李銀英

(鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部，河南 鄭州 450052)

2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol，2-ME)是雌激素的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物,但對(duì)雌激素受體的親和力較低,而且對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用。由于該藥只作用于增殖活躍的細(xì)胞,而對(duì)靜止細(xì)胞無作用，所以不良反應(yīng)較輕。近年來，通過大量的體內(nèi)外研究[1-4]發(fā)現(xiàn)，2-ME具有抗多種惡性腫瘤的作用，其中包括肝癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、骨髓瘤以及白血病等。大量研究[3-4]證明2-ME的作用機(jī)制主要為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞的增生、抗新血管的生成、抑制微管的功能等，具有成為抗腫瘤藥物的潛力，本實(shí)驗(yàn)旨在研究其對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞系人食管癌細(xì)胞EC-9706、人胃癌細(xì)胞SGC-7901、人肝癌細(xì)胞SMMC-7721、人肝癌細(xì)胞HepG-2、人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SK-N-SH、人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y、人前列腺癌細(xì)胞PC-3、人宮頸癌細(xì)胞HeLa、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7，均為貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所，并在鄭州大學(xué)藥學(xué)院長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)。

試劑與儀器：E191型CO2培養(yǎng)箱，美國(guó)SIM公司；倒置顯微鏡，德國(guó)Leica公司；U410型超低溫冰箱(-80 ℃)，美國(guó)NBS公司；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，美國(guó)Coming Costar公司；Spectra MR型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，美國(guó)DYNEX公司；2-ME，鄭州大學(xué)藥學(xué)院化學(xué)試驗(yàn)室合成；DMEM培養(yǎng)基，鄭州科諾生物技術(shù)有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基，鄭州科諾生物技術(shù)有限公司；優(yōu)級(jí)胎牛血清，上海依科賽生物制品有限公司；磺酰羅丹明B(SRB)，美國(guó)Sigma公司；二甲基亞砜(DMSO)，北京Solarbio公司；胰蛋白酶，美國(guó)Sigma公司；三氯乙酸(TCA)，鄭州科諾生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮或-80 ℃冰箱中取出凍存的腫瘤細(xì)胞，迅速置于接近37 ℃的溫水中，邊搖邊振蕩，使其在數(shù)秒內(nèi)完全解凍，然后將其轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)離心(1000 r·min-1，5 min)，棄去上清液，加入適量培養(yǎng)基，吹打成單細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到占培養(yǎng)瓶體積80%～90%時(shí)，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰酶(不含乙二胺四乙酸)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代，選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2 SRB法檢測(cè)2-ME對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的體外抑制作用

1.2.2.1 2-ME對(duì)EC-9706、SK-N-SH、SH-SY5Y細(xì)胞的體外抑制作用檢測(cè)[5]取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EC-9706細(xì)胞，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰酶消化收集，調(diào)整細(xì)胞濃度，5×103個(gè)/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的2-ME(0.625、1.25、2.5、5、10、20 μmol·L-1)，每孔反應(yīng)體系0.2 mL，空白對(duì)照組以RPMI-1640培養(yǎng)基補(bǔ)足，溶劑對(duì)照組DMSO濃度為20 μmol·L-1，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)分別培養(yǎng)24、48、72 h后，倒置顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察并照相，用預(yù)冷的TCA固定10 min，移入4 ℃條件下靜置1 h后，倒掉固定液，每孔用去離子水洗5次，自然晾干，于干燥的每小孔中加入100 μLSRB染色，室溫避光放置15 min，棄去染液，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%冰醋酸將未結(jié)合的SRB染液洗去，每孔5遍，自然晾干。結(jié)合的SRB用Tris堿液150 μL溶解，搖床上放置15～20 min后，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀在515 nm處測(cè)定每孔光密度(OD)值，用下列公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率[6]：細(xì)胞增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

1.2.2.2 2-ME對(duì)SGC-7901、SMMC-7721、HepG-2細(xì)胞的體外抑制作用檢測(cè) 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901、SMMC-7721、HepG-2細(xì)胞按照1.2.2.1的方法進(jìn)行處理，然后將細(xì)胞以5×103個(gè)/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的2-ME，終濃度為0.625、1.25、2.5、5、10、20 μmol·L-1，每孔反應(yīng)體系0.2 mL，空白對(duì)照組以RPMI-1640培養(yǎng)基補(bǔ)足，溶劑對(duì)照組DMSO濃度為16 μmol·L-1，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)分別培養(yǎng)24、48、72 h后，按照1.2.2.1方法繼續(xù)處理細(xì)胞。

1.2.2.3 2-ME對(duì)PC-3、HeLa、MCF-7細(xì)胞的體外抑制作用檢測(cè) 用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、青鏈霉素混合液的RPMI-1640培養(yǎng)基將PC-3、HeLa、MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰酶消化收集，因?yàn)榇?種細(xì)胞生長(zhǎng)速度較慢，所以96孔板每孔接種濃度為6×103個(gè)/孔，后續(xù)操作按照1.2.2.1的方法。

