王 超，袁 宇

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，河南 衛(wèi)輝 453100)

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(coronary atherosclerotic heart disease，CAHD)是造成人類死亡的主要原因之一。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群失調(diào)與CAHD、高血壓、心力衰竭、慢性腎臟疾病、2型糖尿病、腦梗死、肥胖等疾病有關(guān)[1-3]，腸道菌群豐度與血脂水平相關(guān)[4]。胡海兵等[5]研究發(fā)現(xiàn)，CAHD受試者較非CAHD受試者腸道致病菌數(shù)目增多，有益菌數(shù)目減少。任科雨等[6]對(duì)青島市高尿酸血癥受試者腸道菌群的研究顯示，糞便菌群的尿酸(uric acid，UA)處理能力與乳酸桿菌及雙歧桿菌含量有關(guān)。但目前血脂、血UA水平與CAHD患者腸道菌群豐度的關(guān)系尚不明確。本研究通過高通量測(cè)序方法探討CAHD患者腸道菌群豐度與血脂、血UA水平的關(guān)系，旨在為CAHD的診治提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2016年9月至2017年11月新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科收治的疑似CAHD且行冠狀動(dòng)脈造影檢查者106例為研究對(duì)象，受試者均為豫北居民，且滿足以下條件：(1)無(wú)消化道手術(shù)史及器質(zhì)性病變；(2)無(wú)肝腎疾??；(3)無(wú)心血管疾病史；(4)無(wú)感染；(5)無(wú)酗酒史；(6)1個(gè)月以內(nèi)未使用任何影響腸道菌群及血脂的藥物；(7)無(wú)糖尿病及致腸道菌群失調(diào)的其他問題。所有受試者根據(jù)冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果進(jìn)行分組，其中冠狀動(dòng)脈造影顯示左主干、前降支、回旋支、右冠狀動(dòng)脈至少有1支或其大分支內(nèi)徑狹窄≥50%者列為CAHD組，其余列為對(duì)照組。CAHD組68例，男54例，女14例，年齡37～75(60.23±11.26)歲；體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)18.5～23.9(26.84±3.15)kg·m-2；高血壓50例，有吸煙史47例。對(duì)照組38例，男30例，女8例，年齡33～71(61.55±10.99)歲；BMI 18.5～23.0(26.26±3.64)kg·m-2；高血壓28例，有吸煙史26例。2組受試者年齡、性別、BMI、高血壓、吸煙史比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，受試對(duì)象均知情并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器血脂、血UA測(cè)定試劑(北京九強(qiáng)生物技術(shù)股份有限公司)，細(xì)菌DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)，MetaVxTM文庫(kù)構(gòu)建試劑盒(美國(guó)GENEWIZ公司)；全自動(dòng)生物化學(xué)分析儀(日本日立公司)，Qubit 2.0 Fluorometer(美國(guó)Invitrogen公司)，Agilent 2100 生物分析儀(美國(guó)Agilent Technologies公司)，Illumina MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái)(美國(guó)Illumina公司)。

1.3 2組受試者血脂和血UA水平檢測(cè)2組受試者均于入院次日清晨空腹抽取肘靜脈血10 mL，使用全自動(dòng)生物化學(xué)分析儀檢測(cè)血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglycerides，TG)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)及UA水平。

1.4 糞便采集及腸道菌群DNA提取2組受試者均于治療前收集新鮮糞便樣本，每人5 g，置于清潔干燥糞便收集管，封口后于冰盒保存，5 h內(nèi)提取樣本總DNA，并置于-80 ℃冰箱保留，使用北京天根生化科技有限公司的細(xì)菌DNA提取試劑盒提取細(xì)菌DNA。

1.5 腸道菌群的高通量測(cè)序由GENEWIZ(蘇州)公司采用Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序和高通量測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建。雙端測(cè)序得到的正反向reads首先進(jìn)行兩兩組裝連接，過濾拼接結(jié)果中含有N的序列，保留序列長(zhǎng)度>200 bp的序列。經(jīng)過質(zhì)量過濾，去除嵌合體序列，最終得到的序列用于可操作分類單元(operational taxonomic units,OTU)分析，使用VSEARCH(1.9.6)進(jìn)行序列聚類(序列相似性設(shè)為97%)，比對(duì)的16S rRNA參考數(shù)據(jù)庫(kù)為 Silva 123。對(duì)代表性序列進(jìn)行物種分類學(xué)分析，并在不同物種分類水平下統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣本的群落組成。使用ANOVA法計(jì)算CAHD組與對(duì)照組在不同分類層次上菌群的豐度差異。

