張 榮 劉紹能 馬繼征 丁佳媛 劉慧敏 張 玲 路迎冬

中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院 (北京， 100053)

肝纖維化是肝臟對(duì)各種慢性損傷的共同反應(yīng)，是各種慢性肝病共同病理過程。盡管經(jīng)過多年的研究，有效和安全地終止或逆轉(zhuǎn)纖維化的治療仍處于摸索階段。芪術(shù)顆粒在肝纖維化治療中取得一定療效，然而肝纖維化的發(fā)生機(jī)制中有多種細(xì)胞因子及多條細(xì)胞信號(hào)通路參與，其中整合素αVβ3-FAK-Ras/MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是肝纖維化激活的一條重要信號(hào)通路。本研究以芪術(shù)顆粒為研究對(duì)象，在明確其對(duì)肝纖維化有治療作用的基礎(chǔ)上[1,2]，從整合素αVβ3-FAK-Ras/MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路探討芪術(shù)顆?？估w維化的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar大鼠70只，雄性，清潔Ⅱ級(jí)，6周齡，體質(zhì)量180～200 g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。本院II級(jí)動(dòng)物房分籠飼養(yǎng)，飼以標(biāo)準(zhǔn)大鼠合成飼料，自由飲用大鼠專用無菌水，環(huán)境溫度(20±2)℃，相對(duì)濕度36%。

1.2 藥物與試劑 芪術(shù)顆粒：本院制劑室提供的中成藥(京藥制字Z20063189)，臨床用量6 g/次，2次/d，日總量12 g，動(dòng)物與人每公斤體重劑量折算系數(shù)是6.25(參考施新猷主編《現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)》)，折算大鼠用藥量為1.25 g/kg/d。復(fù)方鱉甲軟肝片(國(guó)藥準(zhǔn)字Z19991011，內(nèi)蒙古福瑞醫(yī)療科技股份有限公司生產(chǎn))功效軟堅(jiān)散結(jié)、化瘀解毒、益氣養(yǎng)血，用于慢性乙型肝炎肝纖維化以及早期肝硬化屬瘀血阻絡(luò)、氣血虧虛兼熱毒未盡證者，臨床用量2 g/次，3次/d，日總用量6 g，折算大鼠日用藥量為0.625 g/kg。四氯化碳(CCl4，分析純，北京化學(xué)試劑公司)，橄欖油(分析純，北京化學(xué)試劑公司)。臺(tái)盼藍(lán)染色試劑盒(Beyotime，C0011)；SE-1試劑(NOVUS，NB110-68095SS)；CD31試劑(Affinity，AF6191)；整合素ɑVβ3試劑(Abcam，ab52939)。

1.3 主要儀器 病理切片機(jī)(德國(guó)，LEICA)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(湘儀，TGL-16K)；電泳儀(君意，JY300C)；電泳槽(君意，JY-SPDT)；勻漿機(jī)(wiggens，D-130)；電轉(zhuǎn)芯(JUNYI，JY-ZY6)；電轉(zhuǎn)儀(六一，DYCP-40E)；酶標(biāo)儀(EMAXPLUS，E113783)；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析儀(TANON，TANON-5200)；生物倒置顯微鏡(OLYMPUS，IX71)；FACS流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司，C6)；臨界點(diǎn)干燥儀(Quorum,K850)；離子濺射儀(IXRF,MSP-2S)；掃描電子顯微鏡(Hitachi,SU8010)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 制備藥物血清 雄性Wistar大鼠50只，分為芪術(shù)顆粒高、中、低劑量組、對(duì)照組和正常組，每組10只。芪術(shù)顆粒中劑量組(簡(jiǎn)稱中劑量組)大鼠以1.25 g/kg劑量的芪術(shù)顆粒灌胃；芪術(shù)顆粒高劑量組(簡(jiǎn)稱高劑量組)大鼠以2.5 g/kg劑量芪術(shù)顆粒灌胃；芪術(shù)顆粒低劑量組(簡(jiǎn)稱低劑量組)大鼠以0.625 g/kg劑量芪術(shù)顆粒灌胃，對(duì)照組大鼠按0.625 g/kg劑量灌胃復(fù)方鱉甲軟肝片混懸液，均2次/d，連續(xù)5天，末次灌胃后1 h于超凈臺(tái)自心臟采血，收集的血液在4℃冰箱垂直靜置3 h，在4℃離心機(jī)離心3 000 rpm×30 min，后于超凈臺(tái)無菌條件下分離血清并于56℃水浴箱滅活30 min，滅活后用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，即制備成芪術(shù)顆粒高、中、低劑量組及對(duì)照組大鼠藥物血清。正常組大鼠用三蒸水灌胃大鼠，余處理均與上述4組相同，獲取不含藥物的血清。均室溫冷卻，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 肝纖維化大鼠模型構(gòu)建 另選雄性Wistar大鼠20只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)取14只用10%CCl4橄欖油溶液按3 ml/kg劑量腹腔注射而造模，2次/周。另6只大鼠不造模作為正常對(duì)照，兩種大鼠均每周稱體重1次，依體質(zhì)量調(diào)整造模大鼠給藥劑量，連續(xù)4周。然后從造模大鼠中隨機(jī)取2只處死，取肝臟行Masson染色，以驗(yàn)證肝纖維化造模是否成功。造模成功后，分別原位分離造模和正常大鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(LSECs)。

