徐鵬 王宏 涂燃冉 劉群恩 吳瑋勛 傅秀民 曹立勇 沈希宏

利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)定向改良水稻稻瘟病抗性

徐鵬 王宏 涂燃冉 劉群恩 吳瑋勛 傅秀民 曹立勇 沈希宏*

(中國水稻研究所/浙江省超級稻研究重點實驗室/水稻生物學(xué)國家重點實驗室, 杭州 311401;*通訊聯(lián)系人, E-mail: xihongshen@126.com)

【】CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)是作物遺傳改良的有效工具。本研究通過對水稻、和稻瘟病相關(guān)基因進(jìn)行定點編輯，以期獲得能夠穩(wěn)定遺傳的抗稻瘟病水稻材料。【】利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，以、和為靶基因，構(gòu)建共編輯載體pC1300-2×35S::Cas9-g-g-g，用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化長粒粳稻恢復(fù)系L1014，篩選獲得穩(wěn)定遺傳的純合突變體用于稻瘟病抗性鑒定。在T0代轉(zhuǎn)基因株系中，、和突變頻率分別為75%、85%和65%，突變基因型多為雙等位突變。篩選到的不含T-DNA成分的T1代能夠穩(wěn)定遺傳給T2代，并從中獲得單突變純合株系及、和的三突變純合株系。稻瘟病抗性鑒定結(jié)果表明，與野生型相比，突變株系的抗性顯著提高。同時，接種后純合突變體株系內(nèi)水楊酸、茉莉酸和乙烯等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因的表達(dá)量均上調(diào)。據(jù)此，我們推測純合突變株系對稻瘟病的抗性增強(qiáng)可能與其對稻瘟病菌的響應(yīng)被激活有關(guān)。利用CRISPR/Cas9技術(shù)獲得了能夠穩(wěn)定遺傳和具有較高稻瘟病抗性的純合突變株系，為水稻稻瘟病抗性改良提供了良好的材料。

水稻；CRISPR/Cas9；；；；稻瘟病抗性

水稻是世界上食用人口最多的農(nóng)作物。水稻產(chǎn)量每年都會受制于稻瘟病的暴發(fā)，稻瘟病嚴(yán)重時甚至導(dǎo)致顆粒無收，制約了水稻生產(chǎn)的發(fā)展。因此，提高稻瘟病抗性以減少水稻產(chǎn)量損失對于緩解日益增加的世界人口壓力顯得尤為重要[1]，在生產(chǎn)實踐中常使用化學(xué)農(nóng)藥和抗性品種來控制稻瘟病的發(fā)生[2]，但兩者的弊端日益顯現(xiàn)。一方面，農(nóng)藥的使用，既污染了環(huán)境又增加了生產(chǎn)成本；另一方面，水稻稻瘟病是由子囊菌[(Hebert) Barr，無性世代為(Cooke) Sacc.]引起的真菌性病害，且稻瘟菌生理小種具有高度變異的潛力，其新基因型的產(chǎn)生勢必降低了對水稻品種中抗性基因的敏感度[2]，田間優(yōu)勢生理小種出現(xiàn)，優(yōu)良抗性品種往往種植3~5年后其抗性會逐漸喪失[3]。在水稻育種上，結(jié)合分子標(biāo)記輔助技術(shù)，通過雜交、回交方式能夠?qū)⒍鄠€抗性基因聚合到同一品種中來彌補(bǔ)單一抗性基因抗性的弱化，但該育種過程周期較長，在將目標(biāo)基因?qū)霑r難以避免連鎖累贅，造成育種效率較低。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)[4-7]是近年來發(fā)展較為迅速、操作簡便及成本低而被廣泛應(yīng)用的基因編輯技術(shù)。該技術(shù)原理是借助gRNA與目標(biāo)序列的特異性識別，引導(dǎo)Cas9核酸酶在靶位點切割DNA使之雙鏈斷裂[8]，進(jìn)而激發(fā)胞內(nèi)DNA修復(fù)系統(tǒng)進(jìn)行同源重組和非同源重組修復(fù)時引起的堿基特異突變（堿基插入、缺失和替換）[7]。近年來，利用該系統(tǒng)已經(jīng)對水稻[9-12]、擬南芥[12-14]、小麥[10,12,15-16]等不同物種進(jìn)行了相關(guān)性狀的遺傳改良。Xie等[4]通過定向編輯水稻基因來改良水稻對病原菌的抗性；Shen等[17]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)同時敲除8個水稻性狀相關(guān)基因，獲得了眾多不同基因組合的突變體；Fei等[18]通過定向基因降低直鏈淀粉含量來改良稻米品質(zhì)。CRISPR/Cas9技術(shù)能夠在育種過程中迅速得到安全、穩(wěn)定遺傳的純和突變，從而在植物基因組編輯中得到廣泛的應(yīng)用。