2 結(jié)果

2.1 2組受試者血脂及血UA水平比較結(jié)果見表1。與對(duì)照組受試者比較，CAHD組受試者血清UA、TC、LDL水平顯著升高，HDL水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；2組受試者血清TG水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 2組受試者血清血脂及血尿酸水平比較

組別nUA/(mmol·L-1)HDL/(mmol·L-1)TC/(mmol·L-1)TG/(mmol·L-1)LDL/(mmol·L-1)對(duì)照組38311.56±63.181.68±0.213.64±0.531.75±0.242.26±0.51CAHD組68374.64±56.16a1.06±0.10a4.72±0.85a1.81±0.312.84±0.43a

注：與對(duì)照組比較aP<0.05。

2.2 2組受試者腸道菌群豐度比較

2.2.1 2組受試者腸道菌群門水平豐度比較結(jié)果見表2。2組受試者腸道菌群在門水平上共檢測(cè)到擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門、梭桿菌門、放線菌門、軟壁菌門、互養(yǎng)菌門、廣古菌門8個(gè)菌門。與對(duì)照組相比，CAHD組受試者擬桿菌門細(xì)菌豐度減小，厚壁菌門細(xì)菌豐度增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；2組受試者變形菌門、梭桿菌門、放線菌門、軟壁菌門、互養(yǎng)菌門、廣古菌門細(xì)菌豐度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。2組受試者擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門、放線菌門的檢出率均為100%；對(duì)照組梭桿菌門、軟壁菌門、互養(yǎng)菌門、廣古菌門檢出率分別為57.9%(22/38)、13.2%(5/38)、13.2 %(5/38)、5.3%(2/38)，CAHD組受試者梭桿菌門、軟壁菌門、互養(yǎng)菌門、廣古菌門檢出率分別為58.8%(40/68)、14.7%(10/68)、11.8 %(8/68)、5.9%(4/68)，2組受試者梭桿菌門、軟壁菌門、互養(yǎng)菌門、廣古菌門檢出率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.009、0.000、0.000、0.000，P>0.05)。

表2 2組受試者腸道菌群門水平豐度比較

組別n豐度擬桿菌門厚壁菌門變形菌門梭桿菌門放線菌門軟壁菌門互養(yǎng)菌門廣古菌門對(duì)照組3822264.8±1203.211583.4±926.1 3064.2±101.51562.4±66.9468.4±72.529.8±5.316.2±5.93.7±0.4CAHD組6814472.8±1041.3a17590.9±1154.8a2526.3±85.71354.5±73.5396.3±64.132.2±6.713.4±1.12.6±0.2

注:與對(duì)照組比較aP<0.05。

2.2.2 2組受試者腸道菌群綱水平豐度比較結(jié)果見表3。2組受試者腸道菌群均檢測(cè)到15個(gè)菌綱。CAHD組受試者的β-變形菌綱細(xì)菌豐度小于對(duì)照組，梭菌綱細(xì)菌豐度大于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2組受試者β-變形菌綱、梭菌綱細(xì)菌檢出率均為100%。

表3 2組受試者腸道菌群綱水平豐度比較

組別n豐度梭菌綱β-變形菌綱對(duì)照組387270.2±312.4855.3±82.7CAHD組6813868.6±1085.7a245.5±34.5a

注:與對(duì)照組比較aP<0.05。

2.2.3 2組受試者腸道菌群目水平豐度比較結(jié)果見表4。2組受試者腸道菌群均檢測(cè)到19個(gè)菌目。其中CAHD組受試者擬桿菌目、Burkholderiales目、雙歧桿菌目、乳酸桿菌目細(xì)菌豐度小于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2組受試者擬桿菌目、Burkholderiales目、雙歧桿菌目、乳酸桿菌目細(xì)菌檢出率均為100%。

表4 2組受試者腸道菌群目水平豐度比較

組別n豐度擬桿菌目Burkholderiales目雙歧桿菌目乳酸桿菌目對(duì)照組3821358.1±917.6834.6±58.1752.8±84.7256.4±52.4CAHD組6813911.6±843.5a243.3±46.9a333.6±73.1a162.6±62.4a

