徐璐寧，王宇洋，薛彬冰，梅榮武，張 宇，丁林賢，蘇曉梅?

(1 浙江師范大學地理與環(huán)境科學學院， 浙江 金華 321000； 2 浙江省環(huán)境保護科學設計研究院工程研究中心， 杭州 310007)

高氨氮廢水的治理成為污水處理領域亟待解決的一個難題。隨著石油化工、制藥、建材、農藥、造紙、煤氣、電子、紡織、染料、塑料和焦化等工業(yè)的迅速發(fā)展，高氨氮廢水排放量急劇增加，逐漸成為當前水體的主要污染源之一。高氨氮廢水的成分非常復雜，一旦排入水體中，不僅造成水體的富營養(yǎng)化，水生環(huán)境的惡化，同時也對人體健康造成嚴重危害。近年來，高氨氮廢水的生物處理被認為是廢水脫氮最具發(fā)展前景的方法之一，傳統(tǒng)的生物脫氮是通過硝化、反硝化作用將有機氮、氨氮經過一系列反應轉化為氮氣從水中去除的過程。其中反硝化是脫氮中較為關鍵的一步，反硝化菌種在有氧條件下會優(yōu)先利用氧進行呼吸，阻止硝酸鹽和亞硝酸鹽作為最終的電子受體，同時氧分子也對反硝化還原酶產生抑制作用[1]，從而反硝化反應一直認為是嚴格厭氧的過程。但是硝化是需氧的過程，因此傳統(tǒng)生物脫氮的過程通常是在兩個反應池中進行而且反硝化反應單元需要嚴格厭氧，因此大大增加了污水處理的成本和技術難度。在20世紀80年代，Robertson和Knenen[2]報道好氧反硝化菌以及好氧反硝化酶系為解決上述問題提供了新的思路。好氧反硝化菌可直接利用硝化產物作為反硝化底物，不但提高脫氮效率，同時也降低運行成本。迄今為止，對高氨氮廢水生物處理系統(tǒng)中好氧反硝化菌種的篩選與培養(yǎng)僅基于常規(guī)分離培養(yǎng)方法，但其最高僅能獲得10%的微生物菌群，大量的潛在功能菌群因處于活的但非可培養(yǎng)(viable but non-culturable，VBNC)狀態(tài)而未被研究[3-5]。因此復蘇培養(yǎng)作為絕大部分微生物資源的VBNC菌群，可為尋找高效脫氮微生物資源提供新的途徑，同時也可為防止脫氮菌進入VBNC狀態(tài)以發(fā)揮更好的脫氮性能提供新的思路。

藤黃球菌(Micrococcusluteus)所分泌的復蘇促進因子(resuscitation-promoting factor，Rpf)的發(fā)現(xiàn)被認為是復蘇培養(yǎng)VBNC狀態(tài)菌最重要的突破。Rpf在皮摩爾濃度下即可使自身處于VBNC狀態(tài)的細胞復活，并使可培養(yǎng)數(shù)量增長至100倍以上，且可促進細胞的生長[6]。研究發(fā)現(xiàn)制藥廢水中對Rpf敏感的VBNC優(yōu)勢菌群主要有革蘭氏陽性(G+)菌如Microbacterium、Gordonia和Leucobacter屬等，及革蘭氏陰性(G-)菌如Candidimonas、Xanthobacter和Aminobacter屬等。另外，我們前期利用藤黃球菌Rpf從森林、海島、沙漠土壤、城市和富營養(yǎng)化污水，以及印染、制藥、農藥和焦化廢水等樣品中復蘇培養(yǎng)VBNC菌近60多屬100余種，并已登陸至國際基因庫DDBJ。而且經后期研究進一步發(fā)現(xiàn)Rpf蛋白不僅對親緣關系較近的革蘭氏陽性(G+)菌有較好的復蘇促進功能，對親緣關系較遠的少數(shù)革蘭氏陰性(G-)菌屬中部分難培養(yǎng)菌種也有生長促進作用，且多數(shù)菌株具有脫氮、除磷、除臭、絮凝、降解持久性有機污染物(POPs)等環(huán)境功能。

鑒于此，本文利用藤黃球菌Rpf蛋白復蘇培養(yǎng)高氨氮廢水中的VBNC菌種，并通過測定反硝化液體培養(yǎng)基中的硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮、氨氮的濃度，研究VBNC菌種的好氧反硝化性能，從而為尋找高效好氧反硝化菌提供新的途徑。同時也為挖掘污染環(huán)境中難培養(yǎng)及VBNC狀態(tài)微生物的潛在環(huán)境功能提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.2 儀器