前人研究表明，是一個隱性抗稻瘟基因位點[19]，產(chǎn)物富含脯氨酸，包含重金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域和蛋白互作結(jié)構(gòu)域，其抗性的產(chǎn)生是抗性品種的基因在富脯氨酸區(qū)分別有21 bp和48 bp的缺失[20]。是一個AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子，受稻瘟病菌誘導(dǎo)而負(fù)調(diào)控稻瘟病菌的抗性[21]?；蚓幋a928個氨基酸，其抗感差異的產(chǎn)生是由于第918位的丙氨酸到絲氨酸的變化[22]，且基因介導(dǎo)的抗性必須有(t)的特異性信號識別發(fā)揮作用[23]。本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對長粒粳稻恢復(fù)系L1014中、和為靶基因進(jìn)行定點編輯，進(jìn)而獲得有利用價值的純合突變體，為水稻稻瘟病抗性育種提供材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與載體

轉(zhuǎn)基因受體材料長粒粳稻恢復(fù)系L1014及其T0轉(zhuǎn)基因植株于2017年夏季種植在中國水稻研究所轉(zhuǎn)基因試驗基地，常規(guī)水肥管理，T1植株于冬季種植在溫室。表達(dá)載體pC1300-Cas9和SK-gRNA中間載體由中國水稻研究所王克劍實驗室提供。

1.2 gRNA靶位點設(shè)計

利用CRISPR-P網(wǎng)站(http://cbi.hzau.edu.cn/cgi- bin/CRISPR)進(jìn)行g(shù)RNA靶位點的設(shè)計，選擇得分較高且靠近ATG起始位點的引物序列，分在和的第1外顯子上設(shè)計19 bp的靶位點序列且其PAM序列為NGG(圖1)。其中，3個靶位點的設(shè)計都靠近ATG起始密碼子，以便更容易造成目標(biāo)基因的功能喪失。最后利用NCBI對水稻基因組進(jìn)行BLAST來分析確認(rèn)靶位點的特異性。

1.3 CRISPR/Cas9表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)靶位點序列，分別合成引物-g-F/- g-R、-g-F/-g-R和-g-F-g-R (表1)，然后等量混合變性退火形成具有黏性末端的片段。利用Ⅰ(Ferment公司)酶切SK-gRNA中間載體，用T4連接酶將、和接頭和被Ⅰ酶切回收的SK-gRNA線性載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，通過測序(杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司)挑選出正確的連接載體。分別用Ⅰ/Ⅰ、Ⅰ/Ⅰ和Ⅰ/Ⅱ酶切SK-gRNA-、SK-gRNA-和SK-gRNA-三個中間載體獲得目的片段，同時用Ⅰ/HⅠ酶切pC1300- Cas9載體，再利用T4連接酶連接酶切產(chǎn)物構(gòu)建成pC1300-2×35S::Cas9-g-g-g表達(dá)載體，通過測序確定正確的表達(dá)載體(圖2)，最終利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化受體材料獲得轉(zhuǎn)基因T0植株。

帶下劃線的字母為起始密碼子，加粗字母為PAM序列。

Fig. 1. Schematic diagram of the targeted sites inand.

表1 本研究所用引物

圖2 表達(dá)載體構(gòu)建流程

Fig. 2. Flow diagram of the expression vector construction.

1.4 T0代陽性株的獲得及靶位點檢測

用農(nóng)桿菌株轉(zhuǎn)化受體材料長粒粳稻L1014獲得T0植株。剪取T0植株葉片利用CTAB方法提取基因組DNA。分別在、和靶序列兩側(cè)設(shè)計擴(kuò)增引物(表1)來擴(kuò)增T0陽性植株的目的條帶，將PCR產(chǎn)物送杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序，以L1014基因組序列作為參照。測序出現(xiàn)單峰則為野生型或純合突變，再通過與野生型序列比對確定；測序出現(xiàn)雙峰，利用在線軟件DSDecode進(jìn)行序列解碼。