注:與對(duì)照組比較aP<0.05。

2.2.4 2組受試者腸道菌群科水平豐度比較結(jié)果見表5。2組受試者腸道菌群均檢測(cè)到35個(gè)菌科。其中CAHD組受試者消化鏈球菌科、Erysipelotrichaceae科細(xì)菌豐度大于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2組受試者消化鏈球菌科、Erysipelotrichaceae科細(xì)菌檢出率均為100%。

表5 2組受試者腸道菌群科水平豐度比較

Tab.5 Comparison of bacterial family-abundance between the two groups

組別n豐度消化鏈球菌科Erysipelotrichaceae科對(duì)照組3856.2±6.310.2±1.1CAHD組6884.2±8.9a133.8±22.4a

注:與對(duì)照組比較aP<0.05。

2.2.5 2組受試者腸道菌群屬、種水平豐度比較結(jié)果見表6。2組受試者腸道菌群均檢測(cè)到99個(gè)菌屬。其中CAHD組受試者擬桿菌屬、Roseburia屬、乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬細(xì)菌豐度小于對(duì)照組(P<0.05)，Blautia屬、Odoribacter屬、Ruminococcus-2屬、Faecalibacterium屬、Alistipes屬、Subdoligranulum屬、埃希氏菌屬、Stercoris種細(xì)菌豐度大于對(duì)照組(P<0.05)。2組受試者中Blautia屬、擬桿菌屬、雙歧桿菌屬、Faecalibacterium屬、Subdoligranulum屬、埃希氏菌屬檢出率均為100.0%；對(duì)照組Odoribacter屬、玫瑰單胞菌屬、Ruminococcus-2屬、Alistipes屬、乳酸桿菌屬檢出率分別為81.6%(31/38)、94.7%(36/38)、100.0%(38/38)、92.1%(35/38)、55.3%(21/38)；CAHD組Odoribacter屬、玫瑰單胞菌屬、Ruminococcus-2屬、Alistipes屬、乳酸桿菌屬檢出率分別為63.2%(43/68)、94.1%(64/68)、98.5%(67/68)、66.2%(45/68)、60.3%(41/68)；2組受試者中玫瑰單胞菌屬、Ruminococcus-2屬、乳酸桿菌屬檢出率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.000、0.000、0.009，P>0.05)；CAHD組受試者Odoribacter屬、Alistipes屬細(xì)菌檢出率小于對(duì)照組(χ2= 3.892、8.853，P<0.05)。

表6 2組受試者腸道菌群屬、種豐度比較

細(xì)菌類別豐度對(duì)照組(n=38)CAHD組(n=68)Blautia屬24.6±6.2290.0±20.5aOdoribacter屬169.6±31.8205.4±54.7a擬桿菌屬18237.4±1361.29374.7±617.3a玫瑰單胞菌屬1481.4±106.4914.3±87.6a雙歧桿菌屬752.8±64.1333.6±36.7aRuminococcus-2屬93.5±11.7889.2±76.4aFaecalibacterium屬1274.2±178.92865.6±213.5aAlistipes屬741.2±41.41536.1±183.8aSubdoligranulum屬416.5±63.01024.2±100.1a埃希氏菌屬54.6±4.9378.7±69.9a乳酸桿菌屬5.9±0.83.1±0.3aStercoris種33.0±4.168.0±6.7a

注:與對(duì)照組比較aP<0.05。

2.3 血UA、TG、HDL及LDL水平與腸道細(xì)菌豐度的相關(guān)性結(jié)果見表7。2組受試者血UA水平與雙歧桿菌目、乳酸桿菌屬細(xì)菌豐度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.562、-0.112、-0.429、-0.045，P<0.05)，與埃希氏菌屬細(xì)菌豐度成正相關(guān)(r=0.781、0.193，P<0.05)，此相關(guān)性在CAHD組更顯著；CAHD組受試者血UA水平與Burkholderiales目細(xì)菌豐度呈正相關(guān)(r=0.716，P<0.05)，與乳酸桿菌目細(xì)菌豐度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.687，P<0.05)；但對(duì)照組UA水平與Burkholderiales目、乳酸桿菌目無(wú)相關(guān)性(r=0.658、0.562，P>0.05)。2組受試者血TG水平與擬桿菌目、Odoribacter屬細(xì)菌豐度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.761、-0.354、-0.323、-0.256，P<0.05)，與梭菌綱細(xì)菌豐度呈正相關(guān)(r=0.867、0.447，P<0.05)；CAHD組受試者血TG水平與Stercoris種細(xì)菌豐度呈正相關(guān)(r=0.258，P<0.05)。2組受試者血HDL水平與消化鏈球菌科、梭菌綱細(xì)菌豐度呈正相關(guān)(r= 0.650、0.146、0.597、0.012，P<0.05)，CAHD組受試者血HDL水平與軟壁菌門細(xì)菌豐度呈正相關(guān)(r=0.656，P<0.05)。2組受試者血LDL水平與消化鏈球菌科、梭菌綱細(xì)菌豐度均呈負(fù)相關(guān)(r= -0.497、-0.036、-0.839、-0.181，P<0.05)，此相關(guān)性在CAHD組更顯著。

