康 寧 郭麗麗 劉曉琳 花 錦 高利珍

(1.太原理工大學，山西 太原 030024；2.中華人民共和國太原海關，山西 太原 030024；3.山西中醫(yī)藥大學，山西 晉中 030619)

在2008年爆發(fā)的三聚氰胺事件后，不少不法商販又將目光轉(zhuǎn)向動物水解蛋白，代替三聚氰胺加入到乳及乳制品中以增加乳中蛋白含量。L-羥脯氨酸是動物水解蛋白的特征成分[1]，乳蛋白質(zhì)中不含有，它是膠原蛋白中特有的一種氨基酸，約占膠原蛋白氨基酸總量的10%，而膠原蛋白的主要來源是動物皮料。曾有無良商家向乳制品中摻雜以皮革下腳料等原料制備低廉的高蛋白產(chǎn)品，由于此類低廉的高蛋白產(chǎn)品存在鉻殘留，長期食用此類低廉高蛋白產(chǎn)品的乳制品會危害人體健康[2-3]。2011年中國食品安全整頓工作辦公室發(fā)布關于印發(fā)《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單(第五批)》的通知(整頓辦函〔2011〕1號)中明確皮革水解物不能加入乳制品中[4]。

目前，乳及乳制品中L-羥脯氨酸主要是采用分光光度法和液相色譜及質(zhì)譜法來檢測[4-6]，經(jīng)檢索對于各類食品檢測方法的不確定度研究報告較多[7-9]，而L-羥脯氨酸的不確定度評估卻較少[10-11]，尤其是L-羥脯氨酸在乳及乳制品中檢測方法的不確定度評估，只有1篇關于分光光度法的不確定度研究[12]，對于檢測實驗室，檢測質(zhì)量的保證是很關鍵的，其次作為第三方檢測機構在日常檢測過程中，發(fā)現(xiàn)乳及乳制品中L-羥脯氨酸檢測送檢率較高，因此對于L-羥脯氨酸的質(zhì)譜檢測方法的不確定度亟待評估。

基于SN/T 3929—2014《出口食品中L-羥脯氨酸的測定》，本研究對本實驗室測定生乳中L-羥脯氨酸測量的不確定進行評定，以期為結(jié)果的準確性提供保證，為客戶提供公平公正的檢測結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

生乳：散裝，委托送檢樣品；

L-羥脯氨酸標準品：純度(99±1)%，上海古朵生物科技有限公司；

乙腈、甲醇：色譜純，美國Fisher公司；

優(yōu)級純、正己烷、鹽酸：分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；

甲酸銨：天津市科密歐化學試劑有限公司；

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀：Waters ACQUITY TQ Detector型，美國沃特世公司；

電子分析天平：Mettler ME204E型，瑞士梅特勒集團；

冷凍干燥機：Scientz-18N型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

漩渦混勻器：TALBOYS DIGITAL VRTX MXR 230V EURO型，美國Henry Troemner公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：Heating Bath B-491型，瑞士步琪(Buchi)實驗室儀器公司；

超聲波清洗器：KQ-500DB型，江蘇省昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液配制 準確移取L-羥脯氨酸標準品10 mg 于10 mL容量瓶中，用水定容，配制成1 mg/mL的標準溶液。吸取上述1 mLL-羥脯氨酸標準溶液，用水定容到10 mL容量瓶中，制成100 μg/mL標準中間溶液于4 ℃下保存。再移取0.003，0.005，0.010，0.020，0.050 mLL-羥脯氨酸標準中間溶液分別置于10 mL容量瓶中，再用水定容成標準工作溶液。

1.2.2 樣品制備 準確稱取生乳1 g于30 mL水解管中，移取6 mol/L鹽酸溶液10 mL，混合后充入氮氣封口，在105 ℃下水解過夜。將水解液冷卻過濾，并用25 mL 水稀釋后-80 ℃冷凍干燥2 h，凍干物依次加1 mL 水，10 mL 乙腈，溶解。將提取液40 ℃進行減壓濃縮干，并用1 mL乙腈—水(9+1體積比)溶解。溶解液用5 mL乙腈飽和正己烷液液分配、萃取脫脂，下層溶液經(jīng) 0.22 μm 濾膜過濾，待上機。

1.2.3 色譜條件 色譜柱：Agilent HILIC(100 mm×2.1 mm，3.5 μm)；柱溫：35 ℃；流動相：0.01 mol/L的甲酸銨溶液和乙腈；流速：0.4 mL/min；進樣體積：10 μL。

1.2.4 羥脯氨酸測量的數(shù)學模型

(1)

式中：

X——樣品中L-羥脯氨酸的含量，μg/kg；

c——溶液中L-羥脯氨酸在標準曲線中的濃度，ng/mL；

V1——提取液的體積，mL；

V2——用于凈化樣品的體積，mL；

V3——樣品的最終定容體積，mL；

1 000——換算系數(shù)；

m——樣品的質(zhì)量，g；

f(rec)——回收率的校正因子；

f(rep)——重復性的校正因子。

2 分析過程中不確定度的分量

通過提取、凈化、濃縮、定容生乳中的L-羥脯氨酸等步驟，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法進行檢測，各個環(huán)節(jié)都會引入不確定度。每個步驟對應的不確定度較為困難，本文選擇評價了檢測方法中數(shù)據(jù)的分量。