1.5 T1代無轉(zhuǎn)基因成分篩選

利用載體特異引物對F/R和Cas9F/Cas9-R擴(kuò)增突變植株基因組序列，兩對引物均擴(kuò)增不出條帶的為無轉(zhuǎn)基因成分的突變植株。

1.6 稻瘟病菌的培養(yǎng)及孢子液的配制

在超凈工作臺內(nèi)將從?20℃冰箱取出的帶有稻瘟菌生理小種18-6-5(本實驗室保存)的紙片放置在燕麥培養(yǎng)基上，把培養(yǎng)基倒置放進(jìn)霉菌培養(yǎng)箱，25℃~27℃下黑暗培養(yǎng)至菌絲長滿培養(yǎng)皿，用滅菌的棉簽刮掉菌絲，滅菌水清洗凈菌絲后室溫晾干，然后在培養(yǎng)皿上蓋兩層已滅菌的紗布，蓋緊培養(yǎng)皿，25℃~27℃下光照培養(yǎng)至大量分生孢子產(chǎn)生。

用0.02%的吐溫20洗脫培養(yǎng)好的稻瘟菌分生孢子(可將洗脫的孢子液倒入同一菌種的平板繼續(xù)洗，如此洗脫2~3次)，用滅菌的棉簽輕輕刮下稻瘟菌，然后用滅菌的兩層紗布過濾得到孢子收集液。將孢子液混勻后，在血球計數(shù)板上計數(shù)，把孢子懸浮液調(diào)至2×105個/mL（在10×10倍視野下孢子數(shù)為20~30個）用于稻瘟菌接種備用[20]。

1.7 稻瘟菌噴霧接種

接種前用0.02%的吐溫洗脫液潤洗噴霧瓶，將培養(yǎng)好的水稻幼苗(播種后兩周)放進(jìn)透明的收納箱內(nèi)，取配制好的孢子溶液斜向上噴向空中使之均勻落在水稻葉片上，盡量使每片葉片上形成霧化的小水滴，噴完后立即用保鮮膜封口并蓋上蓋子。放置于培養(yǎng)箱，保持28℃恒溫，95%恒濕，黑暗培養(yǎng)24 h后恢復(fù)正常光照周期，每天對水稻苗進(jìn)行一次少量噴水以促進(jìn)發(fā)病，接種7 h后調(diào)查發(fā)病情況。以麗江新團(tuán)黑谷作為感病對照。

表2 對水稻防衛(wèi)相關(guān)基因進(jìn)行qRT-PCR分析所用的引物

1.8 接種后取樣及防衛(wèi)相關(guān)基因的表達(dá)量分析

在稻瘟菌接種后的0、12、24 h分別對野生型和突變株系進(jìn)行混合取樣。在各個取樣時間點對3次重復(fù)接種的幼苗隨機(jī)取樣5片左右(每個株系水稻幼苗的倒1葉)，迅速置于液氮中，?80℃下保存。

利用植物總RNA提取試劑盒(RNAprep pure Plant Kit)提取樣品總RNA，用反轉(zhuǎn)試劑盒(ReverTra Aceq PCR RT Master Mix with gDNA Remover，ToYoBo，日本)進(jìn)行第1鏈cDNA合成，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照說明書。熒光定量PCR(Quantitative Real-Time PCR, qRT-PCR)擴(kuò)增程序如下：95℃下預(yù)變性30 s；95℃下變性5 s，58℃下30 s，72℃下15 s，共35個循環(huán)，定量PCR引物見表2。以(登錄號為LOC_Os03g08020)作為內(nèi)參基因，用2???法進(jìn)行基因相對表達(dá)量的計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 T0轉(zhuǎn)基因陽性株的獲得

將攜帶3個靶點的表達(dá)載體pC1300-2×35S:: Cas9-g-g-g通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化受體材料L1014以獲取T0轉(zhuǎn)基因株系。用載體特異引物F/R和Cas9F/Cas9-R檢測轉(zhuǎn)基因苗中T-DNA區(qū)以篩選轉(zhuǎn)基因陽性株系。結(jié)果表明，21株T0轉(zhuǎn)基因苗中有20株陽性苗，陽性率達(dá)95.2%。

2.2 靶位點突變情況分析

為了分析L1014中、和的突變情況，用靶點檢測引物分別擴(kuò)增三個靶序列的上下游，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序分析。測序結(jié)果表明，有15株陽性苗在靶位點位置發(fā)生了突變，突變頻率為75%；有17株陽性苗在靶點發(fā)生突變，突變頻率為85%；有13株陽性苗在靶點發(fā)生突變，突變頻率為65%。其中，突變基因型包括純和突變、雙等位突變，突變類型包括堿基插入和缺失，以堿基插入為主(73.5%)；突變基因型包括純合突變、雜合突變和雙等位突變，突變類型包括堿基的插入、缺失和替換，其中以堿基缺失為主，突變頻率高達(dá)85.3%；突變基因型包括純合突變、雜合突變和雙等位突變，突變類型包括堿基的插入、缺失、替換及同時替換缺失(表3)。