表7 血UA、TG、HDL及LDL水平與腸道菌群豐度的相關(guān)性

Tab.7 Correlation between blood UA，TG，HDL，LDL levels and gut flora abundance

血液學(xué)指標(biāo)腸道菌群對(duì)照組(n=38)rPCAHD組(n=68)rPUABurkholderiales目0.6580.4210.7160.041雙歧桿菌目-0.1120.006-0.5620.028乳酸桿菌目0.5620.145-0.6870.014乳酸桿菌屬-0.0450.016-0.4290.013埃希氏菌屬0.1930.0410.7810.016TG梭菌綱0.4470.0120.8670.036擬桿菌目-0.3540.037-0.7610.023Odoribacter屬-0.2560.031-0.3230.043Stercoris種-0.5440.2540.2580.028HDL軟壁菌門-0.5220.2650.6560.045梭菌綱0.0120.0140.5970.034消化鏈球菌科0.1460.0320.6500.023LDL梭菌綱-0.1810.043-0.8390.013消化鏈球菌科-0.0360.028-0.4970.035

3 討論

CAHD為最常見的心血管疾病，發(fā)病率呈逐年增加的趨勢(shì)，發(fā)病年齡趨于低齡化[7]。目前，CAHD的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。血脂代謝異常、血UA異常與CAHD的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。1984年，有研究首次證明了降低TC和LDL膽固醇可以降低CAHD發(fā)病率和病死率[8]，血脂異常是CAHD的首要危險(xiǎn)因素。研究顯示，HDL水平越低，CAHD風(fēng)險(xiǎn)越大[9]。袁寧等[10]研究發(fā)現(xiàn)，CAHD患者血UA水平與CAHD病變程度呈正相關(guān)，是反映冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度的獨(dú)立指標(biāo)。研究顯示，血脂異常是青年急性心肌梗死的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[11]。本研究結(jié)果顯示，CAHD組患者TC、LDL、UA水平較對(duì)照組顯著增加，而HDL卻顯著下降。

成年人的腸道至少包含500種細(xì)菌微生物群，約含有1013到1014個(gè)微生物，腸道菌群失調(diào)與CAHD、高血壓、心力衰竭、慢性腎臟疾病、2型糖尿病、肥胖等疾病相關(guān)[1]。有研究指出，腸道菌群通過參與調(diào)節(jié)宿主膽固醇代謝、UA代謝等基礎(chǔ)代謝過程，從而影響CAHD的發(fā)生、發(fā)展[12]；膽堿、三甲胺氧化物(trimetlylamine oxide，TMAO)和甜菜堿3種腸道菌群代謝產(chǎn)物與心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，脂質(zhì)磷脂酰膽堿在腸道菌群作用下代謝產(chǎn)生三甲胺(trimethylamine，TMA)，TMA通過肝臟中的黃素單氧化酶轉(zhuǎn)化為TMAO釋放入血，改變膽固醇和膽汁酸的代謝，提高巨噬細(xì)胞的活性，從而加速動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程[13]。WANG等[13]、KUMMEN等[14]研究表明，TMAO可提高惡性心血管事件的發(fā)生率。2016年，王珊等[15]研究發(fā)現(xiàn)，TMAO與腸道菌群中的厭氧孢桿菌屬、梭菌屬、考拉桿菌屬、顫桿菌克屬及Alistipes屬有相關(guān)性。KELLY等[16]研究證實(shí)，腸道菌群的豐度與心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。本研究對(duì)比分析了CAHD組和對(duì)照組受試者的腸道菌群，發(fā)現(xiàn)2組受試者在2個(gè)門、2個(gè)綱、4個(gè)目、2個(gè)科、11個(gè)屬的菌群豐度上存在顯著差異，2組受試者腸道菌群的差異在擬桿菌門與厚壁菌門豐度上表現(xiàn)尤其明顯；在非門水平上，與對(duì)照組相比，CAHD組受試者擬桿菌屬、雙歧桿菌屬、雙歧桿菌目、擬桿菌目、乳酸桿菌目等有益菌豐度明顯降低；Ruminococcus-2屬、Blautia屬、Odoribacter屬、梭菌綱、消化鏈球菌科、Erysipelotrichaceae科、Stercoris種等致病菌的豐度明顯升高。此結(jié)果與胡海兵等[5]、CUI等[17]的結(jié)果不盡相同，這可能是由于研究對(duì)象的地域、飲食差異以及實(shí)驗(yàn)方法等所造成，但有益菌減少、致病菌增多的趨勢(shì)未發(fā)生變化。

