劉兆書 劉元元 秦玉杰 畢權(quán) 王賽賽 祝建波

（新疆石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，石河子 832000）

在自然環(huán)境中，植物需要面對復(fù)雜多變的生存條件，因此，它們進(jìn)化出復(fù)雜的機(jī)制來感知并響應(yīng)環(huán)境的變化，以便更好地生存和繁殖。為了更方便、快速地傳遞感知信息，植物使用Ca2+作為第二信使。在感受到外界刺激后，細(xì)胞質(zhì)中游離的Ca2+水平增加，充當(dāng)攜帶特定信息的信號，被下游效應(yīng)器感受到并產(chǎn)生生理生化反應(yīng)。許多外源和內(nèi)源因素（包括光、溫度、干旱與鹽脅迫病原體衍生的分子和植物激素等）都會引起植物細(xì)胞質(zhì)內(nèi)不同區(qū)域的游離Ca2+水平的升高［1]。

天山雪蓮（Sasussured involucrata）生長于天山山脈的陡峭山壁，是一種新疆特有的名貴中草藥［2]。由于生長在高海拔地區(qū)，天山雪蓮進(jìn)化出獨(dú)特的生理生化機(jī)制來適應(yīng)高寒、低氧、強(qiáng)輻射和晝夜溫差巨大等多種極端的生存環(huán)境。天山雪蓮作為一種抗逆性極強(qiáng)的植物，但人們對其抗逆機(jī)理仍然知之甚少。深入挖掘天山雪蓮的抗逆機(jī)制可以為研究植物逆境響應(yīng)機(jī)理、提高經(jīng)濟(jì)作物的逆境適應(yīng)力提供新的思路。

CaM是一種典型的Ca2+傳感器，可以與多種蛋白質(zhì)相互作用并調(diào)節(jié)其活性。它由2個球狀區(qū)域組成，每個區(qū)域都有一對EF-hand，由一個螺旋區(qū)域相連接［3]。Ca2+與EF-hand結(jié)合誘導(dǎo)蛋白質(zhì)疏水表面的暴露，形成結(jié)合下游效應(yīng)因子的高親和力結(jié)合位點(diǎn)。與CaM類似，CMLs主要由EF-hand組成，缺少其他已知的功能域。大多數(shù)CML（擬南芥中的31種，水稻種的20種）與鈣調(diào)素一樣具有4個EF-hand，但大部分的類鈣調(diào)素蛋白與鈣調(diào)素蛋白的同源性小于50%［4]。CML家族的蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)差異巨大，這表明它們在結(jié)合和識別Ca2+、激活下游目標(biāo)等方面具有獨(dú)特的性質(zhì)。盡管EF-hand結(jié)構(gòu)域的序列差異巨大，但在Ca2+存在下的電泳遷移率變化表明CMLs是Ca2+傳感器。包括激酶和轉(zhuǎn)錄因子在內(nèi)的多種蛋白質(zhì)已被鑒定為CML結(jié)合蛋白，植物細(xì)胞中CML與靶蛋白以及蛋白質(zhì)間特異性的相互作用已見報道，這表明CML可以通過調(diào)節(jié)自己的靶標(biāo)蛋白發(fā)揮其獨(dú)特的功能［5]。同種植物中存在不同的CaM和CML蛋白，在感受和鑒別不同環(huán)境刺激的Ca2+信號中均起到了重要的作用，但到目前為止，其具體的機(jī)理機(jī)制仍未被闡明。

通過對擬南芥AtCML9的研究顯示該蛋白含有151個氨基酸，與典型的CaM蛋白具有46%的序列同一性。該蛋白作為一種轉(zhuǎn)錄因子，響應(yīng)鹽、低溫、水分、干旱等各種刺激，并貫穿整個發(fā)育過程，作為ABA信號通路中的一種負(fù)調(diào)控因子調(diào)控?cái)M南芥的脅迫應(yīng)激和生長發(fā)育［6]。但在許多非模式植物中，對類鈣調(diào)素蛋白功能的研究鮮見報道。

本研究以天山雪蓮低溫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，采用RT-PCR方法從天山雪蓮中克隆CML基因家族SiCML7，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析及低溫脅迫下的定量表達(dá)分析，以期為開展抗逆基因工程提供有效的基因資源。