2.3 無轉(zhuǎn)基因成分的純合突變株的獲得

為獲得純合突變植株且不含T-DNA轉(zhuǎn)基因成分，將T0代陽性株自交繁殖下一代構(gòu)成T1代突變?nèi)后w。提取T1代植株DNA樣品，用載體特異引物F/R和Cas9F/Cas9-R擴(kuò)增T1代突變體基因組序列，兩對引物不能同時擴(kuò)增出615 bp和600 bp的DNA片段的植株即不含轉(zhuǎn)基因成分的突變株(圖3為部分T1植株的鑒定)。結(jié)果篩選出2種單基因突變和1種和三基因突變不含有T-DNA成分，純合突變類型見圖4。利用靶點檢測引物分別擴(kuò)增無突變植株的靶位點上下游DNA序列。PCR產(chǎn)物測序表明，T1代突變體靶位點突變情況與T0代是一致的，說明這2種單基因突類型和1種和三基因突類型在剔除Cas9載體骨架后是能夠穩(wěn)定遺傳的。把以上三種純合突變體通過自交構(gòu)建T2代純合突變株系，分別命名為D2101、D2102和D0301。隨后對這三種純合突變系進(jìn)行接種鑒定。

表3 T0突變體突變基因型和突變類型頻率

M?DNA標(biāo)記; 1?雙蒸水; 2?野生型; 3?陽性對照; 4～24?T1突變單株; P1?引物Hyg-F和Hyg-R; P2?引物Cas9-F和Cas9-R。

Fig. 3. Screening of transgenic-free mutant plantsby PCR in T1.

Fig. 4. Three mutation types of homozygotes in T2.

2.4 純合突變系編輯基因的qRT-PCR檢測及氨基酸序列分析

對上述純合D2101、D2102和D0301突變系的、和進(jìn)行qRT-PCR檢測，并分析其相對表達(dá)量(圖5)。在D2101和D2102單基因純合突變株系中的表達(dá)量相對于野生型無顯著變化，在D0301三基因純合突變株系的表達(dá)量卻顯著低于野生型。在D2101和D2102單基因純合突變株系中的表達(dá)量極顯著低于在野生型的表達(dá)，與野生型相比，在D0301三基因純合突變株系的表達(dá)量顯著降低。在D2101和D2102單基因純合突變株系中的表達(dá)量趨勢類似于，即在單基因突變株系中的表達(dá)量與野生型相比沒有顯著的改變，而在D0301三基因純合突變株系中，其相對表達(dá)量極顯著低于野生型。說明、和三個基因在被Cas9系統(tǒng)靶向編輯后，其轉(zhuǎn)錄水平可能受到影響，RNA可能在體內(nèi)發(fā)生部分降解。

*和**分別表示野生型與純合突變體的差異達(dá)0.05和0.01顯著水平(t檢驗)。

Fig. 5. Expression analyses of,andin homozygous mutant plants.

A為D2101和D2102純合突變株系中Pi21氨基酸序列的比對；B, C和D分別為D0301純合突變株系中Pita、Pi21和ERF922的氨基酸序列比對。

Fig. 6.,andgeneamino acid sequences in homozygous mutant lines and the wild type.

同時，對D2101和D2102純合突變株系的基因及D0301純合突變株系的、和基因編碼蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對分析(圖6)。由于靶位點設(shè)計在目的基因ATG起始密碼子附近，經(jīng)過基因編輯后，靶位點序列出現(xiàn)堿基的插入和缺失，導(dǎo)致蛋白的翻譯提前終止，從而影響蛋白的完整性。表明基因編輯不但能最終影響蛋白的水平，對基因的轉(zhuǎn)錄水平可能也存在一定的影響。

2.5 純合突變株系的稻瘟病抗性鑒定

為了鑒定CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)創(chuàng)制的純合突變株系對稻瘟病菌的抗性，我們選擇單基因突變的兩種不同突變類型(D2101在第1外顯子有1 bp缺失，D2102在第1外顯子缺失4 bp)以及、和三基因突變的一種突變類型用來接種鑒定。對3種不同突變類型的T2代純和突變株系于苗期用噴霧法接種稻瘟菌生理小種18-6-5，接種7 d后對病斑葉片進(jìn)行拍照并統(tǒng)計病斑面積(圖7)。從圖中可以看出，野生型葉片侵染較為嚴(yán)重，有明顯的病斑并有所擴(kuò)散，而純和突變株的病斑明顯小于野生型，只是侵入葉片形成病斑而未進(jìn)一步擴(kuò)散。對病斑面積進(jìn)一步量化時，純合突變株系的相對病斑面積跟野生型存在顯著差異。以上結(jié)果表明，純合突變株系在一定程度上提高了對稻瘟菌生理小種18-6-5的抗性，但是否對其他稻瘟菌生理小種產(chǎn)生抗性，仍需進(jìn)一步的接種鑒定。