紫外分光光度計(UV-7504，上海欣茂儀器有限公司)；恒溫培養(yǎng)振蕩器(ZHWY-100C上海智誠儀器分析制造公司)；臺式離心機(5417R，Eppendorf)；恒溫恒濕培養(yǎng)箱(HWS-350，寧波海曙塞富實驗儀器廠)；電子天平(JY3002，上海精密科學儀器有限公司)；移液槍(P500，Eppendorf)；電熱鼓風干燥箱(DHG-9070A，上海一恒科學儀器有限公司)。

1.3 培養(yǎng)基

1)MPN培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物0.5 g，蛋白胨5 g，NaCl 2.5 g，葡萄糖5 g，苯乙醇3 mL，pH調至7.0，固體培養(yǎng)基需加入1.5%～2%的瓊脂粉。

2)SOB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨20 g，酵母粉5 g，NaCl 0.5 g，250 mmol/L KCl溶液10 mL，pH調至7.0，該溶液使用前需加入2 mol/L MgCl25 mL。

3)好氧反硝化培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖1 g，亞硝酸鈉0.98 g或硝酸鈉1.21 g，KH2PO41 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，pH調至7.0。

4)氨氮降解能力鑒定培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖1 g，(NH4)2SO40.17 g，NaCl 0.3 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，CaCO37.5 g。

2 實驗方法

2.1 Rpf蛋白純化

將M.luteus的rpf基因克隆在EscherichiacoliBL21 (DE3)中誘導表達，經純化后獲得Rpf蛋白[7]。

具體步驟簡述如下：將質粒轉化的EscherichiacoliBL21(DE3)接種至含有50 mg/L相應抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，120 r/min培養(yǎng)至對數(shù)生長期，然后再接種至200 mL SOB培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，確認轉化細菌濃度為OD600=0.6時，加入IPTG誘導劑至終濃度為1 mmol/L，20 ℃，120 r/min誘導過夜。

離心(12 000 r/min，10 min)收集細胞，加入緩沖液重懸菌體，并超聲破碎使得蛋白釋放出來。經Ni柱吸附，100 mmol/L的咪銼洗脫液洗脫后，再利用純化試劑盒對目的蛋白進行純化。提純的Rpf蛋白經0.22 μL微孔濾膜過濾后，加甘油至終濃度為50%，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r，將Rpf蛋白高壓滅活(121 ℃，20 min)用于對照組的實驗研究。

2.2 Rpf蛋白對VBNC菌的復蘇促進作用

MPN培養(yǎng)體系中，吸取1 mL采自于污水處理廠的高氨氮廢水加入至9 mL LB液體培養(yǎng)基中，而后依次稀釋，連續(xù)設置10個稀釋梯度，每一個梯度設立3個平行。在各處理組稀釋液均添加0.25% Rpf蛋白，對照組各稀釋液添加0.25%無活性Rpf蛋白上清液，將樣品放置在30 ℃，120 r/min培養(yǎng)體系中生長。通過測定處理組與對照組培養(yǎng)液菌體密度(OD600)來反映Rpf對菌體生長狀況的影響。同時記錄樣品的濁度以獲得MPN值，利用MPN表計算出每個樣品中可培養(yǎng)細菌的總數(shù)。

當細菌總數(shù)處于穩(wěn)定，將處理組與對照組培養(yǎng)液最大稀釋度分別涂布于固體平板中獲得可培養(yǎng)細菌。對比兩組涂布平板的菌落差異，僅存在于處理組的菌株則為對Rpf蛋白敏感的VBNC菌。將純化后的的菌株擴大培養(yǎng)并收集至10%的甘油中，-80 ℃保存。每種稀釋度的剩余培養(yǎng)液則放至-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 菌株16S rRNA鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

將獲得的VBNC菌株接種至LB液體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)過夜。采用Ezup柱式細菌基因組抽提試劑盒提取各單菌株的DNA。然后進行菌株16S rRNA基因的擴增。PCR反應體系50 μL包括：EasyTaq SuperMix：25 μL，引物設計為8F (5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′)和1510R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)各1 μL，模板DNA 2 μL，去離子水21 μL。PCR反應條件為：95 ℃預變性4 min，95 ℃變性3 min，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，進行30個循環(huán)，72 ℃終延伸5 min，4 ℃保持。擴增片段約為1 450 bp。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物后送至上海生工進行16S rRNA基因測序。將得到基因序列與Genbank (http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov)中相似序列進行Blast比對分析，利用MEGA 7.0軟件進行序列同源性分析，采用鄰接法(NJ)構建系統(tǒng)發(fā)育樹[8]。