2 結(jié)果

2.1 2-ME對(duì)EC-9706細(xì)胞的體外抑制作用2-ME對(duì)EC-9706細(xì)胞的體外抑制作用隨藥物濃度和作用時(shí)間變化而變化，在作用24 h時(shí)抑制作用不明顯，作用48 h和72 h時(shí)抑制作用明顯，且呈現(xiàn)很好的時(shí)間和濃度依賴性。2-ME作用時(shí)間為48 h和72 h的半抑制濃度(50% inhibitory concentration，IC50)分別為7.210、8.598 μmol·L-1。見表1、圖1。

表1 2-ME對(duì)EC-9706細(xì)胞的體外抑制作用

圖1 2-ME對(duì)細(xì)胞EC-9706的抑制作用

2.2 2-ME對(duì)SGC-7901細(xì)胞的體外抑制作用2-ME在作用時(shí)間為24 h時(shí)對(duì)SGC-7901細(xì)胞無明顯抑制作用，最大抑制率出現(xiàn)在10 μmol·L-1，數(shù)值為22.5%；當(dāng)2-ME作用時(shí)間為48、72 h時(shí)，對(duì)SGC-7901細(xì)胞的抑制非常明顯，并呈現(xiàn)很好的時(shí)間濃度依賴性。2-ME作用時(shí)間為48 h和72 h的IC50分別為2.762、0.231 μmol·L-1。見表2、圖2。

表2 2-ME對(duì)SGC-7901細(xì)胞的體外抑制作用

圖2 2-ME對(duì)SGC-7901細(xì)胞的體外抑制作用

2.3 2-ME對(duì)SMMC-7721、HepG-2細(xì)胞的體外抑制作用2-ME對(duì)SMMC-7721細(xì)胞作用時(shí)間為24、48、72 h時(shí)，最高抑制率均出現(xiàn)在最大濃度點(diǎn)20 μmol·L-1，抑制率分別為29.0%、55.0%、72.5%，整體上在作用24 h時(shí)抑制作用不明顯，作用48 h和72 h時(shí)抑制作用明顯，且呈現(xiàn)很好的時(shí)間和濃度依賴性。2-ME對(duì)SMMC-7721細(xì)胞48 h和72 h的IC50分別為7.871、1.453 μmol·L-1(表3、圖3)。2-ME對(duì)HepG-2細(xì)胞在藥物作用時(shí)間為24、48、72 h時(shí)，最高抑制率均出現(xiàn)在最大濃度點(diǎn)20 μmol·L-1，抑制率分別為36.6%、52.9%、79.4%，整體上在作用24 h時(shí)抑制作用不明顯，作用48 h和72 h時(shí)抑制作用明顯，也呈現(xiàn)很好的時(shí)間和濃度依賴性。2-ME作用HepG-2細(xì)胞48 h和72 h的IC50分別為6.785、0.781 μmol·L-1(表4、圖4)。

表3 2-ME對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的體外抑制作用

表4 2-ME對(duì)HepG-2細(xì)胞的體外抑制作用

圖3 2-ME對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的體外抑制作用

圖4 2-ME對(duì)HepG-2細(xì)胞的體外抑制作用

2.4 2-ME對(duì)SK-N-SH、SH-SY5Y細(xì)胞的體外抑制作用2-ME對(duì)SK-N-SH細(xì)胞作用時(shí)間24 h時(shí)，最大抑制率是出現(xiàn)在最高濃度點(diǎn)的，抑制率為28.0%；而在2-ME作用時(shí)間為48 h和72 h時(shí)，最好抑制效果則分別出現(xiàn)在濃度為1.25、2.5 μmol·L-1時(shí)，抑制率分別為72.2%、73.4%；在出現(xiàn)最大抑制效果后，抑制率則變化平穩(wěn)，在5、10、20 μmol·L-1這3個(gè)濃度點(diǎn)抑制率相近，48h時(shí)3個(gè)濃度點(diǎn)抑制率分別為55.6%、54.7%、55.3%，72 h時(shí)則分別為53.7%、54.3%、57.2%。整體上在作用24 h時(shí)抑制作用不明顯，作用48 h和72 h時(shí)抑制作用明顯。2-ME作用時(shí)間48h和72h時(shí)的IC50值分別為1.961、1.263 μmol·L-1(表5、圖5)。2-ME對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的抑制，在作用時(shí)間為24、48、72h時(shí)最大抑制率均出現(xiàn)在最高濃度，分別為30.9%、57.5%、65.6%。整體上在作用24 h時(shí)抑制作用不明顯，作用48h和72h時(shí)抑制作用明顯，其作用基本遵循時(shí)間和濃度依賴性。2-ME作用SH-SY5Y細(xì)胞48 h和72 h的IC50分別為5.837、2.354 μmol·L-1(表6、圖6)。