2.5 基因編輯株系的防衛(wèi)相關(guān)基因表達(dá)量分析

植物響應(yīng)病原菌侵入時，體內(nèi)會激發(fā)一系列病程相關(guān)基因的表達(dá)來抵御病原菌的擴(kuò)散。野生型和純合突變株系的防衛(wèi)相關(guān)基因的差異表達(dá)結(jié)果如圖8和圖9。本研究對SA合成及信號傳導(dǎo)途徑中的、與，JA合成相關(guān)基因，乙烯應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子等基因進(jìn)行突變株系的表達(dá)差異分析。D2101突變株系的、、基因表達(dá)量在接種24 h后較野生型極顯著上調(diào)；D2102突變株系的、、及基因在接種12 h后的表達(dá)水平高于野生型，其中的表達(dá)量在接種12 h后是野生型的220倍；而的表達(dá)水平在D2102突變株系中接種12 h后較野生型顯著下降，接種24 h后卻顯著高于野生型。和在未接種時表達(dá)水平已顯著高于野生型，接種12 h和24 h后其表達(dá)水平持續(xù)上調(diào)；D0301突變株系的和基因表達(dá)模式類似于D2101和D2102單突突變株系，即在未接種時基因產(chǎn)物有所積累，在接種12 h和24 h后其表達(dá)產(chǎn)物持續(xù)積累。突變體本身的某些防衛(wèi)相關(guān)基因在基因編輯后被激發(fā)表達(dá)，另外，與野生型相比，在病原菌侵入水稻時，突變株系中的以上防衛(wèi)相關(guān)基因在接種初期(12 h和24 h)表達(dá)量更高。

A?純和突變株系和野生型在苗期的接種表型；B?野生型和純合突變株系的相對病斑面積(均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，n=3)。柱上不同小寫字母表示野生型與純合株的差異達(dá)0.01顯著水平(t檢驗)。LTH?麗江新團(tuán)黑谷；WT?L1014野生型；D2101和D2102?Pi21純合株系；D0301?Pita、Pi21和ERF922純合株系。

Fig. 7. Identification of homozygous mutant lines and the control varieties after inoculation.

*和**表示野生型和純合株系在接種后同一時期0.05和0.01水平上的差異。

Fig. 8. Relative expression levels of defense-related genes in the wild type (L1014, WT) and the homozygous mutant lines inoculated with(Mean±SE,=3).

*和**表示在接種后同一時期野生型與純合株系的差異達(dá)0.05和0.01顯著水平。

Fig. 9. Relative expression level of defense-related genes in the wild type(L1014) and the homozygous mutant line D0301, inoculated with(Mean±SE,=3).

3 討論

近年來，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用正方興未艾，研究者不斷對該系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化來提高編輯效率繼而擴(kuò)大其應(yīng)用范圍。由于該技術(shù)具有操作簡便、成本較低特點，目前被廣泛應(yīng)用于動物[24, 25]、植物[9, 12, 26, 27]和微生物[28]中。Shen[29]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功構(gòu)建了水稻的，和三基因表達(dá)載體，分析了基因編輯效率及三個基因的突變情況；隨后利用該系統(tǒng)同時編輯8個水稻相關(guān)性狀基因[17]，得到了豐富的突變株系。本研究也表明，該技術(shù)在水稻抗性品種改良上是較為有效的育種工具。

本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對長粒粳稻恢復(fù)系L1014進(jìn)行、和三個稻瘟病抗性相關(guān)基因的共編輯，以期得到具有利用價值的純合突變系。在T0代中和三基因的突變頻率分別為75%、85%和65%。突變類型以堿基插入為主(頻率為73.5%)，和突變類型以堿基缺失為主(頻率分別為85.3%和58.8%)，突變基因型以雙等位突變頻率最高(頻率分別為47.1%，58.8%和64.7%)。王芳權(quán)等[30]利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)編輯水稻基因的兩個靶位點，突變頻率分別為78.57%和92.86%，楊海河等[31]構(gòu)建的單突突變頻率為86.7%； Wang等[32]對進(jìn)行基因編輯，其突變類型多為堿基缺失且突變基因型也多為雙等位突變?yōu)橹?。本研究中的突變頻率和的突變情況跟前人研究結(jié)果基本一致。我們發(fā)現(xiàn)，的突變往往伴隨著和的突變，三個基因的突變與期望有所偏離，從而趨向于同時發(fā)生突變。因此，該研究中只得到單突和、和三突變這兩種基因型組合。