2.4 菌種反硝化性能測定

將所獲的VBNC菌株挑取單菌落接種到5 mL LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃，120 r/min搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長期，然后將其接種至好氧反硝化培養(yǎng)基中，每隔20 h取樣測定培養(yǎng)基中的氨氮、硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮的濃度，數(shù)據(jù)重復測定3次。

總氮濃度測定采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法[9]；氨氮濃度測定采用納氏試劑法[9]；硝態(tài)氮測定采用酚二磺酸分光光度法[9]；亞硝態(tài)氮測定采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法[9-10]。

3 實驗結果分析

3.1 SDS-PAGE驗證Rpf蛋白

M.luteusrpf基因經克隆，并在EscherichiacoliBL21 (DE3)中誘導表達及系列純化后，獲得Rpf重組蛋白。結果如圖1所示，由SDS-PAGE圖可知，蛋白洗脫液中含有清晰的目的條帶，重組蛋白的分子量約為23 kDa，且雜條帶數(shù)量相較于粗體液明顯減少，說明經Ni柱洗脫后得到了純度較高的Rpf蛋白。

本研究中所獲的重組蛋白的分子量相對于Mukamolova等[6]從藤黃球菌上清液中分離提取的Rpf蛋白(16～17 kDa)偏大，其原因為此重組蛋白未去除N端的6個His標簽。同時，與Mukamolova等[4]所獲的重組蛋白分子量(25 kDa)相當。

3.2 MPN值及Rpf蛋白效應

每隔24 h記錄MPN培養(yǎng)體系中處理組和對照組在600 nm處的光密度值。當數(shù)值趨于穩(wěn)定后，讀取MPN值。在培養(yǎng)體系中，處理組最后3個稀釋度分別有3個，3個和2個渾濁管，對照組分別有3個，3個和1個渾濁管，透明管意味著其OD600值接近于0。在各稀釋度中，處理組的菌體生長量均大于對照組，尤其是在最后的稀釋度(10-5)中，這表明Rpf可促進細菌的生長。

M：蛋白質標記物；1-2條帶：純化的重組Rpf；3-4條帶：來自大腸桿菌(DE3)的粗提物。圖1 藤黃球菌rpf基因在Escherichia coli BL21 (DE3)融合表達蛋白的SDS-PAGE圖Fig.1 SDS-PAGE results of rpf gene in the Escherichia coli BL21 (DE3) fusion expression

通過查閱MPN表所得處理組細菌總數(shù)為1.1×107cells/mL，對照組細胞總數(shù)為4.6×106cells/mL，如圖2所示，通過添加Rpf，細菌的數(shù)量增加58.1%，此結果表明約58.1%的細胞因處于VBNC狀態(tài)而無法用常規(guī)平板分離法培養(yǎng)獲得。

圖2 基于MPN法計算Rpf對VBNC菌復蘇的效果Fig.2 Effect of Rpf on the resuscitation of VBNC bacteria calculated using the MPN method

3.3 16S rDNA序列同源性分析

利用Rpf從高氨氮廢水中復蘇培養(yǎng)4株VBNC菌種，分別命名為ZYR51、CHZYN52、CHZYR61和CHZYR63?；?個菌株的16S rRNA基因序列，依據(jù)Blast比對結果與Genbank 數(shù)據(jù)庫中已有相似度較高菌種共同構建系統(tǒng)發(fā)育樹。結果如圖3所示，菌株ZYR51與Gordoniasp. VT40(相似性為99%)聚成一支，且與Rpf產生菌株Micrococcusluteus具有較高的同源性。CHZYN52、CHZYR61和CHZYR63菌株與假單胞菌屬(Pseudomonas)具有較近的親緣關系，穩(wěn)定性較高。由此可以初步確定ZYR51菌株屬于Gordonia屬，CHZYN52、CHZYR61和CHZYR63菌株均屬于Pseudomonas屬。此結果與前期的研究結果有較好的一致性，如Jin等[11]利用Rpf蛋白從高濃度印染廢水中復蘇獲得多株VBNC菌種，發(fā)現(xiàn)對Rpf蛋白敏感的優(yōu)勢菌種分別歸屬于Gordonia、Lysinibacillus、Bacillus、Pseudomonas和Moraxella屬，且所獲得VBNC菌種對廢水中的難降解有機污染物具有較強的降解性能。同時，已有研究表明Gordonia屬具有較強的脫氮、脫硫的能力[12-13]。如Chen等[14]利用Gordoniasp. JW8處理制漿造紙廢水，結果顯示廢水中的含氮有機污染物與對照組相比可達到最佳處理效果。另外，Pseudomonas屬的菌種所具有的脫氮功能也被廣泛報道[15-17]。如胡朝松等[18]從海洋沉積物中分離得到1株Pseudomonas屬菌株F-8-1，該菌株能通過反硝化作用有效降低硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮含量，在5 d內含氮污染物的去除率可達90%。本研究利用Rpf復蘇VBNC菌種所獲得的Gordonia屬菌株ZYR51和Pseudomonas屬菌株CHZYN52、CHZYR61和CHZYR63。本研究不僅為挖掘新高效好氧反硝化微生物資源提供新的途徑，并為重新評價微生物在生物脫氮過程中的作用提供一定理論依據(jù)。