一項(xiàng)對(duì)893例受試者血脂與腸道菌群的相關(guān)性研究提示，巴斯德氏菌科、Coprococcus屬、Collinsella屬與TG水平呈顯著相關(guān)，消化鏈球菌科、梭菌科與LDL水平呈顯著正相關(guān)[4]。周雪[18]在瑞舒伐他汀降脂效果與人微生態(tài)菌群相關(guān)性研究中發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用瑞舒伐他汀后低脂組受試者的腸道菌群與高脂組相比在門、科、屬水平上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究顯示，2組受試者血清HDL水平與消化鏈球菌科、梭菌綱細(xì)菌豐度均呈正相關(guān)；血清TG水平與擬桿菌目、梭菌屬細(xì)菌豐度呈負(fù)相關(guān)，與梭菌綱細(xì)菌豐度呈正相關(guān)；2組受試者血清LDL水平與消化鏈球菌科、梭菌綱細(xì)菌豐度呈負(fù)相關(guān)；以上相關(guān)性在CAHD組更顯著。另Stercoris種、軟壁菌門在對(duì)照組中與血清HDL、LDL、TG水平無(wú)顯著相關(guān)，但CAHD組受試者血TG水平與Stercoris種細(xì)菌豐度呈正相關(guān)，血HDL水平與軟壁菌門細(xì)菌豐度呈正相關(guān)。以上結(jié)果提示腸道菌群在CAHD血脂調(diào)節(jié)中有重要作用。

王玲等[19]用熒光定量聚含酶鏈反應(yīng)測(cè)定進(jìn)行菌群分析，結(jié)果顯示，CAHD組雙歧桿菌及乳酸桿菌明顯減少，而大腸桿菌、幽門螺桿菌、鏈球菌則明顯增加，腸道細(xì)菌總負(fù)荷明顯增加。關(guān)于CAHD受試者尿酸與腸道菌群相關(guān)性的研究顯示，隨著CAHD受試者血UA水平的升高，腸道大腸埃希菌、幽門螺旋桿菌等腸道機(jī)會(huì)致病菌也隨之增加，而雙歧桿菌、乳酸桿菌水平卻下降[20]。熊文等[21]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌與雙歧桿菌在小鼠腸道各段的定植數(shù)與血液及消化液中尿素氮、肌酐和UA均呈明顯負(fù)相關(guān)。本研究檢測(cè)結(jié)果顯示，2組受試者血UA水平與腸道雙歧桿菌目、乳酸桿菌屬細(xì)菌豐度均呈負(fù)相關(guān)，與埃希氏菌屬細(xì)菌豐度呈正相關(guān)，與以上研究相一致，提示CAHD受試者腸道細(xì)菌與血UA水平有關(guān)。

綜上所述，CAHD受試者與對(duì)照組的腸道菌群豐度在門、綱、目、科、屬、種水平存在一定差異；腸道菌群與CAHD受試者血脂、血UA水平存在明顯的相關(guān)性。腸道菌群有可能成為預(yù)防及治療CAHD的新靶點(diǎn)，臨床或可通過調(diào)節(jié)腸道菌群來(lái)控制血脂、血UA水平，進(jìn)而控制CAHD的發(fā)生、發(fā)展。