1 材料與方法

1.1 材料

天山雪蓮（S.involucrataKar.et kir）試管苗由石河子大學(xué)農(nóng)業(yè)生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1SiCML7的克隆使用總RNA提取試劑盒（天根）提取天山雪蓮RNA，利用EasyScriptOne-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒（全式金）反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)石河子大學(xué)農(nóng)業(yè)生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室得到的天山雪蓮葉片低溫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)特異性引物（SikCML7-UP：5'-TTGTCGAAGATGGTTGAAGGA-3'和SikCML7-DOWN ：5'-TTGTTTACGAGGCACTCATCA-3'），擴(kuò)增SiCML7的開放閱讀框（ORF）序列，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收、連接，挑選陽性克隆測序，測序成功后將其命名為pMD19-T-SikCML7質(zhì)粒。

1.2.2SikCML7生物信息學(xué)分析利用NCBI在線Blast尋找同源序列；利用DNAMAN進(jìn)行序列分析，搜索開放閱讀框ORF；利用DANMAN和MEGA軟件進(jìn)行多序列比對和進(jìn)化樹分析；采用ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測SikCML7的分子量、氨基酸組成、等電點(diǎn)以及疏水性等理化性質(zhì)；利用NCBI CDD以及Interproscan（https：//www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search）對蛋白質(zhì)的保守功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析；使用PSORT Prediction（http：//psort1.hgc.jp/form.html）預(yù)測蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位；使用ProtScale（https：//web.expasy.org/）對SikCML7蛋白的親/疏水性進(jìn)行分析［7]。

1.2.3SikCKL7在不同脅迫條件下的表達(dá)分析低溫處理：將天山雪蓮組培苗分別放入4℃和-2℃的低溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并在1、3、6、9、12和24 h分別取樣，-80℃保存?zhèn)溆?。干旱處理：將天山雪蓮組培苗置于20% PEG6000溶液中，并置于20℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在1、3、6、9、12和24 h分別取樣備用。鹽脅迫處理：將天山雪蓮組培苗放置于含150 mmol/L NaCl的MS固體培養(yǎng)基中置于20℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1、3、6、9、12和24 h分別取樣備用。分別提取不同處理雪蓮樣本的RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，置于-20℃?zhèn)溆?。選擇天山雪蓮看家基因GADPH作為內(nèi)參基因，并設(shè)計(jì)引物GAPDH-up：5'-TAGCAAGGATGCTCCCATGTTCGT-3'和GAPDH-down：5'-AAAGGAGCAAGGCAGTTGGTTGTG-3'；根據(jù)測序結(jié)果，設(shè)計(jì)SikCKL7引物SikCKL7-up：5'-GG TACCTTGTCGAAGATGGTTGAAGGA-3'和SikCKL7-down：5'-TCTAGACGAGGCACTCATCATAACC-3'。參考SYBR GreenⅠ Master Mix試劑盒說明書進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，采用2-ΔΔct法對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 SikCML7的克隆與同源序列比對

根據(jù)天山雪蓮低溫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)檢索到的SikCML7序列，并設(shè)計(jì)PCR引物，以天山雪蓮cDNA為模板，獲得到一條長度約500 bp的條帶。經(jīng)測序，其長度為450 bp。生物信息學(xué)分析表明其編碼一條149個氨基酸的蛋白質(zhì)序列，蛋白質(zhì)預(yù)測結(jié)果表明，該蛋白的相對分子質(zhì)量為17.14 kD，等電點(diǎn)為4.00。NCBI CDD以及interpro保守型分析表明其編碼一個屬于Penta-EF-hand（PEF）超家族的EF-hand結(jié)構(gòu)域；含有4個鈣離子結(jié)合位點(diǎn)，分別位于第21-33、57-69、93-105和129-141氨基酸。

圖1 雪蓮SikCML7與其他物種氨基酸多序列比對

使用PSORT Prediction對SikCML7蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測分析，結(jié)果顯示，有65%的可能性定位在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，有10%的可能性定位在線粒體基質(zhì)內(nèi)，有10%的可能性定位在溶酶體腔內(nèi)，說明SikCML7是一種胞內(nèi)蛋白，且定位在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)內(nèi)。對SikCML7進(jìn)行Blast檢索，獲得16個相似度極高的序列，使用DANMAN進(jìn)行多序列比對，結(jié)果（圖1）顯示，其同一性為81.16%，其中83-98、123-141區(qū)域相似度較高，而其余區(qū)域的相似度較低，可能由于植物CML的功能區(qū)域位于N末端。同時也表明，不同物種間的CML基因在功能上存在一定的差異。