圖3 基于16S rRNA基因序列構建的復蘇菌種的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 A phylogenetic tree of the resuscitated strains constructed on the basis of the 16S rRNA gene sequence

3.4 VBNC菌種的反硝化能力

將復蘇的VBNC菌株接種至好氧反硝化培養(yǎng)基中，每隔20 h測定培養(yǎng)基中各個指標的含量變化，結果如圖4(a)所示，菌株在經歷一段時間的延滯期后開始迅速生長，此時培養(yǎng)基中的硝態(tài)氮含量明顯下降，脫氮效率在此階段達到最大值。通過對接入不同菌株的硝態(tài)氮好氧反硝化培養(yǎng)基中總氮的變化趨勢進行分析，如圖4(b)所示，在140 h之內接入ZYR51菌株的好氧反硝化培養(yǎng)基相比其他實驗組總氮含量較低，下降至90 mg/L，總氮去除率高達55%。一般認為生物同化作用利用的氮不會超過總氮的20%，菌種ZYR51的脫氮能力較為顯著。

好氧反硝化培養(yǎng)基中的亞硝態(tài)氮含量變化如圖4(c)所示，各菌株的亞硝態(tài)氮含量呈現(xiàn)下降趨勢。表明在該種培養(yǎng)基中存在好氧反硝化作用。

復蘇的VBNC菌種在好氧反硝化培養(yǎng)基中測定硝態(tài)氮、總氮、亞硝態(tài)氮和氨氮的質量濃度變化：(a)為硝態(tài)氮，(b)為總氮，(c)為亞硝酸鹽氮，(d)為氨氮。圖4 好氧反硝化培養(yǎng)基中各指標的動態(tài)變化Fig.4 Dynamic changes of the indicators in aerobic denitrification medium

分離的菌株既可以硝態(tài)氮也可以亞硝態(tài)氮為底物進行反硝化作用(圖4(a)和圖4(c))。這與好氧反硝化菌株能直接利用硝化產物作為反硝化底物的特性有關[19]。

為進一步研究各菌株的氨氮降解特性，將菌株接種至以(NH4)2SO4為唯一氮源的氨氮降解能力鑒定培養(yǎng)基中，結果如圖4(d)所示，氨氮含量在0～60 h快速下降，在60 h后含量下降趨于穩(wěn)定，各個菌株的氨氮去除率維持在85%～86%，其中ZYR51的氨氮質量濃度從35 mg/L下降至4.66 mg/L，其氨氮去除率高達86.7%。孫慶花等[20]報道在海底沉積物中分離篩選獲得1株克雷伯氏菌屬(Klebsiella)菌株y5，在未優(yōu)化條件時，其氨氮去除率為60%，但在最適條件下氨氮的去除率可達到100%。張峰峰等[21]在水產養(yǎng)殖環(huán)境中分離出具有較強反硝化性能的菌株DB-33，在48 h內氨氮的去除率可達到51.52%。本實驗分離得到的菌株ZYR51在120 h內氨氮的去除率可達86.7%。綜上可知，菌株ZYR51具有較強的氨氮去除性能。

4 結論

1)本研究表明高氨氮廢水中存在大量對Rpf敏感的VBNC細菌，其數(shù)量占總菌數(shù)的58.1%。并分離純化4株VBNC菌株，其中ZYR51歸屬于Gordonia屬，菌株CHZYN52、CHZYR61和CHZYR63均歸屬于Pseudomonas屬。

2)本研究表明Pseudomonas和Gordonia屬可能為高氨氮廢水中存在的主要VBNC功能菌群，經Rpf復蘇后具有較好的好氧反硝化性能。

3)本研究揭示在高氨氮廢水中，與藤黃球菌具有較好親緣關系的Gordonia屬菌株ZYR51的脫氮性能最強。從而為挖掘高效好氧反硝化菌提供新的思路。