1.4.3 原位分離大鼠LSECs 麻醉處死造模和正常大鼠，消毒皮膚后迅速打開腹腔，顯露門靜脈和下腔靜脈；用無菌30G針頭插入門靜脈，同時(shí)剪破下腔靜脈；用含有0.5 mol/L EDTA 并且不含Ca2+和Mg2+的HBSS 灌注10 min，速度5 ml/min，然后用含有0.02%Ⅳ型膠原酶并且含有Ca2+和Mg2+的HBSS 灌注10 min，速度5 ml/min。灌注結(jié)束后，小心取下肝臟轉(zhuǎn)移至含有5%血清的DMEM 完全培養(yǎng)基中，無菌鑷子撕開肝包膜，使肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞、非實(shí)質(zhì)細(xì)胞流出。將收集到的細(xì)胞懸液50 g低速離心10 min，收集上清液，400 g離心10 min 收集沉淀，沉淀用DMEM 完全培養(yǎng)基重懸后小心滴加在含有50% percoll和25% percoll離心管中，900 g高速離心20 min(不帶剎車)后，在25% percoll和50% percoll之間可見明顯的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞條帶，小心將其吸出經(jīng)DMEM完全培養(yǎng)基重懸后離心洗去殘余的percoll液，將非實(shí)質(zhì)細(xì)胞懸液加入24孔板并置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20min，將未貼壁細(xì)胞懸液離心后用含有1%內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和含有5%血清的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(ECM)重懸后按照2×106/ml接種在鼠尾膠原包被的6孔板或96孔板中。在37℃，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分離出的LSECs經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色及流式細(xì)胞術(shù)鑒定。

1.4.4 LSECs處理 正常大鼠LSECs添加不含藥物的血清(簡(jiǎn)稱正常組)。肝纖維化大鼠LSECs分5種情況添加血清：①添加無藥物的血清(簡(jiǎn)稱模型組)；②添加低劑量芪術(shù)顆粒藥物血清(簡(jiǎn)稱低劑量組)；③添加中劑量芪術(shù)顆粒藥物血清(簡(jiǎn)稱中劑量組)；④添加高劑量芪術(shù)顆粒血清(簡(jiǎn)稱高劑量組)；⑤添加復(fù)方鱉甲軟肝片藥物血清(簡(jiǎn)稱對(duì)照組)。血清添加量均為10%，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后換液，培養(yǎng)48h后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

1.4.5 檢測(cè)指標(biāo)與方法 Western blot檢測(cè)整合素αVβ3、磷酸化FAK、Ras、磷酸化MAPK蛋白表達(dá)。收集細(xì)胞用含有蛋白酶抑制劑的裂解液(50 mol/L Tris-Cl pH 7.4, 1 mM EDTA pH 8.0, 250 mol/L NaCl, 1% Triton-X100)進(jìn)行裂解。蛋白裂解液濃度利用BCA法(Beyotime，P0011)進(jìn)行測(cè)量。10 μg細(xì)胞裂解液與5×樣品緩沖液(15 g SDS, 15.6 ml 2 M Tris pH 6.8, 57.5 g glycerol, 16.6 ml b-mercaptoethanol)混合后，將樣品上樣至10%聚丙烯酰胺凝膠中，SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上(Bio-Rad，No.162-0177)。用含0.1% Tween-20的4%脫脂牛奶進(jìn)行封閉后，加入抗體，4 ℃孵育過夜。用含0.1% Tween-20的PBS溶液將膜洗3遍后，加入含0.1% Tween-20的4%脫脂牛奶以及HRP二抗(Abcam, ab6721)在室溫條件下孵育2h。取出膜，在膜上滴加ECL顯影液(Bio-Rad，No.170-5060)并放入GelDoc成像系統(tǒng)(Bio-Rad)進(jìn)行拍照。ImageJ v1.8.0軟件進(jìn)行灰度分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 6組LSECs 整合素蛋白αVβ3、FAK、p-FAK、Ras、MAPK、p-MARK表達(dá)情況 見圖1。與正常組相比，其他5組LSECs整合素ɑVβ3蛋白水平均顯著升高，MAPK、FAK蛋白磷酸化水平亦均升高。與模型組相比，對(duì)照組LSECs αVβ3蛋白水平有所下降，MAPK、FAK蛋白磷酸化表達(dá)明顯被抑制，芪術(shù)顆粒高、中、低劑量組LSECs整合素αVβ3蛋白表達(dá)與模型組比較均有下降，MAPK、FAK蛋白磷酸化表達(dá)明顯被抑制。