2.2 SikCML7系統(tǒng)發(fā)育樹分析

在Tair上搜索并下載AtCMLs氨基酸序列，使用MEGA7和NJ法進(jìn)行進(jìn)化樹構(gòu)建。結(jié)果（圖2）顯示，雪蓮SikCML7蛋白同AtCML9在同一進(jìn)化枝上，表明SikCML7與AtCML9的親緣性較近。

圖2 SikCML7與擬南芥CMLs的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 SikCML7在不同脅迫條件下的表達(dá)模式

通過對天山雪蓮進(jìn)行不同脅迫處理，利用熒光定量PCR法檢測SikCML7的表達(dá)情況。在4℃處理時，SikCML7表達(dá)量在脅迫初期急速上升，約為對照組的116倍，之后隨著時間的推移其表達(dá)量逐漸下降，并在24 h后達(dá)到最低。在-2℃處理時，隨著時間的推移，其表達(dá)量在脅迫初期呈上升趨勢，并在6 h時表達(dá)量達(dá)到最高，約為對照組的20倍，之后其表達(dá)量隨脅迫時間逐漸下降（圖3）。

在干旱脅迫下，SikCML7表達(dá)量逐漸上升，在6 h時達(dá)到最大值，之后表達(dá)量逐漸下降，最終回到正常值（圖4）。

在鹽脅迫時，SikCML7表達(dá)量在脅迫初期不變，3 h時表達(dá)上調(diào)，且在接下來的9 h內(nèi)表達(dá)量均很高，24 h后恢復(fù)常態(tài)（圖5）。

結(jié)果表明，SikCML7面對脅迫時，可以在短時間內(nèi)快速作出反應(yīng)，并調(diào)整自身的生理狀態(tài)，以適應(yīng)逆境環(huán)境。

圖3 低溫脅迫下天山雪蓮SikCML7的表達(dá)模式

圖4 干旱脅迫下天山雪蓮SikCML7的表達(dá)模式

圖5 鹽脅迫下天山雪蓮SikCML7的表達(dá)模式

3 討論

CMLs是存在于高等植物中重要的Ca2+結(jié)合蛋白，在細(xì)胞Ca2+信號傳導(dǎo)途徑中扮演著重要的角色。CML含有1-6個不等的EF-hand手型結(jié)構(gòu)域，除此之外，沒有其他已知的功能結(jié)構(gòu)域［8]。研究表明，含有EF-hand的CMLs在植物的生長發(fā)育和逆境響應(yīng)中都有著重要的作用，例如AtCML15和AtCML16參與開花的過程［9]；AtCML36定位在花粉管，參與植物自身的Ca2+調(diào)節(jié)［10]；AtCML38是缺氧反應(yīng)核心鈣傳感蛋白［11]；AtCML42通過茉莉酸途徑充當(dāng)植物防御的負(fù)調(diào)節(jié)因子［12]；AtCML37通過脫落酸途徑參與植物干旱脅迫的響應(yīng)［13]；AtCML24通過調(diào)控NO進(jìn)而調(diào)控植物光周期和開花［14]；AtCML9通過ABA通路調(diào)控植物的低溫抗性［15]等。此外，大量研究表明，CMLS對Ca2+與靶蛋白的結(jié)合具有選擇性。植物中存在著與類鈣調(diào)素蛋白結(jié)合的不同蛋白激酶，它們在不同的生理?xiàng)l件下被特異性調(diào)控，具有不同的作用機(jī)制和生理功能［16]。

擬南芥CML家族有50個成員，水稻的CML家族有32個成員，由此可見CML是一個成員眾多的基因家族［17-19]。但是，迄今為止，對于不同基因的表達(dá)模式以及功能分析還未得到深入發(fā)掘，因此，關(guān)于類鈣調(diào)素蛋白家族的生理和生化功能還有待進(jìn)行更加深入的研究。