表5 2-ME對(duì)SK-N-SH細(xì)胞的體外抑制作用

表6 2-ME對(duì)SK-SY5Y細(xì)胞的體外抑制作用

圖5 2-ME對(duì)SK-N-SH細(xì)胞的體外抑制作用

圖6 2-ME對(duì)SK-SY5Y細(xì)胞的體外抑制作用

2.5 2-ME對(duì)PC-3、HeLa、MCF-7細(xì)胞的體外抑制作用2-ME在濃度為2.5 μmol·L-1之前，對(duì)PC-3細(xì)胞抑制率隨濃度的變化而變化幅度較大，但是在2.5 μmol·L-1之后，抑制率隨濃度變化較為平穩(wěn)，24、48、72 h這3個(gè)時(shí)間點(diǎn)抑制率隨濃度的變化趨勢(shì)較為一致，在作用24 h時(shí)抑制作用不明顯，作用48 h和72 h時(shí)抑制作用明顯。2-ME作用48、72 h時(shí)對(duì)PC-3細(xì)胞的IC50分別為5.223、3.96 1μmol·L-1(表7、圖7)。2-ME對(duì)HeLa細(xì)胞在作用24 h時(shí)抑制作用不明顯，作用48 h和72 h時(shí)抑制作用明顯，且呈時(shí)間和濃度依賴性，2-ME作用HeLa細(xì)胞48 h和72 h的IC50分別為3.276、1.897 μmol·L-1(表8、圖8)。2-ME對(duì)MCF-7細(xì)胞在作用24 h時(shí)抑制作用不明顯，作用48 h和72 h時(shí)抑制作用明顯，且呈時(shí)間和濃度依賴性。2-ME作用MCF-7細(xì)胞48 h和72 h的IC50分別為2.963、2.891 μmol·L-1(表9、圖9)。

表7 2-ME對(duì)PC-3細(xì)胞的體外抑制作用

表8 2-ME對(duì)HeLa細(xì)胞的體外抑制作用

表9 2-ME對(duì)MCF-7細(xì)胞的體外抑制作用

圖7 2-ME對(duì)PC-3細(xì)胞的抑制作用

圖8 2-ME對(duì)HeLa細(xì)胞的抑制作用

圖9 2-ME對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制作用

3 討論

2-ME已經(jīng)被證實(shí)在體外對(duì)肝癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、骨髓瘤以及白血病等多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，且只作用于增殖活躍的細(xì)胞，而對(duì)靜止細(xì)胞無明顯作用，2-ME的作用機(jī)制主要為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞的增生、抗新血管的生成、抑制微管的功能等[5-10]。幾種2-ME的藥物的臨床前和臨床試驗(yàn)均顯示出了較好的耐受性，但是其較低的生物利用度限制了其在臨床中的應(yīng)用，因此，下一步的研究主要集中在如何提高其生物利用度方面[7-14]。本研究證實(shí)，2-ME在體外對(duì)食管癌、胃癌、肝癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、前列腺癌、宮頸癌、乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞均有良好的抑制作用，且呈不同程度的時(shí)間和濃度依賴性，但是并不是在所有濃度區(qū)間都呈濃度依賴性的。2-ME對(duì)EC-9706細(xì)胞的體外抑制隨隨藥物濃度和作用時(shí)間變化而變化，48 h和72 h時(shí)明顯高于24 h，但48 h和72 h時(shí)卻無顯著差別，甚至48h時(shí)的IC50略低于72 h；2-ME 對(duì)SMMC-7721細(xì)胞作用時(shí)間為24、48、72 h時(shí)，最高抑制率均出現(xiàn)在最大濃度點(diǎn)20 μmol·L-1，而且每組都呈現(xiàn)很好的濃度依賴性；2-ME對(duì)SK-N-SH細(xì)胞的體外抑制效果雖然很好，但是并不遵循很好的時(shí)間和濃度依賴性，而是在不同作用時(shí)間的不同濃度點(diǎn)出現(xiàn)最大抑制效果，在作用24 h時(shí)最大抑制率出現(xiàn)在最高濃度點(diǎn)，抑制率為28.0%，而在2-ME作用時(shí)間為48、72 h時(shí)最好抑制效果則分別出現(xiàn)在濃度為1.25、2.5 μmol·L-1時(shí)，抑制率分別為72.2%、73.4%；在出現(xiàn)最大抑制效果后，抑制率則變化平穩(wěn)，在5、10、20 μmol·L-1這3個(gè)濃度點(diǎn)，抑制率并無較大差別。2-ME對(duì)HeLa細(xì)胞的體外抑制作用是非常明顯的，表現(xiàn)出很好的時(shí)間和濃度依賴性，但是在作用時(shí)間48、72 h時(shí)，10 μmol·L-1濃度點(diǎn)的抑制率均大于20 μmol·L-1，不同于10 μmol·L-1之前抑制率隨濃度的變化；2-ME作用于MCF-7細(xì)胞時(shí)，48、72 h時(shí)實(shí)驗(yàn)數(shù)值差別不大，甚至48 h時(shí)在濃度點(diǎn)0.625 μmol·L-1之后，其抑制率都略高于72 h，這一結(jié)果表明，48 h之后，2-ME對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制率隨時(shí)間變化不太明顯，而對(duì)SGC-7901細(xì)胞的抑制對(duì)時(shí)間和劑量的依賴顯著?？傊?，2-ME能夠在體外抑制上述腫瘤細(xì)胞的增殖，且作用呈一定的時(shí)間和濃度依賴性，但是其具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究闡明。