圖1 6組LSECs整合素αVβ3、FAK、Ras-MAPK蛋白表達(dá)圖

2.2 6組LSECs整合素αVβ3、磷酸化FAK蛋白表達(dá) 見表1。

表1 6組LSECs整合素αVβ3、FAK磷酸化表達(dá)比較

2.3 6組LSECs Ras、MAPK磷酸化蛋白表達(dá)情況 見表2

表2 6組LSECs Ras、MAPK磷酸化蛋白比較

3 討論

肝纖維化主要表現(xiàn)為肝組織中細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成與降解的動(dòng)態(tài)機(jī)制失衡，最終導(dǎo)致ECM在肝內(nèi)病理性沉積。肝星狀細(xì)胞(HSC)是肝臟損傷后最主要的致纖維化細(xì)胞，在各種細(xì)胞因子的作用下，活化的HSC通過其自旁、分泌作用，不斷地轉(zhuǎn)化為成肌纖維細(xì)胞，產(chǎn)生大量的細(xì)胞外基質(zhì)分子，而其降解減少，最終導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生[3]。HSC增殖及細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化、ECM合成增多并沉積同時(shí)伴新生血管是進(jìn)展性肝纖維化修復(fù)重建中突出的病理表現(xiàn)，在這過程中整合素發(fā)揮重要作用。

整合素是一類細(xì)胞黏附分子，主要介導(dǎo)細(xì)胞與ECM、細(xì)胞與細(xì)胞間的黏附和細(xì)胞內(nèi)外的信息傳遞，調(diào)節(jié)細(xì)胞增值、生長(zhǎng)及分化等。整合素αVβ3是多種ECM的受體，主要傳遞與細(xì)胞增殖、分化、運(yùn)動(dòng)、分布、定居、生存或凋亡等有關(guān)的細(xì)胞信號(hào)。正常肝組織很少表達(dá)整合素αVβ3，但在HSC活化和血管新生時(shí)表達(dá)上調(diào)[4]。近來研究表明在細(xì)胞因子刺激下，整合素αVβ3表達(dá)上調(diào)即是實(shí)質(zhì)損傷后血管重建和疤痕修復(fù)反應(yīng)中關(guān)鍵受體分子，也是HSC活化和血管新生的共同生物標(biāo)志[5,6]。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組LSECs整合素αVβ3表達(dá)明顯增加，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致。整合素可通過激活與整合素胞質(zhì)相關(guān)的信號(hào)蛋白來啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[7]，黏著斑激酶(FAK)是一種重要的整合素相關(guān)酪氨酸激酶信號(hào)蛋白。FAK是由整合素和ECM相互作用引發(fā)的信號(hào)級(jí)聯(lián)所必需的[8]，與基質(zhì)結(jié)合可導(dǎo)致整合素聚類和酪氨酸397位點(diǎn)的FAK自磷酸化，激活的FAK可以結(jié)合并磷酸化其他下游信號(hào)分子，最終影響細(xì)胞行為。在肝纖維化過程中，LSECs中整合素水平增加，F(xiàn)AK是整合素信號(hào)通路中重要的細(xì)胞因子，通過調(diào)節(jié)下游Ras-MAPK途徑，參與血管生成[9]，且發(fā)揮促進(jìn)纖維化的作用，其中藥物抑制FAK可起到抗纖維化治療作用[10]。本研究結(jié)果提示芪術(shù)顆?？垢卫w維化作用與它對(duì)整合素αVβ3-FAK-Ras/MAPK信號(hào)通路的調(diào)控有關(guān)。

在以往的臨床中，我們發(fā)現(xiàn)慢性肝病-肝纖維化-肝硬化這一動(dòng)態(tài)過程與氣滯-入絡(luò)-血瘀動(dòng)態(tài)變化非常相似，故可按絡(luò)脈理論認(rèn)識(shí)肝纖維化[11,12]。由此提出肝纖維化的病機(jī)關(guān)鍵是在毒損肝絡(luò)的基礎(chǔ)上形成“毒瘀肝絡(luò)”。芪術(shù)顆粒由黃芪、莪術(shù)、白術(shù)、柴胡、茵陳、丹參、桃仁等藥物組成，方中黃芪有益氣補(bǔ)虛之功；莪術(shù)有破血行氣，消積止痛之功，取其破血之力以消散肝中之瘀結(jié)；白術(shù)健脾以助黃芪益氣；丹參、桃仁助莪術(shù)活血化瘀；茵陳等清熱利濕解毒；柴胡等疏肝解郁，理氣通絡(luò)。本方具有益氣健脾、化瘀通絡(luò)、利濕解毒之功效，有較好的抗肝纖維化的作用[1,2]。

我們前期研究證實(shí)芪術(shù)顆粒可通過調(diào)控Angs/Tie-2 mRNA的表達(dá)減輕肝竇毛細(xì)血管化，影響肝纖維化的形成[13]。又有研究提示，Angs/Tie-2介導(dǎo)的整合素αVβ3信號(hào)通路在其中發(fā)揮著重要作用[14]。本研究結(jié)果提示，芪術(shù)顆粒藥物血清對(duì)LSECs整合素αVβ3及其下游的FAK-Ras/MAPK蛋白表達(dá)有下調(diào)作用，說明該藥減少微血管增生與其抑制LSECs整合素αVβ3-FAK-Ras/MAPK信號(hào)通路有關(guān)。