廖志文，周建榮，帥 萍，韓巧秀，文慧蘭

(贛南醫(yī)學(xué)院 1.2018級(jí)碩士研究生；2.第一附屬醫(yī)院 a.呼吸內(nèi)科；b.病理科，江西 贛州 341000)

肺癌已經(jīng)成為目前我國發(fā)病率及死亡率最高的惡性腫瘤[1-2]，特別是非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)[3]。肺癌因缺乏典型早期臨床癥狀而難以被發(fā)現(xiàn)，70%的患者在初次就診時(shí)就已經(jīng)處于肺癌晚期而無法進(jìn)行手術(shù)治療[4-5]，再加上晚期肺癌患者大多全身狀況較差，無法耐受創(chuàng)傷較大的方式以獲得足量的用于檢測EGFR突變的腫瘤組織，而不能達(dá)到組織病理學(xué)診斷的準(zhǔn)確性。近年來針對(duì)檢測ERFG突變的非侵入性檢測技術(shù)研究已有很大的進(jìn)展，許多研究表明癌性胸水的檢驗(yàn)效能與腫瘤組織相當(dāng)[6]。

FISH檢測技術(shù)可以用于檢測癌癥發(fā)生和發(fā)展過程中的染色體改變，對(duì)確定新的抗癌藥物的靶點(diǎn)具有重要意義[7]。目前FISH檢測技術(shù)在國內(nèi)國外應(yīng)用已較成熟，用于檢測肺癌腫瘤組織中EGFR基因擴(kuò)增的研究已有許多[8-9]。而晚期肺癌腫瘤組織往往獲取較困難，獲取患者胸水通常容易、安全。本研究利用癌性胸水中脫落癌細(xì)胞或轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞中具有與原發(fā)腫瘤組織的相同的基因組DNA，將收集的癌性胸水制成細(xì)胞蠟塊，通過免疫組織化學(xué)特異性標(biāo)記法確定病理類型，同時(shí)應(yīng)用FISH技術(shù)檢測腫瘤細(xì)胞基因組DNA EGFR基因擴(kuò)增情況，探討晚期肺癌患者癌性胸水對(duì)于其臨床診斷分型及基因檢測的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1材料贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科門診及住院部先后通過組織及細(xì)胞學(xué)病理確診為非小細(xì)胞肺癌伴有惡性胸水的60歲及以上患者30例,每例均有組織學(xué)免疫組化結(jié)果及EGFR基因檢測結(jié)果對(duì)照，免疫組化所需TIT-1、Vim、CK、CK7、CEA、p63、LCA、CD56、Syn等抗體， AxyPrep Multisource Genomic DNA Miniprep Kit，tiangen-genomic DNA Kit。

1.2方法

1.2.1胸水細(xì)胞塊制備(1)取約12 mL癌性胸水至離心管，至離心機(jī)離心，棄上清；(2)加入4%甲醛，震蕩；(3)靜置30 min，離心，棄上清，顯微鏡擦鏡紙包埋沉渣，4%甲醛固定，取材，脫水，制成石蠟細(xì)胞塊。

1.2.2免疫組織化學(xué)染色法(1)脫蠟水洗，3%雙氧水處理，蒸餾水沖洗；(2)高壓修復(fù)，緩慢降溫；(3)一抗、二抗孵育；(4)DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，封片，顯微鏡下觀察。操作均由我院病理科醫(yī)生完成。

1.2.3蠟塊標(biāo)本FISH檢測操作步驟

1.2.3.1玻片預(yù)處理(1)65 ℃恒溫箱烤片過夜；(2)取出后依次浸入室溫二甲苯Ⅰ 15 min，二甲苯Ⅱ 15 min，100%乙醇Ⅰ 10 min，100%乙醇Ⅱ 3 min，85%乙醇3 min，70%乙醇3 min，純化水3 min；(3)100 ℃純化水煮片25 min，室溫晾干；(4)滴加胃蛋白酶反應(yīng)液，靜置10 min；(5)再依次浸入洗液Ⅰ(2×SSC)5 min，70%乙醇 3 min，80%乙醇3 min，100%乙醇脫水3 min，室溫晾干。