天山雪蓮作為一種具有高度抗寒性的植物，其生理功能及抗寒機(jī)制的研究還很淺薄。且多數(shù)實(shí)驗(yàn)主要集中在功能基因的研究上，而對于信號分子的研究幾乎為空白。作為植物信號通路中極為重要的一環(huán)，CMLs在天山雪蓮的抗逆過程中扮演著十分重要的角色。在石河子大學(xué)農(nóng)業(yè)生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室先前研究的基礎(chǔ)上，根據(jù)天山雪蓮的低溫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，本研究獲得到了天山雪蓮SikCML7基因，其編碼149個氨基酸，有4個EF-hand手型結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析其與AtCML9親緣性最近，BLAST分析及多序列比對則顯示出其與向日葵擁有最高的相似度，且均含有EF-hand手型結(jié)構(gòu)域，因此，推測兩者在功能上可能具有一定的相似性，此外，SikCML7是一個EF-hand的家族成員。

實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果表明，CMLs能夠參與植物的逆境應(yīng)激響應(yīng)。天山雪蓮經(jīng)過不同的低溫處理之后，其表達(dá)量均有顯著的提高，但是其表達(dá)模式卻存在明顯的差異。在4℃脅迫條件下，SikCML7在脅迫初期表達(dá)量瞬時上升，隨著時間的推移，其表達(dá)量逐漸下降。這可能是由于在冷害初期，外界冷信號迅速激活雪蓮的低溫應(yīng)激反應(yīng)，SikCML7在上游信號分子的調(diào)控下，表達(dá)量迅速上升；之后，隨著雪蓮對低溫脅迫的適應(yīng)，導(dǎo)致SikCML7的表達(dá)量逐步趨于正常。在-2℃脅迫條件下，SikCML7表達(dá)量逐漸上升，在6 h時表達(dá)量達(dá)到峰值，之后又表達(dá)下降。在經(jīng)過PEG和NaCl處理后，其表達(dá)量均在初期就有上升，之后隨著脅迫的持續(xù)基因表達(dá)維持一段時間，之后表達(dá)量恢復(fù)到正常水平。大量研究表明，ABA作為一種重要的植物激素，在于植物抵抗逆境的過程中起著重要的作用［20]，而類鈣調(diào)素蛋白家族積極參與植物ABA通路的響應(yīng)［21-22]。雪蓮SikCML7與擬南芥AtCML9的親緣性最高，AtCML9通過ABA通路調(diào)控植物抗逆。因此，推測SikCML7通過ABA途徑調(diào)控雪蓮的逆境響應(yīng)。植物在冷害下，細(xì)胞滲透壓上升，細(xì)胞保水性增加，從而降低低溫所帶來的損傷［23]。在凍害時，細(xì)胞內(nèi)水分需要快速外排，防止胞內(nèi)水分形成冰晶，從而降低冰晶形成所引起膜破壞損害［24]。因此，植物在應(yīng)對冷害和凍害需通過不同的機(jī)制調(diào)節(jié)達(dá)到整個低溫狀態(tài)的適應(yīng)。有研究表明，擬南芥中的CML家族成員可以通過調(diào)控鈉離子泵AtNHXs基因來調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透平衡，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的含水量以適應(yīng)不同溫度所帶來的生理生化反應(yīng)的變化［25]。據(jù)此推測SikCML7可能通過調(diào)控NHX來調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓，因此造成了SikCML7在不同低溫環(huán)境下的表達(dá)模式差異。同時，AtCML與AtNHX之間的相互作用表明在液泡中存在Ca2+-pH依賴性的信號組分，可以參與植物對鹽脅迫和干旱的響應(yīng)。研究表明，甲基乙二醛作為糖酵解的副產(chǎn)物，是植物暴露于高鹽環(huán)境下所產(chǎn)生的毒害物質(zhì)之一，通過乙二醛酶Ⅰ和乙二醛酶Ⅱ可以有效解毒。乙二醛酶Ⅰ是一種鈣依賴性蛋白，其酶學(xué)功能受到Ca2+/CaM的影響［26-27]。此外，有報道表明CML37、CML38和CML39也對鹽、干旱和ABA刺激有反應(yīng)，推測可能參與到植物滲透脅迫耐受［28]。

4 結(jié)論

SikCML7可能參與天山雪蓮的脅迫響應(yīng)過程，且對低溫脅迫響應(yīng)尤為強(qiáng)烈。