對獲得的兩種基因組合的純合突變株系進(jìn)行稻瘟病抗性鑒定，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)產(chǎn)生的單突株系和、和三突變株系在接種稻瘟菌后能夠表現(xiàn)出相應(yīng)的抗性。在對基因編輯純合株系的防衛(wèi)相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)行分析時，發(fā)現(xiàn)與野生型相比，突變株系的SA、JA和乙烯信號途徑被激活從而引發(fā)防衛(wèi)相關(guān)基因的高表達(dá)。SA合成相關(guān)基因在三突變純合系接種24 h后其表達(dá)量顯著上調(diào)，在單突變純合系中，表達(dá)量在接種12 h后有所下降，但在接種24 h后表達(dá)量顯著增高；SA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因在D2102單突變純合系和三突變純合系在接種12 h后，表達(dá)量迅速達(dá)到極顯著水平，而在D2101單突變純合系接種24 h后表達(dá)量才達(dá)到顯著水平；JA合成相關(guān)途徑基因的表達(dá)與在單突變純合系的表達(dá)模式類似，在三突變純合系接種12 h后表達(dá)水平顯著提高，而在接種24 h后表達(dá)水平又迅速降低。純合突變株系在未接種時和基因表達(dá)水平已顯著高于野生型，在接種后的12 h和24 h后表達(dá)更是持續(xù)積累。前人研究報道，基因編碼葡聚糖酶，能夠降解真菌細(xì)胞壁[33]，基因為乙烯應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子，與RACK1互作參與水稻先天免疫反應(yīng)[34]。這些基因在接種前后表達(dá)量的變化能夠促使植物快速的響應(yīng)和抵御病原菌的侵染和擴(kuò)散。是個顯性抗性基因，具有稻瘟病菌的生理小種特異性，其抗性由所介導(dǎo)[23]，而和介導(dǎo)的抗性屬于基礎(chǔ)抗性，具有抗譜廣和持續(xù)時間長的特點。本研究中、和三突變純合系也能產(chǎn)生相應(yīng)的抗性，可能是和介導(dǎo)的基礎(chǔ)抗性效應(yīng)在起主要作用。根據(jù)Zhao等[35]發(fā)現(xiàn)，不僅是發(fā)揮抗性功能所需，其本身也能對更多的生理小種產(chǎn)生抗性，包括識別的生理小種，植物長期進(jìn)化過程中產(chǎn)生多種抗性機(jī)制來適應(yīng)病原菌的侵染，、和三突純合系產(chǎn)生相應(yīng)的抗性也可能是功能喪失后，由來彌補(bǔ)病原菌入侵帶來的損害。

謝辭：感謝中國水稻研究所王克劍老師提供SK-gRNA中間載體和pC1300-Cas9表達(dá)載體。

[1] Liu J, Wang X, Mitchell T, Hu Y, Liu X, Dai L, Wang G L. Recent progress and understanding of the molecular mechanisms of the rice-interaction., 2010, 11(3): 419-427.

[2] Borrelli V, Brambilla V, Rogowsky P, Marocco A, Lanubile A. The enhancement of plant disease resistance using CRISPR/Cas9 technology., 2018, 9: 1245.

[3] Wilson R A, Talbot N J. Under pressure: investigating the biology of plant infection by., 2009, 7(3): 185-195.

[4] Xie K, Yang Y. RNA-guided genome editing in plants using a CRISPR-Cas system., 2013, 6(6): 1975-1983.

[5] Shan Q, Wang Y, Li J, Zhang Y, Chen K, Liang Z, Zhang K, Liu J, Xi J J, Qiu J L, Gao C. Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system., 2013, 31(8): 686-688.

[6] Cong L, Ran F A, Cox D, Lin S, Barretto R, Habib N, Hsu P D, Wu X, Jiang W, Marraffini L A, Zhang F. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems., 2013, 339(6121): 819-823

[7] Islam W. CRISPR-Cas9: An efficient tool for precise plant genome editing., 2018, 39: 47-52.

[8] Vriend L E M, Prakash R, Chen C, Vanoli F, Cavallo F, Zhang Y, Jasin M, Krawczyk P M. Distinct genetic control of homologous recombination repair of Cas9-induced double-strand breaks, nicks and paired nicks., 2016, 44(11): 5204-5217.