1.2.3.2樣品和探針同時(shí)變性(1)玻片去蓋玻片后依次浸入37 ℃洗液Ⅰ(2×SSC)10 min，37 ℃洗液Ⅱ(0.1%NP-40/2×SSC)5 min，70%乙醇3 min；(2)取出，暗處晾干；(3)滴加10 μL DAPI復(fù)染劑，上蓋玻片，存放待觀察。

1.3試驗(yàn)結(jié)果的判定統(tǒng)計(jì)GSP EGFR信號(hào)≥4個(gè)的細(xì)胞占統(tǒng)計(jì)總細(xì)胞的百分比，再計(jì)算所有細(xì)胞GSP EGFR信號(hào)總數(shù)與CSP7信號(hào)數(shù)的比率。當(dāng)如下情況時(shí)：①≥40%的細(xì)胞出現(xiàn)≥4個(gè)EGFR信號(hào)；②GSP EGFR/CSP(紅色/綠色)≥2，同時(shí)，用于計(jì)數(shù)的核中CSP7信號(hào)≥2；③≥10%的細(xì)胞出現(xiàn)≥4個(gè)EGFR信號(hào)族；④≥10%的細(xì)胞出現(xiàn)>15個(gè)EGFR信號(hào)；若滿足情況①、或②、或③、或④時(shí)判定為FISH陽性(EGFR基因突變陽性)；不滿足上述情況判定為FISH陰性(EGFR基因突變陰性)。

2 結(jié) 果

2.1免疫組化的病理診斷結(jié)果30例NSCLC老年患者胸水細(xì)胞蠟塊免疫組化結(jié)果判定方法與常規(guī)病理組織學(xué)相同。胸水細(xì)胞蠟塊與相應(yīng)腫瘤組織免疫組化診斷病理類型結(jié)果相同，其中15例CK7、TIT-1均呈強(qiáng)陽性表達(dá)的診斷為肺腺癌，有13例p63強(qiáng)陽性表達(dá)為肺鱗癌，2例為其他類型NSCLC。

2.2EGFR基因突變檢測結(jié)果采用免疫熒光原位雜交(FISH)方法對(duì)30例NSCLC老年患者胸水細(xì)胞蠟塊及相應(yīng)組織塊進(jìn)行檢測，出現(xiàn)EGFR基因擴(kuò)增定義為EGFR基因突變陽性，即FISH陽性，無EGFR基因擴(kuò)增定義為EGFR基因突變陰性，即FLSH陰性。30例胸水細(xì)胞蠟塊中有14例FISH陽性，陽性率46.7%，其中肺腺癌7例， 肺鱗癌6例，其他類型NSCLC 1例；相應(yīng)的組織學(xué)檢測FISH陽性15例，F(xiàn)ISH陽性率50%，其中肺腺癌FISH陽性的有8例， 肺鱗癌中有6例和1例其他類型NSCLC；胸水細(xì)胞蠟塊與組織對(duì)比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，兩組EGFR基因擴(kuò)增一致率為93.5%。見表1。

表1 胸水細(xì)胞蠟塊與腫瘤組織塊的EGFR基因擴(kuò)增情況比較

3 討 論

表皮生長因子受體(EGFR)是細(xì)胞膜上一種主要用于調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、增殖、分化及抑制細(xì)胞凋亡的跨膜蛋白受體，癌細(xì)胞可能通過某些特定分子結(jié)合細(xì)胞膜上特定蛋白(EGFR)的異常增強(qiáng)表達(dá)而獲得自主和失調(diào)增殖的能力，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、血管生成和轉(zhuǎn)移。 EGFR基因在NSCLC的發(fā)生及發(fā)展中起著十分重要的作用，有研究表明， EGFR基因過度表達(dá)現(xiàn)象在肺癌中尤其在NSCLC多見，而SCLC少見[10]。

目前我國肺癌發(fā)病率在逐年上升，尤其以老年人(>60歲)高發(fā)[11]，而臨床中大部分肺癌患者確診時(shí)已是晚期，病程中將近超過50%的患者合并有惡性胸水，被診斷時(shí)約15%的患者就已出現(xiàn)胸水[12]，這些患者大都已失去了手術(shù)切除治療機(jī)會(huì)，而EGFR-TKIs靶向藥物治療已經(jīng)成為我們目前優(yōu)先考慮的治療方案，因此檢測EGFR基因突變狀態(tài)對(duì)于NSCLC患者具有十分重要的意義。以往的EGFR基因檢測多依賴于病理組織，目前已有許多研究表明，在胸水中檢測EGFR的突變研究是切實(shí)可行的[13-14]，癌性胸水中包含有腫瘤脫落細(xì)胞、轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞，具有與腫瘤組織中相同基因組，利用精密的檢測方法是能夠檢測出胸水中的基因組。

