李 泮，袁 方，李二威，李付廣

(1.鄭州大學基礎醫(yī)學院,河南 鄭州 450001；2.阜外華中心血管病醫(yī)院輸血科，河南 鄭州 450018)

食管癌是發(fā)生于食管上皮組織的惡性腫瘤，其早中期時有治愈可能，晚期治愈難度較大，目前主要治療方法包括手術、化療、放療以及靶向治療等。近年來隨著靶向治療等生物治療手段的豐富和診療技術的提高，食管癌患者的治療效果和生存率有了一定提高。

近年來，慢病毒載體已被廣泛應用于多種腫瘤的研究，其可以將外源基因有效整合到宿主染色體上，具有持久穩(wěn)定表達等特點[1]。腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體(tumor necrosis factor-related apoptosisinducing ligand，TRAIL)是腫瘤壞死因雙家族的一員，通過與細胞膜表面受體特異性結(jié)合可以調(diào)控腫瘤細胞增殖和凋亡[2]。目前關于慢病毒介導的TRAIL過表達在食管癌中的作用的研究還未見報道。因此，本研究構(gòu)建重組慢病毒plenti-TRAIL來探討TRAIL過表達對食管癌細胞生長的作用，為進一步研究TRAIL在食管癌中的作用機制提供一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)食管癌Eca-109細胞購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所細胞庫。將Eca-109細胞接種于含有體積分數(shù)10%胎牛血清及青霉素100 u·mL-1和鏈霉素100 g·mL-1的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng)。

1.2 TRAIL片段制備按照天根核糖核酸(RNA)simple總RNA提取試劑盒流程對293T細胞進行總RNA提取，對總RNA進行反轉(zhuǎn)錄得到互補脫氧核糖核酸(cDNA)，利用該cDNA為模板對TRAIL進行聚合酶鏈反應(PCR)擴增，并對TRAIL片段進行EcoR I和Not I酶切。

1.3 構(gòu)建重組慢病毒首先膠回收均經(jīng)過EcoR I和Not I酶切后的TRAIL片段和pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP線性載體，對2個片段進行連接轉(zhuǎn)化，挑取單克隆菌落進行鑒定后，提取質(zhì)粒，獲得plenti-TRAIL重組慢病毒表達載體。

1.4 重組慢病毒包裝和滴定將293T細胞以3×106個細胞/皿傳至10 cm平皿。次日待長至90%貼壁率時，準備轉(zhuǎn)染試劑，共轉(zhuǎn)染18 h后，適量磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，并更換為10 mL完全DMEM培養(yǎng)基。共轉(zhuǎn)染72 h后，收集病毒培養(yǎng)基，15 mL無菌離心管中3 000 r·min-1離心5 min，0.45 μm濾器過濾，再25 000 r·min-1、4 ℃超速離心90 min后，棄上清。無菌操作，加入病毒原液體積1%的DMEM培養(yǎng)基，每隔15 min輕輕吹打1次，使慢病毒顆粒重懸，使病毒顆粒徹底懸浮。分裝后，-80 ℃凍存?zhèn)溆?，然后進行滴度測定。將重組慢病毒命名為LV-TRAIL。

1.5 慢病毒感染效率測定將Eca-109細胞以1×105/孔的細胞密度接種于24孔板中，設3個復孔，用正常培養(yǎng)基梯度稀釋病毒液105～108IU·mL-1，并梯度感染細胞。每孔加入8 μg·mL-1的多聚季銨。37 ℃感染2 h，期間每20 min晃動平板，使病毒充分感染細胞。1 000 r·min-1，10 min，水平離心平板，輕輕棄去培養(yǎng)基，添加含體積分數(shù)2%血清新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。4 d后觀察熒光表達情況，計算感染效率。

1.6 MTT實驗檢測TRAIL過表達對Eca-109細胞增殖的影響細胞在6孔板中轉(zhuǎn)染48 h后，接種在96孔板中，細胞數(shù)為1×105個/mL，每孔加入100 μL細胞懸液，培養(yǎng)過夜后進行轉(zhuǎn)染，每組設3個平行孔，37 ℃，分別培養(yǎng)24、48、72 h，加入5 mg·mL-1MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入DMSO 150 μL，混勻，酶標儀(波長=570 nm)測定吸光度(A570)。

1.7 流式細胞儀檢測TRAIL過表達對Eca-109細胞凋亡的影響將細胞接種在6孔板中，細胞數(shù)為5×105個/mL，培養(yǎng)過夜后進行轉(zhuǎn)染，每組設3個平行孔，培養(yǎng)48 h后，胰酶消化，收集細胞，1 500 r·min-1離心5 min，PBS(0.01 mol·L-1，pH 7.4)洗1次，按照流式凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，加入100 μL 1×Binding Buffer重懸細胞，加入5 μL Annexin V/PE和10 μL 7-ADD，輕輕混勻，避光室溫孵育反應10 min。加入400 μL 1×Binding Buffer，混勻，樣品在1 h內(nèi)用流式細胞儀和熒光顯微鏡檢測。