圖1 生乳中L-羥脯氨酸測定不確定度來源圖Figure 1 Uncertainty sources of determination for L-hydroxyproline in raw milk

2.1 質(zhì)量引入的不確定度

稱取樣品0.518 5 g，由電子天平的計量證書獲得，稱量范圍為0～100 g，示值誤差為±0.000 1 g，取矩形分布，稱量引入的標準不確定度為：

2.2 樣品前處理中體積引入的不確定度

2.2.1 水解溶液定容體積引入的標準不確定度 JJG 196-2006《常用玻璃量器》檢定規(guī)程中規(guī)定A級10 mL具塞比色管的容量允差為±0.002 0 mL，取矩形分布，則得出10 mL具塞比色管引入的標準不確定度為：

2.2.2 水解溶液分取體積引入的標準不確定度 2.5 mL分取體積需使用5 000 μL的移液器，JJG 646-2006《移液器》檢定規(guī)程中規(guī)定：5 000 μL移液器取2 500 μL時的容量允差為±0.5%，取矩形分布，則得出水解液分取體積引入的不確定度為：

2.2.3 最終定容體積引入的標準不確定度 本方法定容體積為1 mL，JJG 646-2006《移液器》檢定規(guī)程中規(guī)定：1 000 μL 移液器的容量允差為±1.0%，取矩形分布，則得出最終定容體積引入的不確定度為：

由前處理中體積引入的不確定度為：

2.3 標準工作溶液配制過程的不確定度

2.3.1 標準物質(zhì)的不確定度L-羥脯氨酸標準物質(zhì)證書上標出標準物質(zhì)的不確定度urel(P)=0.000 25。

2.3.2 標準工作液配制過程的不確定度 使用0.1 mg 的分量天平、A級10 mL的容量瓶稱取標準品、配制和稀釋，JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》中規(guī)定A級10 mL容量瓶最大允許差為±0.025 mL，因此由容量瓶引入的不確定度為：

2.3.3L-羥脯氨酸標準曲線引入的不確定度 配制質(zhì)量濃度為30，50，100，200，500 ng/mL的校準標準溶液，計算得到的標準曲線的不確定度只與儀器的靈敏度相關。L-羥脯氨酸標準曲線圖見圖2。

根據(jù)式(2)、(3)計算L-羥脯氨酸標準曲線引入的不確定度。

圖2 L-羥脯氨酸標準曲線圖Figure 2 L-hydroxyproline standard curve

(2)

(3)

式中：

urel(C)——L-羥脯氨酸標準曲線引入的不確定度；

SA——回歸直線標準偏差；

Ai——i個質(zhì)量濃度點測定的峰面積；

R——按回歸方程計算得出的i點的峰面積；

N——標準溶液濃度點。

經(jīng)計算得urel(C)=0.053 6。

2.3.4 標準工作液濃度不確定度的合成

2.4 回收率帶入的不確定度

對空白樣品進行加標回收試驗，需要添加6次相同濃度的標樣，測得回收率分別為94.3%，98.1%，97.8%，92.7%，99.9%，99.2%，平均回收率97.0%，根據(jù)式(4)、(5)計算回收率引入的相對標準不確定度。

(4)

(5)

式中：

urel(frec)——回收率引入的不確定度；

n——回收率測定的頻次點。

2.5 重復性帶入的不確定度

選取一個陽性樣品進行重復性試驗(n=6)，L-羥脯氨酸測得結(jié)果為374.351 2，375.463 5，375.631 3，375.785 6，374.379 9，375.129 5 μg/kg，平均值為375.123 5 μg/kg，根據(jù)式(4)、(5)計算重復性引入的相對標準不確度：urel(frep)=0.033 83。

2.6 合成最終的不確定度

通過對方法重復性及數(shù)學模型的每個分量引入的不確定度等分量進行合成，最終通過計算合成不確定度：

urel(X)=

0.068 7 μg/kg。

2.7 擴展不確定度

置信概率約為95%，取包含因子k=2，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測生乳中L-羥脯氨酸的相對擴展不確定度為：urel=k×urel(X)=2×0.068 7=0.137 4 μg/kg。

3 測量結(jié)果及其不確定度的報告

用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定生乳中L-羥脯氨酸含量，測定結(jié)果可表示為：X=(375.123 5±0.137 4)μg/kg，k=2。

4 結(jié)論

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測生乳中L-羥脯氨酸過程中的不確定度，主要來源于前處理的過程、天平的稱量過程、標準溶液的配制過程及濃度、回收率、重復性5個分量。對這5個分量進行不確定度評定，最終得出擴展不確定度為0.137 4 μg/kg，當包含因子k=2、生乳中L-羥脯氨酸檢測值為375.123 5 μg/kg時，測定結(jié)果可表示為：(375.123 5±0.137 4)μg/kg，k=2(置信概率約為95%)。

檢測結(jié)果的不確定度主要來源于最小二乘法擬合的標準曲線、重復性及回收率，因此，可以采取增加標準曲線的進樣次數(shù)、增加平行樣品的測試，選擇精度更高的器皿來代替普通的器皿，優(yōu)化前處理過程等措施來減少各不確定度分量對檢測結(jié)果的影響，增加檢測結(jié)果的可信度。