免疫組化是利用免疫學(xué)抗原抗體特異性反應(yīng)的基本原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原，對(duì)其進(jìn)行定位、定性及相對(duì)定量的研究。目前免疫組化技術(shù)已經(jīng)被廣泛認(rèn)可，并且已廣泛應(yīng)用于醫(yī)院臨床肺癌的病理診斷分型。并且IHC在對(duì)于低分化肺癌或小標(biāo)本中進(jìn)行分型具有較好的優(yōu)勢(shì)。2011年國際肺癌研究協(xié)會(huì)、美國胸科學(xué)會(huì)及歐洲呼吸學(xué)會(huì)(IASLC/ATS/ERS)就推薦肺癌的病理分型應(yīng)同時(shí)進(jìn)行HE染色及IHC[15],特別是對(duì)于小標(biāo)本和細(xì)胞學(xué)組織。本研究利用胸水制成胸水細(xì)胞塊，較好的保持了癌細(xì)胞大部分的生物學(xué)特征，具有與組織腫瘤細(xì)胞相同抗原成分，較好的適用于免疫組化。結(jié)果有15例(50%)出現(xiàn)CK7、TIT-1均呈強(qiáng)陽性表達(dá)，13例(43.3%)p63呈彌漫性強(qiáng)表達(dá)，2例(6.7%)TIT-1、p63均呈陰性，診斷結(jié)果中非小細(xì)胞肺癌各病理類型所占比例與文獻(xiàn)報(bào)道有一定的偏差可能與取樣例數(shù)有關(guān)。

熒光原位雜交(FISH)目前已廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)檢測，操作上較為簡便，而且有較好的可重復(fù)性，在靈敏性及特異性方面也有較突出的優(yōu)點(diǎn)。在早些年就有研究指出，F(xiàn)ISH技術(shù)可以作為傳統(tǒng)診斷的輔助手段[16]。近年來國內(nèi)外熒光原位雜交(FISH)檢測肺癌EGFR基因的研究已較廣泛的應(yīng)用，但比較多用的還是肺癌活檢或手術(shù)組織標(biāo)本，而對(duì)于晚期肺癌患者腫瘤組織常獲取困難，胸水獲取容易且安全。本研究利用癌性胸水與原發(fā)腫瘤具有共同基因組成分，對(duì)胸水中脫落癌細(xì)胞及轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞進(jìn)行收集制成細(xì)胞塊，分別進(jìn)行免疫組化染色診斷分型及EGFR基因突變檢測。本研究結(jié)果顯示胸水細(xì)胞蠟塊在進(jìn)行免疫組化及EGFR基因檢測與腫瘤組織相比具有較高的準(zhǔn)確性、相似性，一致率為93.3%。本研究用于制作細(xì)胞蠟塊的胸水必須為癌性胸水，適用于臨床中因一般情況較差或其他原因造成病理組織獲取困難的肺癌晚期患者，特別是有少數(shù)肺癌患者只表現(xiàn)為惡性胸水而未發(fā)現(xiàn)原發(fā)腫瘤。結(jié)果中胸水細(xì)胞塊與組織學(xué)對(duì)比有1例不一致，可能是胸水中癌細(xì)胞數(shù)目較少而影響檢測，在試劑盒提取DNA過程中可能因部分胸水中混入過多紅細(xì)胞，還有部分胸水放置時(shí)間過久，導(dǎo)致提取量下降而影響檢測效果。

綜上所述，胸水細(xì)胞蠟塊對(duì)于FISH檢測EGFR基因擴(kuò)增情況具有較好的準(zhǔn)確性，為合并有癌性胸水的肺癌患者提供一種無創(chuàng)、有效的診斷分型及EGFR基因檢測的途徑，同時(shí)為臨床選擇EGFR-TKIs靶向藥物治療提供分子病理學(xué)依據(jù)。