1.8 Transwell檢測TRAIL過表達對Eca-109細胞侵襲的影響首先將凍存于-80 ℃的Matrigel放于4 ℃條件下過夜，變成液態(tài)；取300 μL無血清培養(yǎng)基，加入60 μL Matrigel，混勻，在上室加入100 μL混合液，常規(guī)培養(yǎng)4～5 h；之后消化細胞，用無血清培養(yǎng)基洗3次，并配成細胞懸液；用無血清培養(yǎng)基洗Matrigel 1次，每孔中加入100 μL細胞懸液；下室中加入500 μL含有體積分數(shù)20%胎牛血清培養(yǎng)基；37 ℃培養(yǎng)箱中，孵育20～24 h；取出Transwell用PBS洗2次，用質(zhì)量分數(shù)5%戊二醛固定，放于4 ℃；加入質(zhì)量分數(shù)0.5%結(jié)晶紫染色，室溫下放置30 min后，用PBS洗2次，擦去上表面細胞，放于顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 重組慢病毒滴度測定將目的慢病毒載體質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞后，收集病毒，然后經(jīng)濃縮后進行病毒滴度測定，經(jīng)測定LV-TRAIL病毒滴定值為2×108TU·mL-1。

2.2 重組慢病度感染效率測定用LV-TRAIL慢病毒感染Eca-109細胞，觀察細胞中熒光表達結(jié)果，發(fā)現(xiàn)大部分細胞有綠色熒光表現(xiàn)，計算所得感染效率為90%。

2.3 TRAIL過表達對Eca-109細胞增殖的影響利用MTT法檢測TRAIL過表達對Eca-109細胞增殖的影響，對照組細胞24 h、48 h、72 h的光密度(OD)值分別為0.632±0.057、0.949±0.071、1.679±0.162，TRAIL過表達組細胞24 h、48 h、72 h的OD值分別為0.476±0.049、0.716±0.034、0.952±0.091，說明TRAIL過表達明顯抑制Eca-109細胞的增殖。見圖1。

圖1 MTT檢測各組Eca-109細胞的增殖情況

2.4 TRAIL過表達對Eca-109細胞凋亡的影響利用流式細胞儀檢測TRAIL過表達對Eca-109細胞凋亡的影響，對照組和TRAIL過表達組細胞凋亡率分別為4.5%和13.8%，表明TRAIL過表達明顯促進Eca-109細胞的凋亡。見圖2。

圖2 流式細胞儀檢測各組Eca-109細胞的凋亡情況

2.5 TRAIL過表達對Eca-109細胞侵襲的影響利用Transwell實驗檢測TRAIL過表達對Eca-109細胞侵襲的影響，對照組細胞侵襲數(shù)為15.0±1.5，TRAIL過表達組細胞侵襲數(shù)為51.0±5.2，說明TRAIL過表達明顯抑制Eca-109細胞的侵襲。見圖3。

圖3 Transwell實驗檢測各組Eca-109細胞的侵襲情況

3 討論

TRAIL能特異性殺傷培養(yǎng)和異種移植腫瘤中的多種腫瘤細胞，但對正常細胞的殺傷作用很小，甚至沒有影響，因此其是腫瘤治療的理想靶標分子。TRAIL是一種有效的凋亡誘導細胞因子[3-4]。TRAIL不僅對結(jié)腸癌[5]、肺癌[6]、腎癌[7]、肝癌[8]等多種實體瘤細胞具有促凋亡作用，而且也可以誘導包括白血病在內(nèi)的血液系統(tǒng)腫瘤細胞的凋亡[9]。TRAIL誘導的細胞凋亡與TRAIL和膜受體TRAIL-r1、TRAIL-r2相互作用有關。這種相互作用導致受體分子FAS-相關蛋白與死亡域結(jié)合，導致啟動子caspase-8的積累，進而激活效應因子caspase，如caspase-3，從而引起細胞凋亡[10]。有研究[11-12]發(fā)現(xiàn)，TRAIL在食管癌中表達下調(diào)能夠誘導細胞凋亡。本研究也有類似的發(fā)現(xiàn)，TRAIL過表達能夠明顯促進Eca-109細胞的凋亡。

除了促進凋亡外，本研究還發(fā)現(xiàn)TRAIL過表達能夠明顯抑制Eca-109細胞的增殖和侵襲。經(jīng)查閱文獻，有很多關于TRAIL可以抑制腫瘤細胞增殖和侵襲的研究。楊陽等[13]研究發(fā)現(xiàn)，TRAIL聯(lián)合化療或熱療可以抑制人肝癌SMMC-7721細胞的體外增殖；王才智等[14]研究發(fā)現(xiàn)TRAIL聯(lián)合低濃度化療藥物多西他賽、順鉑等可以顯著抑制子宮內(nèi)膜癌細胞增殖，誘導細胞凋亡；李秀萍等[15]研究發(fā)現(xiàn)TRAIL通過降低表皮生長因子受體的表達水平抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞的侵襲。除了影響增殖、侵襲和凋亡外，TRAIL還可以增強食管癌的化療療效，提高藥物敏感性，例如順鉑等化療藥物[16]。因此，TRAIL有成為食管癌重要治療手段的潛力，有必要進一步開展關于TRAIL在食管癌治療中的相關研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)TRAIL過表達能夠明顯抑制食管癌細胞的增殖和侵襲，促進細胞凋亡，進而發(fā)揮抑制腫瘤發(fā)展的作用，有成為食管癌治療靶點的潛力。然而，TRAIL過表達對食管癌細胞遷移、周期以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等的影響以及分子機制還不清楚，有待進一步研究。這些研究對于提高食管癌患者的生存率和生活質(zhì)量具有重要的意義。