[9] Mao Y, Zhang H, Xu N, Zhang B, Gou F, Zhu J K. Application of the CRISPR-Cas system for efficient genome engineering in plants., 2013, 6(6): 2008-2011.

[10] Shan Q, Wang Y, Li J, Gao C. Genome editing in rice and wheat using the CRISPR/Cas system., 2014, 9(10): 2395-2410.

[11] Zhang J, Zhang H, Botella J R, Zhu J K. Generation of new glutinous rice by CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis of the Waxy gene in elite rice varieties. J, 2018, 60(5): 369-375.

[12] Jiang W, Zhou H, Bi H, Fromm M, Yang B Weeks D P. Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification in, tobacco, sorghum and rice., 2013, 41(20): e188.

[13] Fauser F, Schiml S, Puchta H. Both CRISPR/Cas-based nucleases and nickases can be used efficiently for genome engineering in., 2014, 79(2): 348-359.

[14] Jiang W, Yang B Weeks D P. Efficient CRISPR/Cas9- mediated gene editing in Arabidopsis thaliana and inheritance of modified genes in the T2and T3generations., 2014, 9(6): e99225.

[15] Wang Y, Cheng X, Shan Q, Zhang Y, Liu J, Gao C, Qiu J L. Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance to powdery mildew., 2014, 32(9): 947-951.

[16] Zhang Y, Bai Y, Wu G, Zou S, Chen Y, Gao C, Tang D. Simultaneous modification of three homologs of TaEDR1 by genome editing enhances powdery mildew resistance in wheat., 2017, 91(4): 714-724.

[17] Shen L, Hua Y, Fu Y, Li J, Liu Q, Jiao X, Xin G, Wang J, Wang X, Yan C, Wang K. Rapid generation of genetic diversity by multiplex CRISPR/Cas9 genome editing in rice., 2017, 60(5): 506-515.

[18] Fei Y Y, Yang J, Wang F Q, Fan F J, Li W Q, Wang J, Xu Y, Zhu J Y, Zhong W G. Production of two elite glutinous rice varieties by editinggene., 2019, 26(2): 118-124.

[19] Fukuoka S, Okuno K. QTL analysis and mapping of, a recessive gene for field resistance to rice blast in Japanese upland rice., 2001, 103(2-3): 185-190.

[20] Fukuoka S, Saka N, Koga H, Ono K, Shimizu T, Ebana K, Hayashi N, Takahashi A, Hirochika H, Okuno K, Yano M. Loss of function of a proline-containing protein confers durable disease resistance in rice., 2009, 325(5943): 998-1001.

[21] Liu D, Chen X, Liu J, Ye J, Guo Z. The rice ERF transcription factor OsERF922 negatively regulates resistance toand salt tolerance., 2012, 63(10): 3899-3911.

[22] Bryan G T, Wu K S, Farrall L, Jia Y, Hershey H P, McAdams S A, Faulk K N, Donaldson G K, Tarchini R, Valent B. A single amino acid difference distinguishes resistant and susceptible alleles of the rice blast resistance gene., 2000, 12(11): 2033-2046.

[23] Jia Y, Martin R. Identification of a new locus,, required for rice blast resistance gene-mediated resistance., 2008, 21(4): 396-403.

[24] Tu Z, Yang W, Yan S, Guo X, Li X. CRISPR/Cas9: A powerful genetic engineering tool for establishing large animal models of neurodegenerative diseases., 2015, 10: 35.

[25] Hruscha A, Krawitz P, Rechenberg A, Heinrich V, Hecht J, Haass C, Schmid B. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish., 2013, 140(24): 4982-4987.

[26] Cai Y, Chen L, Liu X, Guo C, Sun S, Wu C, Jiang B, Han T, Hou W. CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis of GmFT2a delays flowering time in soya bean., 2018, 16(1): 176-185.

[27] Yu Z, Chen Q, Chen W, Zhang X, Mei F, Zhang P, Zhao M, Wang X, Shi N, Jackson S, Hong Y. Multigene editing via CRISPR/Cas9 guided by a single-sgRNA seed in., 2018, 60(5): 376-381.

[28] Jako?iu?nas T, Rajkumar AS, Zhang J, Arsovska D, Rodriguez A, Jendresen C B, Skj?dt M L, Nielsen A T, Borodina I, Jensen M K, Keasling J D. CasEMBLR: Cas9-facilitated multiloci genomic integration of in vivo assembled DNA parts in., 2015, 4(11): 1226-1234.

