量。ABCA1、ABCG1和SR-BI是一個(gè)正性調(diào)節(jié)劑，其高表達(dá)可促進(jìn)膽固醇外流，清除體內(nèi)過多的膽固醇[17-18]。

ox-LDL是LDL經(jīng)氧化而成的，是觸發(fā)AS炎癥反應(yīng)引起AS的關(guān)鍵因子[19-20]。炎癥反應(yīng)貫穿AS的整個(gè)過程，與高膽固醇血癥共同構(gòu)成了AS的主要病因[21]。二苯乙烯苷能通過調(diào)脂、抗氧化、抗炎、舒張血管及增強(qiáng)免疫力等多靶點(diǎn)多環(huán)節(jié)，多途徑發(fā)揮抗AS作 用[2-4]。有研究表明二苯乙烯苷降血脂的同時(shí)ox-LDL減少[22]。

本實(shí)驗(yàn)以不同濃度的二苯乙烯苷處理高膽固醇HepG2細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)二苯乙烯苷確有降膽固醇的效果，與模型組相比，ABCG1、ABCA1和SR-BI mRNA表達(dá)水平均明顯上調(diào)。因此筆者認(rèn)為二苯乙烯苷可能是通過上調(diào)ABCG1、ABCA1和SR-BI的表達(dá)，增加肝癌HepG2細(xì)胞膽固醇的外流，降低膽固醇的 含量。