[29] 沈蘭. 基于CRISPR/Cas9的水稻多基因編輯及其在育種中的應(yīng)用. 揚州: 揚州大學(xué), 2017.

Shen L. CRISPR/Cas9-mediated multiples genome editing in rice () and the application in rice breeding. Yangzhou: Yangzhou University, 2017. (in Chinese with English abstract)

[30] 王芳權(quán), 范方軍, 李文奇, 朱金燕, 王軍. 利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除水稻基因的效率分析. 中國水稻科學(xué), 2016, 30(5): 469-478.

Wang F Q, Fan F J, Li W Q, Zhu J Y, Wang J. Knock-out efficiency analysis ofgene using CRISPR/Cas9 in rice., 2016, 30(5): 469-478. (in Chinese with English abstract)

[31] 楊海河, 畢冬玲, 張玉, 鄒小維, 高曉慶, 袁正杰, 曲海艷, 何海燕, 瞿紹洪. 基于CRISPR/Cas9技術(shù)的水稻基因編輯材料的創(chuàng)制及稻瘟病抗性鑒定. 分子植物育種, 2017, 15(11): 4451-4465.

Yang H H, Bi D L, Zhang Y, Zou X W, Gao X Q, Yuan Z J, Qu H Y, He H Y, Qu S H. Generation of ricegene editing lines based on CRISPR/Cas9 technology and evaluation of their blast resistance., 2017, 15(11): 4451-4465.(in Chinese with English abstract)

[32] Wang F, Wang C, Liu P, Lei C, Hao W, Gao Y, Liu Y, Zhao K. Enhanced rice blast resistance by CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis of the ERF transcription factor gene., 2016, 11(4): e0154027.

[33] Zhang Y, Zhao J, Li Y, Yuan Z, He H, Yang H, Qu H, Ma C, Qu S. Transcriptome analysis highlights defense and signaling pathways mediated by ricegene with partial resistance to., 2016, 7: 1834.

[34] Wamaitha M J, Yamamoto R, Wong H L, Kawasaki T, Kawano Y, Shimamoto K.transcription factor contributes to rice innate immunity through its interaction with Receptor for Activated Kinase-C1(RACK1)., 2012, 5: 35.

[35] Zhao H, Wang X, Jia Y, Minkenberg B, Wheatley M, Fan J, Jia M H, Famoso A, Edwards J D, Wamishe Y, Valent B, Wang G, Yang Y. The rice blast resistance geneencodes an atypical protein required for broad-spectrum disease resistance., 2018, 9(1): 2039.

Orientation Improvement of Blast Resistance in Rice via CRISPR/Cas9 System

XU Peng, WANG Hong, TU Ranran, LIU Qunen, WU Weixun, FU Xiumin, CAO Liyong, SHEN Xihong*

(,;Corresponding author,:)

【】CRISPR/Cas9 gene editing is an effective biotechnology for crop genetic improvement. This study aims toeditandgenes forobtaining valuable and stable genetic materials with resistance to rice blast. 【】The target genesandwere selected for constructing the pC1300-2×35S::Cas9-g-g-gexpression vector by CRISPR/Cas9 gene editing technology, and transformed by-mediated method into long-grainricerestore lines L1014. Stable genetic mutant lines were selected and their resistance to rice blast was identified.【】 In the T0transgenic lines, the mutation rates ofandwere 75%, 85% and 65%, respectively, and most of the mutant lines are biallelic mutations.The homozygous mutation lines without T-DNA components within the screened T1were selected and transferred to T2stably. Evaluation analysis of resistance to rice blast suggested that the mutant lines showed significantly higher resistance tocompared with the wild type. The expression level of defense-related genes involved in signaling pathways of salicylic acid, jasmonic acid and ethylene metabolisms was up-regulated in the mutant lines compared to the wild type after inoculation of the physiological races of. Therefore, we hypothesized that the increased resistance of homozygous mutant lines to rice blast might be related to the activation of the response to. 【】The homozygous mutant lines with stable inheritance and high blast resistance were obtained by CRISPR/Cas9 system, which would provide ideal materials for improving blast resistance in rice.

rice; CRISPR/Cas9;blast resistance

Q755; S435.111.4+1; S511.034

A

1001-7216(2019)04-0313-10

10.16819/j.1001-7216.2019.9043

2019-04-10；

2019-05-24。

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程超級稻育種創(chuàng)新團(tuán)隊和水稻雜種優(yōu)勢研究機(jī)理研究創(chuàng)新團(tuán)隊資助項目(CAAS-ASTIP-2013-CNRRI)；轉(zhuǎn)基因重大專項(2016ZX08001-002)。